ВЛИЯНИЕ РТУТИ НА ГИДРОЛИЗ УГЛЕВОДОВ В КИШЕЧНИКЕ БУРОЗУБОК Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 599.323.41/113.4+574.64

Влияние ртути на гидролиз углеводов в кишечнике бурозубок

Голованова И.Л., Пенькова Г.А., Степина Е.С., Филиппов А.А., Комов В.Т.

Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН. Борок, Ярославская обл.

Исследовано влияние накопленной в организме ртути на активность гликози-даз (а-амилаза, сахараза, мальтазы, ами-лолитическая активность) in vitro в слизистой оболочке и содержимом кишечника бурозубки обыкновенной. Показано большее накопление ртути в мышцах, печени и кишечнике особей, обитающих на более влажных биотопах. Активность гликозидаз химуса с ростом содержа-

Введение. Ртуть занимает одно из ведущих мест среди тяжелых металлов, оказывающих токсическое воздействие на живые организмы. Масштабы ее антропогенной эмиссии в атмосферу очень велики и соизмеримы с количествами, участвующими в природном глобальном цикле. В середине прошлого века органические соединения ртути широко использовались в качестве фунгицидов для протравливания посевного зерна, что привело к значительному загрязнению почвы и растений. Мелкие млекопитающие способны накапливать ртуть в организме, у некоторых видов ее содержание в органах и тканях напрямую зависит от концентрации металла в почве [2], что позволяет использовать их в качестве биоиндикаторов для обнаружения локальных загрязнений.

Бактериальные процессы приводят к биотрансформации неорганических солей ртути в органические метилртутные соединения, которые хорошо растворимы в жирах и легко проникают через биологические мембраны. Соединения ртути поражают нервную систему, вызывают изменения в почках, печени и крови, нарушают двигательную и секреторную функцию желудочно-кишечного тракта [6]. Они влияют на активность многих мембранных ферментов [1, 3], однако действие накопленной в организме ртути на пищеварительные ферменты млекопитающих практически не изучено.

Цель работы состояла в изучение влияния накопленной в организме ртути на активность гликозидаз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике бурозубок различных экологических групп.

Материал и методы исследования. Объект исследования - бурозубка обыкновенная Sorex araneus L., представитель мелких насекомоядных млекопитающих, которые благо-

ния ртути изменялась более значительно, чем ферментов слизистой оболочки. Исследование кинетических характеристик гидролиза дисаха-ридов выявило повышение сродства ферментов к субстрату, свидетельствующее об адаптивных изменениях этого показателя с ростом накопления ртути в кишечнике.

Ключевые слова: ртуть, накопление, бурозубки, пищеварительные гликозидазы.

даря высокой скорости метаболизма и короткому жизненному циклу являются удобным объектом для изучения накопления и биохимических эффектов действия ртути. Животные добыты с помощью ловушек осенью 2008-2009 гг. на разных биотопах Череповецкого р-на Вологодской обл. и Рдейского государственного заповедника Новгородской обл. Исследовано 94 экз. особей обоего пола. После отлова животных в течение 12 ч доставляли в лабораторию и проводили биологический анализ.

Для определения in vitro ферментативной активности у животных изымали кишечник и освобождали его от содержимого (химуса). Слизистую оболочку средней части кишечника снимали пластмассовым скребком и взвешивали. Химус средней части кишечника также взвешивали. При помощи стеклянного гомогенизатора готовили индивидуальные гомогенаты слизистой оболочки кишечника и химуса с добавлением охлажденного до 2-4°С раствора Рингера для теплокровных животных (152.3 мМ NaCl, 5.7 мМ KCl, 26 мМ CaCl2, 1.79 мМ NaHCO3, рН 7.4) в соотношении 1:9. Затем исходный гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера в 2-10 раз. Растворы субстратов (растворимый крахмал в концентрации 1 и 18 г/л, растворы мальтозы и сахарозы в концентрации 50 ммоль/л) готовили на таком же растворе Рингера. Инкубацию гомогената и субстрата проводили в течение 30-60 мин при температуре 20°С, рН 7.4.

Определяли активность пищеварительных гликозидаз: а-амилазы КФ 3.2.1.1 (метод Смита и Роя), мальтазы КФ 3.2.1.20 (глюкозооксидазный метод Городецкого) и сахаразы КФ 3.2.1.48 (метод Нельсона), а также амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал: а-амилазы, глюкоа-

милазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы (метод Нельсона) [5]. Активность ферментов определяли в 5 повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/г х мин), активность а-амилазы - в единицах гидролизованного субстрата мг/ (г-мин). Кинетические характеристики гидролиза углеводов: значения константы Михаэ-лиса (Km) и максимальной скорости реакции (Vmax) определяли графическим методом Лайнуивера-Берка. Определение ртути в тканях животных проводили атомно-абсорбци-онным методом с использованием анализатора ртути РА-915. Результаты представлены в виде средних значений и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA, LSD тест), р < 0.05.

Результаты и обсуждение. У бурозубок (ср. масса 7.33 г) из трех биотопов Череповецкого района Вологодской обл. содержание ртути в

слизистой оболочке кишечника достоверно различалось (р < 0.05) и составляло 0.01±0.003 (сухой луг, 10 экз.), 0.015±0.005 (берег реки, 7 экз.) и 0.02±0.003 мг/кг сырой массы (мокрый луг, 13 экз.). Содержание ртути в мышцах (0.05, 0.06, 0.07 мг/кг сухой массы) и печени (0.06, 0.11, 0.10 мг/кг сухой массы) у бурозубок из указанных биотопов коррелировало с содержанием металла в кишечнике. У особей с большим содержанием ртути в слизистой оболочке кишечника отмечено повышение амилолитической активности на 15-40% и снижение активности сахаразы на 74% (р < 0.05), активность а-амилазы достоверно не изменялась. Кт гидролиза сахарозы достоверно снижалась на 47% у бурозубок из биотопа Берег реки, что свидетельствует об адаптивном увеличении сродства ферментов к субстрату с ростом накопления ртути.

У бурозубок из аналогичных биотопов в окрестностях г. Череповец при близкой массе тела установлено более высокое содержание

Таблица 1

Активность гликозидаз в кишечнике бурозубки обыкновенной с различным накоплением ртути, Вологодская обл. округ г. Череповец.

Показатель Биотоп

Сухой луг Берег реки Мокрый луг

Масса тела, г 6.85 ± 0.48- 7.30 ± 0.63- 7.23 ± 0.39-

Содержание мг/кг сухой массы мышц 0.03 ± 0.00- 0.10 ± 0.00« 0.06 ± 0.00"

Содержание мг/кг сухой массы печени 0.02 ± 0.00- 0.22 ± 0.00б 0.14 ± 0.04е

Слизистая оболочка кишечника

Содержание Hg, мг/кг сырой массы 0.07 ± 0.03- 0.17 ± 0.02б 0.23 ± 0.06е

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 13.2 ± 0.79- 13.5 ± 0.79- 12.2 ± 0.97-

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.07 ± 0.02- 0.12 ± 0.02- 0.17 ± 0.04-

Активность Ot-амилазы, мг/(гмин) 45.0 ± 4.09- 47.6 ± 5.13- 28.7 ± 3.45б

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 15.1 ± 1.57- 16.5 ± 1.84- 17.4 ± 2.13-

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.39 ± 0.05- 0.35 ± 0.03- 0.38 ± 0.08-

Активность Ot-амилазы, мг/(гмин) 45.3 ± 3.92- 61.3 ± 8.01- 48.9 ± 4.91-

Количество экз. 7 6 9

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: М ± т - среднее значение показателя и его ошибка; разные надстрочные индексы указывают на статистически значимые отличия между показателями в строке, р < 0,05.

ртути в организме (табл. 1). В слизистой оболочке кишечника с ростом содержания ртути отмечено лишь достоверное снижение активности а-амилазы на 36%. Активность карбо-гидраз в кишечном химусе у особей с различных биотопов достоверно не различалась.

Таким образом, у бурозубок, обитающих на более влажных биотопах Вологодской обл., показано большее накопление ртути в мышцах, печени и кишечнике, которое сопровождается изменениями активности карбоги-драз и сродства ферментов к субстрату.

У бурозубки с луговых биотопов (злако-во-разнотравный луг) Рдейского заповедника выделено три группы с различным содержанием ртути в слизистой оболочке кишечника (табл. 2). Содержание ртути в химусе и слизистой оболочке положительно коррелировало с увеличением ее содержания в мышцах и

печени. Активность исследованных гликози-даз у животных исследуемых выборок в большинстве случаев не различалась. Кт гидролиза мальтозы снижалась на 30-37%, отражая увеличение фермент-субстратного сродства и адаптивные изменения этого показателя с ростом содержания ртути. В кишечном химусе при большем содержании ртути показано повышение амилолитической активности и активности мальтазы на 10-21%, активность сахаразы повышалась более значительно (на 93-225%).

У бурозубки обыкновенной из лесных биотопов Рдейского заповедника выделено 4 группы с различным содержанием ртути в слизистой оболочке кишечника (табл. 3). Содержание ртути у бурозубок из более влажных биотопов леса выше, чем у особей со злаково-разнотравного луга. Увеличение

Таблица2

Показатель Группа по содержанию Hg в слизистой

1 2 3

Масса тела, г 7.02±0.09а 6.75±0.40а 6.99±0.18а

Содержание мг/кг сухой массы мышц 0.07±0.01а 0.11±0.01а 0.12±0.03а

Содержание мг/кг сухой массы печени 0.06±0.01а 0.09±0.02а 0.11±0.03а

Слизистая оболочка кишечника

Содержание мг/кг сырой массы 0.02±0.001а 0.04±0.003б 0.08±0.005в

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 2.31±0.05а 2.27±0.04а 2.22±0.00а

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.11±0.00а 0.12±0.00а 0.13±0.00'

Активность мальтазы, мкмоль/(гмин) 1.38±0.10а 1.44±0.03а 1.52±0.06а

Кт гидролиза мальтозы, тМ 6.40±0.44а 4.05±0.21б 4.46±0.21б

Утах гидролиза мальтозы, мкмоль/(г-мин) 1.71±0.08а 1.68±0.01б 1.79±0.04в

Содержание мг/кг сырой массы 0.02±0.002а 0.04±0.006б 0.06±0.006в

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 4.58±0.05а 4.53±0.05а 5.56±0.00б

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.12±0.005а 0.24±0.01б 0.40±0.01в

Активность мальтазы, мкмоль/(гмин) 10.1±0.27а 9.44±0.01' 11.1±0.18в

Количество экз. 6 12 8

Активность гликозидаз в кишечнике бурозубки обыкновенной с различным накоплением

ртути из Рдейского заповедника, биотоп луг.

содержания ртути в кишечнике сопровождалось повышением её содержания в мышцах и печени. Однако достоверных изменений ами-лолитической активности с ростом содержания ртути не выявлено. Активность сахаразы достоверно увеличивалась на 26% в группе с максимальным содержанием ртути, активность мальтазы - на 8 % (р < 0.05). В то же время значения Кт гидролиза мальтозы снижались на 28% с ростом содержания ртути в слизистой оболочке, отражая адаптивное повышение сродства ферментов к субстрату.

Активность ферментов химуса с ростом содержания ртути изменялась более значительно. Амилолитическая активность увеличивалась на 16-134%, активность сахаразы -на 16-36%, активность мальтазы - на 24% по сравнению с группой особей с наименьшим содержанием ртути. Различия в величине и направленности эффектов ртути в слизистой

оболочке и в химусе кишечника могут быть обусловлены тем, что в слизистой оболочке функционируют преимущественно мембранные ферменты консумента, в то время как активность гликозидаз химуса отражает не только активность панкреатических ферментов консумента, но и активность тканевых ферментов жертвы и энтеральной микробиоты.

Механизм токсического действия ртути связан с ее взаимодействием с сульфгидриль-ными группами белков. Блокируя их, ртуть изменяет свойства или инактивирует ряд жизненно важных ферментов. Наиболее токсичны органические соединения ртути, в состав которых входит метиловая группа. Поступая в организм с водой и пищей, метилртуть мигрирует по пищевым цепям, как в водной, так и в наземно-воздушной среде, вызывая специфические отравления и заболевания у человека и животных. Она изменяет показа-

Таблица3

Активность гликозидаз в кишечнике бурозубки обыкновенной с различным накоплением

ртути из Рдейского заповедника, биотоп лес.

Показатель Группа по содержанию Hg в слизистой

1 2 3 4

Масса тела, г 7.35 ± 0.09- 6.88 ± 0.20- 7.20 ± 0.50-« 8.20 ± 0.61«

Содержание Hg, мг/кг сухой массы мышц 0.09 ± 0.01- 0.15 ± 0.03" 0.16 ± 0.05-« 0.28 ± 0.02«

Содержание Hg, мг/кг сухой массы печени 0.10 ± 0.02- 0.16 ± 0.03- 0.22 ± 0.13- 0.23 ± 0.04-

Слизистая оболочка кишечника

Содержание мг/кг сырой массы 0.03 ± 0.002- 0.05 ± 0.001« 0.07 ± 0.001" 0.14 ± 0.01'

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 2.35 ± 0.00- 2.34 ± 0.00- 2.36 ± 0.00- 2.35 ± 0.00-

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.13 ± 0.003- 0.12 ± 0.002- 0.12 ± 0.001- 0.16 ± 0.007«

Активность мальтазы, мкмоль/(гмин) 1.49 ± 0.01- 1.50 ± 0.03- 1.60 ± 0.02« 1.61 ± 0.01«

Кт гидролиза мальтозы, ммоль 6.08 ± 0.45- - 4.33 ± 0.27«

Утах гидролиза мальтозы, мкмоль/(г-мин) 1.81 ± 0.04- - 1.82 ± 0.04-

Содержание мг/кг сырой массы 0.02 ± 0.001- 0.06 ± 0.003- 0.05 ± 0.02- 0.09 ± 0.02«

Амилолитическая активность, мкмоль/(гмин) 2.64 ± 0.03- 3.07 ± 0.01« 4.00 ± 0.01" 6.19 ± 0.10-

Активность сахаразы, мкмоль/(гмин) 0.13 ± 0.00- 0.18 ± 0.01« 0.16 ± 0.00" 0.17 ± 0.00"

Активность мальтазы, мкмоль/(гмин) 8.78± 0.27- 8.00 ± 0.14- 10,9± 0.14« 8.0 ± 0.14-

Количество экз. 2 6 3 4

Примечание. -- данные отсутствуют.

тели белкового, липидного и углеводного обменов, вызывает некротические изменения в клетках слизистой оболочки пищеварительного тракта рыб, а также ингибирует активность ряда пищеварительных ферментов [1, 3]. При действии ртути у млекопитающих выявлены изменения активности антиокси-дантных ферментов в печени и почках [7], а также изменения активности аргиназы и ми-тоген-активируемой протеинкиназы [8, 9]. В малых количествах ртуть может оказывать положительное влияние: регулировать активность лейкоцитов и повышать иммунологическую устойчивость организма [4]. В нашей работе при низких уровнях накопления ртути у бурозубки обыкновенной также показано увеличение активности пищеварительных гликозидаз, повышающее скорость гидролиза углеводов.

Заключение. При изучении бурозубок из различных биотопов Вологодской и Новгородской области (сухой луг, мокрый луг, берег реки, лес) показано большее накопление ртути в мышцах, печени и кишечнике особей, обитающих в более влажных условиях, что может быть обусловлено большей интенсивностью процессов бактериального метилирования на сырых биотопах. Содержание ртути

в тканях кишечника, как правило, положительно коррелировало с содержанием ртути в печени и мышцах. При этом накопление ртути в организме сопровождалось разнонаправленными изменениями активности панкреатических и собственно мембранных ферментов, гидролизующих углеводные компоненты пищи в кишечнике бурозубок. Активность гликозидаз в слизистой оболочке кишечника, как правило, снижалась лишь при самых высоких концентрациях ртути, негативно влияя на скорость гидролиза углеводных компонентов пищи. Незначительное повышение содержания ртути приводило к достоверному повышению активности карбогидраз. Активность ферментов химуса, отражающая не только активность панкреатических ферментов кон-сумента, но и активность тканевых ферментов жертвы и энтеральной микробиоты, с ростом содержания ртути изменялась в большей степени по сравнению с ферментами слизистой оболочки кишечника. При исследовании кинетических характеристик гидролиза дисахаридов мальтозы и сахарозы выявлено повышение сродства ферментов к субстрату, свидетельствующее об адаптивных изменениях этого показателя с ростом накопления ртути в кишечнике.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Голованова И.Л. Влияние тяжелых металлов на физиолого-биохимический статус рыб и водных беспозвоночных // Биология внутр. вод.- 2008. - № 1. - С. 99 108.

2. Комов В.Т., Гремячих В.А., Сапельников С.Ф., Удоденко Ю.Г Содержание ртути в почвах и мелких млекопитающих различных биотопов Воронежского заповедника // Ртуть в биосфере: эколо-

on the hepatocytes from Hoplias malabaricus // Toxicol. in Vitro.- 2008.- Vol. 22.- № 7. - P. 1705 1713. 8. Kanada Hironori, Kikushima Makoto, Homma-Takeda Shino et al. Downregulation of arginase II and renal apoptosis by inorganic mercury: Overexpression of arginase II reduces its apoptosis // Arch. Toxicol. - 2008.-Vol. 82.- № 2.- C. 67-73.

го-геохимические аспекты. Матер. Межд. симп. М.: ГЕОХИ РАН. 2010.С. 281 286. 9. Kim Sang Hyun, Bark Hyun, Choi Cheol Hee. Mercury induces multidrug resistance-associated protein

3. Немова Н.Н. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб. М.: Наука, 2005. 164 с. gene through p38 mitogen-activated protein kinase // Toxicol. Lett.- 2005.-Vol.155.- № 1.- Р. 143 150.

4. Соколов О.А., Черников В.А., Лукин С.В. Атлас распределения тяжелых металлов в объектах 10. окружающей среды. Белгород: Константа, 2008. 188 с.

5. Уголев А.М., Иезуитова Н.Н., Масевич Ц.Г и др. Исследование пищеварительного аппарата у человека. Обзор современных методов. Л.: Наука, 1969. 216 с.

6. Boguszewska A., Pasternak K. Mercury - influence on biochemical processes of the human organism // Ann. UMCS. D. - 2004.- V 54. - № 2.- P. 524-527.

7. Filipak Neto F., Zanata S.M., Silva de Assis H.C. et al. Toxic effects of DDT and methyl mercury

Golovanova I.L., Penkova G.A., Stepina Ye.S., Fillipov A.A., Komov V.T. Impact of mercury on hydrolysis of hydrocarbons in common shrew intestine

I.D.Papanin Institute for Biology of Inland Waters

The impact of the mercury accumulation in the organism on the activity of glycosidasas (a-amylase, succharase, maltase, amylolytic activity) was investigated in vitro in the mucous membrane and intestinal content of the common shrew. A larger accumulation of mercury was shown in muscles, liver and intestine of specimens inhabiting poachy bio bogs. The activity of .glycosidasas in chyme changed more substantially with the increase of mercury content than the enzymes activity in the mucous membrane. Kinetic characteristics of disaccharides hydrolysis showed an increasing binding affinity of enzymes to the substrate which testifies adaptive changes of this indicator with the growth of mercury accumulation in the intestine.

Материал поступил в редакцию 07.12.2010 г.