CC BY
67
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2008 Биология Вып. 9(25)
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
ВЛИЯНИЕ ЭСТРАДИОЛА НА ФАГОЦИТАРНУЮ И ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ И НЕЙТРОФИЛОВ
С. В. Ширшева,ь, Е. М. Куклинаа, У. С. Гудинаь
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Исследовано влияние эстрадиола (Е2 ) на фагоцитарную и окислительную активность моноцитов и нейтрофилов в дозах, сопоставимых с концентрацией гормона в I и III триместрах беременности. Показано, что только низкая доза гормона (1нг/мл) угнетает фагоцитарную активность ней-трофилов, тогда как фагоцитарную активность моноцитов подавляют и низкая, и высокая дозы.
Е2 также угнетает спонтанную окислительную активность нейтрофилов вне зависимости от дозы и не действует на зимозан-стимулированную. Гормон не влияет на спонтанную хемилюминес-ценцию и подавляет стимулированную окислительную активность моноцитов в концентрации, соответствующей содержанию гормона в крови в I триместре беременности (1 нг/мл), в течение всего времени стимуляции.
Введение
Во время беременности в организме женщины происходят важные изменения, направленные на сохранение и развитие плода. Большую роль в этих изменениях играют репродуктивные гормоны, в том числе и эстра-диол (Е2), которые способствуют нормальному протеканию беременности.
Е2 считается «главным эстрогенным гормоном животного организма». Этот женский половой гормон образуется в яичниках, а также в плаценте. Некоторое количество Е2 синтезируется интерстициальными клетками семенников (Розен, 1984).
Е2 стимулирует становление вторичных женских половых признаков. Полагают, что эстрогены оказывают еще и сенсибилизирующее действие в отношении влияния других гормонов на органы размножения. Специфические рецепторы (ERa) для Е2 обнаружены в цитозоле селезенки, тимоцитах, в стро-мальных клетках тимуса. По своей структуре, физико-химическим свойствам и авидности эти рецепторы гомологичны гормонсвязывающим рецепторам органов репродукции ^ШеАе, Gillette, 1994).
Рецепторы к Е2 также были найдены на нейтро-филах и моноцитах (Wensten et а1.,1986). Поскольку эти клетки являются основными эффекторами неспецифических иммунных реакций, а Е2 в комбинации с другими гормонами помогает настроить иммунную систему для успешного развития зародыша
(Ширшев, 2002), важно знать иммуномодулирующее влияние Е2 на моноциты и нейтрофилы.
Целью данной работы было исследование модулирующего влияния Е2 в дозах, соответствующих их уровню в крови в I и III триместрах беременности, на фагоцитарную и окислительную активность моноцитов и нейтрофилов женщин in vitro.
Материалы и методы исследования
Объекты исследования
В работе использовали фракционированные лейкоциты периферической крови (моноциты и нейтро-филы) небеременных женщин репродуктивного возраста.
Г ормоны и другие биологически активные
вещества
В эксперименте использовали Е2 («Sigma», США) в физиологических концентрациях, соответствующих их уровню в периферической крови I и III триместрах беременности - 1.0 и 10 нг/мл соответственно (Ширшев, 2002). Для стимуляции клеток прменяли зимозан (0.5 мг/мл), опсонизированный пулом сывороток. Для проведения люминолзависи-мой хемилюминесценции использовали люминол («Sigma», США) в концентрации 5х10-4М.
© С. В. Ширшев, Е. М. Куклина, У. С. Гудина, 2008
96
Выделение и культивирование клеток
Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК) и нейтрофилы выделяли из гепаринизиро-ванной (25 МЕ/мл) венозной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-верографина («Pharmacia», Швеция; «Спофа», Чехия) с плотностью верхнего и нижнего градиентов 1.077 и 1.112 г/мл соответственно. С верхней интерфазы собирали МНК, с нижней - нейтрофилы. Затем из МНК путем адгезии выделяли моноциты двумя пассажами с чашек Петри («anumbra», Куба). Чистота выделения для моноцитов составляла 78-85% (по оценке моноклональных антител к CD14 (ICN Ph, США)), для нейтрофилов - 95% (гистологическая оценка).
После выделения клетки (5х106/мл) инкубировали с гормоном в полной питательной среде на основе среды 199 (НПО «Биомед», Россия) с добавлением 0.01 М Hepes («Serva», Германия), 300 мкг/мл L-глутамина («Serva», Германия), 100 мкг/мл гента-мицина («Pharmacia», Швеция), 5% эмбриональной телячьей сыворотки («Serva», Германия) в течение 6 часов при 37°С и 5% СО2. После этого определяли их фагоцитарную и окислительную активности. Контрольные культуры клеток инкубировали с растворителем гормона (NaCl 0,9%) при аналогичных условиях. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью витального красителя (5% эозин), она составляла 95-97%.
Оценка фагоцитоза
Фагоцитарная активность оценивалась по степени гашения биолюминесценции культуры люминесцентных бактерий генно-инженерного штамма E.coli Lum+ со спонтанным свечением (Патент 2292553 от 27.01.2007).
Готовую суспензию бактерий (180 мкл) в рабочей концентрации 5х106 /мл вносили в лунки 96-луночного планшета, инкубировали при 37°С в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения; затем, после внесения клеточной культуры в соотношении 1:10, измерялась степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин с интервалом в 10 мин. При этом происходило полное поглощение E. coli Lum+ фагоцитирующими клетками. Измерение производилось на люминоскане «Ascent» (Финляндия). Для анализа результатов рассчитывался индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с его долей в исходном уровне, по формуле
Х1 - Х2
ИФА = ----------х 100,
Xi
где Х1 - интенсивность биолюминесценции контрольной пробы в относительных единицах (RLU);
Х2 - интенсивность биолюминесценции опытной пробы в относительных единицах (RLU).
Исследование люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ)
Окислительную активность оценивали по интенсивности ЛЗХЛ клеточной культуры (Dahigren, Stendahl, 1984). Для этого в планшет вносили 180 мкл раствора Хенкса без фенолового красного («Биолот», Россия), содержащего люминол (5х10-4М). После инкубации в течение 3-5 мин при 37°С и замера фонового свечения добавляли 20 мкл клеточной суспензии (5х106 /мл) и при непрерывном перемешивании измеряли интенсивность спонтанной хемилюминесценции для оценки исходного уровня окислительного метаболизма клеток. Затем в кювету вносили 20 мкл зимозана (0.5 мг/мл), опсонизиро-ванного пулом сывороток, и фиксировали интенсивность стимулированной хемилюминесценции в течение 50 мин с интервалом в 10 мин. Измерения производились также на люминоскане «Ascent» (Финляндия) в относительных единицах (RLU).
При статистической обработке результатов вычислялись средняя арифметическая величина и ее стандартная ошибка. Достоверность различий между средними величинами оценивалась с помощью парного t - критерия Стьюдента, достоверными считались данные при р < 0.05.
Результаты исследований и их обсуждение
На первом этапе исследований оценивалась фагоцитарная активность нейтрофилов и моноцитов по степени гашения биолюминесценции.
Установлено, что доза Е2, соответствующая его уровню в крови в I триместре беременности, на 10-й мин инкубации достоверно угнетала фагоцитарную активность нейтрофилов, тогда как концентрация в 10 нг/мл не оказывала влияния на протяжении всего времени инкубации (рис. 1).
100 п 90 -80 -и па
И 70 -'бО -¿0 -н 00 -
В
£ 30 -? 20-и ю -о -
Иш^бация^Е. C^9Lum+^*!niH.
Рис. 1. Изменение индекса фагоцитарной активности нейтрофилов
Примечание: здесь и далее * - р < 0.05 в сопоставлении с контролем
98
С. В. Ширшев, Е. М. Куклина, У. С. Гудина
При изучении влияния гормона на фагоцитарную активность моноцитов было установлено, что как угнетение низкой дозой Е2, соответствующей её уровню в крови в I триместр беременности, так и ингибирование в концентрации, соответствующей её уровню в III триместр происходило также на 10-й минуте инкубации (рис. 2).
<
©
£
о
[3
я
о
сЗ
Л
н
о
о
к
m
Я
о
К
(U
н
окислительную активность клеток выявлено не было (рис. 4).
Инкубация с Б.соН Lum , мин.
Рис. 2. Изменение индекса фагоцитарной активности моноцитов
Таким образом, на фагоцитарную активность Б2 оказывал кратковременное угнетающее действие, что, по-видимому, связано с негеномным механизмом реализации гормональных эффектов.
На втором этапе исследования изучалось влияние Б2 на окислительную активность нейтрофилов и моноцитов с помощью реакции ЛЗХЛ.
Как видно из рис. 3, Б2 угнетает спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов вне зависимости от исследуемой дозы.
Гормональное воздействие
Рис. 3. Влияние Б2 на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофи-лов
При оценке зимозанстимулированной ЛЗХЛ ней-трофилов статистически достоверного влияния Б2 на
Р
ь-|
PR
Ч
X
со
Ч
А
Н
О
О
К
и
К
о
К
Щ
н
К
К
Продолжительность стимуляции, мин.
Рис. 4. Влияние Б2 на динамику зимозан-стимулированной ЛЗХЛ нейтрофилов
Аналогичные исследования проводились и на моноцитах. При этом выявлено, что Б2 не оказывал статистически значимого влияния на спонтанную ЛЗХЛ моноцитов (рис. 5).
ь-1
ч
X
со
ч
н
к
К
0,02
0,015
0,01
0,005
Контр.
Гормональное воздействие
Е2 (1 нг/мл) Е2 (10 нг/м л)
Рис. 5. Влияние Е2 на спонтанную ЛЗХЛ моноцитов
Однако при активации моноцитов опсонизиро-ванным зимозаном интенсивность ЛЗХЛ достоверно угнеталась низкой дозой Е2, соответствующей ему в крови женщин в I триместр беременности, на всем протяжении эксперимента (рис. 6).
Таким образом, Е2 в дозе 1.0 нг/мл, соответствующей его уровню в I триместре беременности, угнетает фагоцитарную активность как нейтрофилов, так и моноцитов, а в дозе 10 нг/мл, соответствующей его уровню в III триместре, подавляет фагоцитарную активность только моноцитов.
Спонтанная ЛЗХЛ нейтрофилов угнеталась обеими дозами Е2, которые не оказывали влияния на моноциты, в то время как зимозан-стимулированная ЛЗХЛ моноцитов подавлялась концентрацией Е2,
0
соответствующей его уровню в I триместре, а ней-трофилы были рефрактерны к ингибирующему действию гормона.
Продолжительность стимуляции,
Рис. 6. Влияние на динамику зимозан-стимулированной ЛЗХЛ моноцитов
Таким образом, Е2 эффективно модулирует активность моноцитов и нейтрофилов, оказывая, как правило, угнетающее действие, что, по-видимому, может приводить к снижению функциональной активности фагоцитов в крови женщин во время беременности. В то же время гормон избирательно угнетает спонтанные окислительные процессы нейтро-филов, что ограничивает их участие в ремоделировании тканей при росте плода. Активность моноцитов регулируется прямо противоположно. Е2 угнетает ее при стимуляции, тем самым осуществляется защита плода от аборта, который может быть вы-
зван активацией моноцитов при внутриутробной
инфекции.
Библиографический список
Пат. 2292553 Российская Федерация, МПК 7 G01N33/53. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. / Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Никитина Н.М., Некрасова И.В. - заявитель и патентообладатель Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (RU), Ширшев С.В. (RU) - № 2005118124/15; заявл. 10.06.05; опубл. 27.01.07, Бюл. № 3.
Розен, В.Б. Основы эндокринологии: учеб. пособие / В.Б. Розен. М.: Высш. шк., 1984. 336 с.
Ширшев, С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции: в 2 т. / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2002.
Dahigren, C. Myeloperoxidase modulates the phagocytic activity of polymorphonuclear neutrophil leukocytes. Studies with cells from a myeloperoxidase deficient patient / C. Dahigren, O. Stendahl // J. Clin. Invest. 1984. Vol. 73. P. 366-373.
Gillette, S. Changes in thymic oestrogen receptor expression following orchidectomy / S. Gillette, R.W. Gillette // Cell Immunol. 1979. Vol. 42. P. 194196.
Wensten, J.J.A.M. Presence of oestrogen receptors in human blood mononuclear cells and thymocytes / J.J.A.M. Wensten, M.A. Blankenstein, F.H.G. Gmeling-Meyling [et al.] // Acta Endocrinol. 1986. Vol. 112. P. 409-414.
Поступила в редакцию 24.04.2008
The effect of the estradiol on phagocytic and oxidative activity of neutrophils and monocytes
S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, U.S. Gudina
In the course of experimental work we have investigated the effect of human estradiol in dose comparable with concentration of the hormone in I and III trimester of pregnancy on phagocytic and oxidative activity of neutrophils and monocytes. . It was shown that both dose of hormone renders the supressive action in monocyte phagocytic activity, but this effect in neutrophils renders only low hormonal dose. Also, the hormone supresses spontaneous oxidative activity of neutrophils, and does not influence on oxidative activity of zymozan-induced neutrophils. However only low dose of the hormone was shown to suppress the oxidative activity of zymozan-induced monocytes.
