CC BY
36
что люди обладают одинаковым состоянием здоровья, если у них одинаковый общий показатель. Сравнение можно проводить только по показателю отдельных факторов.
Так же можно утверждать о определенной зависимости К от L. Для человека со 100-бальным уровнем здоровья зрения К может быть равен нулю, что невозможно, так как человек не может ощущать дискомфорт от несуществующих у него проблем.
Можно утверждать, что чем больше ухудшается уровень здоровья по признаку, тем меньше будет К для этого фактора, однако эта зависимость не прямолинейна.
Список литературы:
1. Математическое моделирование в управлении здоровьем населения / Под ред. А.М. Алленова, В.С. Казанцева // Врач и информационные технологии. - 2011. - № 6. - С. 62-67.
2. Оценка уровня здоровья. Элективный курс / Под ред. С.А. Егорова. -Ставрополь, 2010.
3. Методика комплексной оценки физического развития и физической подготовленности / Б.Х. Ланда. - М.: Советский спорт, 2004. - 192 с.
ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ МЕВАЛОНАТНОГО МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ И ЯДЕРНЫХ
ГОРМОНАЛЬНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ИММУНОФЕНОТИП МАКРОФАГОВ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ОТВЕТЕ1
© Щварц Я.Ш.*, Долганова О.М.
НИИ терапии и профилактической медицины СО РАМН, г. Новосибирск
Целью настоящей работы была оценка влияния модуляторов активности мевалонатного метаболического пути и агонистов ядерных рецепторов LXR и RXR на иммунофенотип макрофагов. Исследовали влияние холестерина (ХС), оксистеролов, 9-цис-ретиноевой кислоты (РК), фарне-зола, аторвастатина (АС) и мевалоновой кислоты на липополисаха-рид(ЛПС)-индуцированную продукцию ФНО-а, NO, ИЛ-10 и ТФР-Р1 в первичной культуре перитонеальных макрофагов. Установлено, что макрофаги преинкубированные с ХС, 25-гидрокси-ХС (25-ОН-ХС) или АС снижают ЛПС-индуцированную продукцию ФНО-а, а добавление
1 Работа поддержана грантом РФФИ № 12-04-01151-а.
* И.о. заведующего лабораторией Молекулярно-клеточных механизмов терапевтических заболеваний, доктор медицинских наук.
в среду инкубации мевалоната отменяет эффекты АС и ХС. Показано, что, аналогично ФНО-а, АС, ХС, РК и 25-ОН-ХС ингибируют генерацию N0, а мевалонат или фарнезол отменяют ингибирующее действие АС и ХС, но не лигандов LXR и RXR. Было продемонстрировано, что преинкубация макрофагов с ХС, 25-ОН-ХС, 7-кето-ХС и АС существенно снижает продукцию ИЛ-10 ЛПС-стимулированными макрофагами, фарнезол не оказывает влияния, а мевалонат отменяет эффект ХС и АС. При добавлении в среду инкубации ХС и АС продукция ТФР-Р1 существенно возрастает по сравнению с контрольными макрофагами, 25-ОН-ХС и фарнезол достоверно снижают эту продукцию, а добавление в среду инкубации мевалоната отменяет эффект 25-ОН-ХС и фар-незола. В ЛПС-стимулированных макрофагах фарнезол увеличивал, а ХС, 7-кето-ХС и АС снижали продукцию ТФР-Р1. На основании полученных данных сделаны выводы, что 1. агонисты ядерных рецепторов 25-ОН-ХС и РК, а также ХС и АС индуцируют формирование антивоспалительного фенотипа макрофага и, кроме того, 2. ХС, аналогично АС, индуцирует формирование антивоспалительного и фиброгенного фенотипа макрофага за счет ингибирования активности мевалонатного метаболического пути и образования дефицита промежуточных прени-лирующих соединений.
Ключевые слова макрофаг, холестерин, цитокины, мевалоновая кислота.
Макрофаги представляют собой гетерогенную популяцию клеток, вовлеченных в хронические воспалительные процессы, такие как атерогенез, хроническая эндотоксемия и др. Известно, что макрофаги способны приобретать различные морфо-функциональные фенотипы: от биоцидно-деструк-тивного до репаративно-фиброзного. Выделяют следующие основные фенотипы: макрофаги М1 типа, продуцирующие провоспалительные цитокины, такие как ФНО-а и ИЛ-1Р, оксид азота (N0); макрофаги М2 типа, продуцирующие противовоспалительные цитокины - ИЛ-10 и ТФР-Р1, и др. Течение и завершение воспалительных процессов критически зависит от приобретенных фенотипов макрофагов.
Хроническое воспаление, как правило, ассоциируется с гиперхолесте-ринемией. Показано, что холестерин (ХС) и его окисленные производные (ОС) накапливаются в тканях при хроническом воспалении [1, 2], атеро-склеротических бляшках [3]. Как было показано ранее [4], ХС и ОС снижают продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-Р1 в макрофагах. При этом влияние стеролов на продукцию провоспалительных цитоки-нов, а также участие ХС и ОС на поляризацию макрофагов в основном неизвестны.
Формирование фенотипа макрофага может происходить под влиянием ХС и / или ОС, образующихся при воспалении. В тоже время ОС являются агонистами X рецепторов печени (LXR), оказывая влияние через LXR-зави-симые и LXR-независимые механизмы. Известно, ХС и ОС способны инги-
бировать активность ключевого фермента мевалонатного пути - 3-гидрок-си-3-метил-глютарил-КоА редуктазу (ГМГ-КоА редуктаза) [5, 6]. Роль активности мевалонатного метаболического пути при действии ХС, ОС и аго-нистов LXR на поляризацию макрофагов до сих пор не ясна.
Целью настоящей работы было изучить влияния ХС, ОС и лигандов LXR на липополисахарид (ЛПС) - стимулированную продукцию ФНО-а, ИЛ-10 и ТФР-Р1, NO в первичной культуре перитонеальных макрофагов, и оценить зависимость этой продукции от активности мевалонатного пути.
Материалы и методы исследования: Перитонеальные макрофаги получали у мышей-самцов линии C57B1/6, находившихся в условиях вивария на стандартной лабораторной диете со свободным доступом к воде и пище на 4 сутки после внутрибрюшинным введения 4 % гидратированного 1,4-а-гликана и культивировали при 37 °С, 5 % СО2 и 100 % влажности в количестве 250 тыс/лунку в 24-луночных планшетах в бессывороточной среде RPMI1640, содержащей 2мМ HEPES и смесь антибиотиков для культивирования клеток. Для решения поставленной задачи полученные монослои макрофагов преинкубировали 4 час с ХС (5 мкг/мл), 7-кето-ХС (5 мкг/мл), 25-гидрокси-ХС (5 мкг/мл, 25-ОН-ХС), фарнезолом (10мкМ), 9-цис-ретиноевой кислотой (РК) (5мкМ) или аторвастатином (АС) - ингибитором активности ГМГ-КоА редуктазы (5 мкМ/мл) в присутствии или отсутствии мевалоновой кислоты (1 мМ). Затем в некоторые из них добавляли ЛПС E. coli 0111:B4, инкубировали и через 24 часа определяли в инкубационной среде концентрацию ФНО-а, ИЛ-10 и ТФР-pi методом твердофазного ИФА с помощью наборов реагентов фирмы Biosource согласно инструкции производителя. Оценивали продукцию NO по содержанию нитритов, концентрацию которых подсчитывали, используя в качестве стандартной калибровочной кривой последовательные разведения 1 мМ раствора нитрита натрия в среде RPMI1640 (2-250 мкМ). Эксперименты проводили в трех независимых повторах в трипликатах. Статистическую обработку проводили с использованием /-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение: При исследовании провоспалительного ци-токина ФНО-а показано, что стимуляция макрофагов ЛПС приводила к увеличению в среде инкубации концентрации ФНО-а в 6,9 раз. Преинкубация макрофагов с ХС, 7-кето-ХС, 25-OH^Q фарнезолом или АС не влияла на базовый уровень продукции ФНО-а. Добавление в среду инкубации мева-лоната совместно со стеролами, фарнезолом или АС незначительно снижало продукцию ФНО-а. Преинкубация макрофагов с ХС, 25Ю^ХС или АС вызывала значительное ингибирование ЛПС-стимулированной продукции ФНО-а в 1,5, 4,7 и 5,1 раз соответственно, при этом фарнезол и 7-кето-ХС значимого влияния оказывали. Добавление мевалоната отменяло ингибирующий эффект ХС и АС, восстанавливая реактивность макрофагов на ЛПС, и не изменяло ингибирующего эффекта 25-OH-ХС.
Снижение ЛПС-стимулирующей продукции ФНО-а опосредованное ХС или АС говорит о состоянии гипореактивности макрофагов, восстановление которой происходит при добавлении мевалоната. Очевидно, что ХС-индуцированное снижение реактивности макрофагов связано с дефицитом промежуточных продуктов мевалонатного метаболического пути, связанное с ингибированием ГМГ-КоА редуктазы. Неспособность мевалоната восстанавливать реактивность макрофагов при добавлении в среду инкубации 25-ОН-ХС, свидетельствует, что гидроксистерол-обусловленная гипореактив-ность макрофагов зависит не столько от ингибирования ГМГ-КоА редуктазы, сколько от LXR-связанном подавлении активности генов, ответственных за воспалительный ответ. Отсутствие эффекта фарнезола или 7-кето-ХС на ЛПС-индуцированную продукцию ФНО-а можно объяснить неспособностью этих компонентов ингибировать ГМГ-КоА редуктазу и неспособностью 7-ке-то-ХС связываться с LXR.
При оценке ЛПС-стимулированной генерации NO - классического медиатора, по которому судят о поляризации макрофагов, было установлено, что, аналогично ФНО-а, АС, ХС, РК и 25-ОН-ХС ингибируют его продукцию, а мевалонат и фарнезол отменяет ингибирующее действие АС и ХС, но не лигандов LXR и RXR. Следовательно, толерогенное действие статина и ХС индуцировано down-регуляцией мевалонатного пути со снижением пула пренилирующих соединений, а 25-ОН-ХС и РК-индуцированная гипо-реактивность, обусловлена прямым воздействием на LXR и RXR. Возможно, сходство между ЛПС-стимулированной генерацией NO и продукцией ФНО-а при действии модуляторов активности мевалонатного пути и агони-стов ядерных рецепторов обусловлено аутокринной ФНО-а-стимуляцией продукцией NO.
Инкубации макрофагов с ХС, 7-кето-ХС, 25Ю^ХС, фарнезолом или АС вызывала незначительное изменение продукции ИЛ-10, добавление ме-валоната к этим компонентам также не оказывало эффекта. Стимуляция макрофагов ЛПС приводила к увеличению продукции ИЛ-10 макрофагов в 1,7 раза. Несмотря на то, что ИЛ-10 - противовоспалительный цитокин, характерный для фенотипа М2 фенотипа макрофага, экспрессия гена ИЛ-10 стимулируется ИНФ-Р и зависит от TLR4-TRIF-TRAM сигналирования [7], поэтому стимуляция макрофагов ЛПС может вызывать увеличение продукцию ИЛ-10, что подтверждается нашими данными.
Добавление в среду инкубации стимулированных макрофагов ХС, 7-ке-то-ХС или АС достоверно снижало продукцию ИЛ-10 в 1,3, 1,4 и 1,2 раза соответственно, тогда как фарнезол не оказывал эффекта. Мевалонат отменял ингибирующий эффект ХС и АС, при этом в культуре с АС восстановление продукции ИЛ-10 происходило контрольных значений, а в случае с преинкубацией с 7-кето-ХС эффект был минимален. Инкубация с 25Ю^ХС полностью подавляла ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-10, аналогич-
но ФНО-а, эффект которого не отменялся мевалонатом. Наблюдаемый эффект 25-0H-ХС позволяет сделать вывод, что LXR-индуцированная гипоре-активность Мф, подавляет продукцию как про-, так и антивоспалительных цитокинов. Одной из важных причин ХС-индуцированной гипореактивно-сти макрофагов, ведущей к низкой способности отвечать на ЛПС продукцией ИЛ-10, аналогично ФНО-а, является ингибирование ГМГ-КоА редукта-зы, поскольку мевалонат значительно уменьшает толерогенный эффект ХС. Неспособность мевалоната влиять на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-10 в обработанных фарнезолом макрофагах показывает, что участие мевалонатного пути в толерогенезе обусловлено фарнезил-зависимыми механизмами.
При исследовании ТФР-Р1 обнаружено относительно высокое содержание ТФР-Р1 в элиситированных макрофагах. Полученные результаты согласуются с литературными данными, где показано увеличение продукции ТФР-Р1 в ответ на введение элиситирующего агента [8]. При добавлении в среду инкубации ХС или АС продукция ТФР-Р1 возрастала на 24 % и 13,9 % соответственно по сравнению с контрольными макрофагами. Добавление мева-лоната отменяло эффект ХС и АС, при этом продукция ТФР-Р1 была значительно ниже, чем в контрольных макрофагах. Стимуляция контрольных или преинкубированных с 25Ю&ХС макрофагов ЛПС незначительно повышала уровень ТФР-Р1, в то время как фарнезол приводил к увеличению данного цитокина. Напротив, предварительная инкубация макрофагов с ХС, 7-ке-то-ХС или АС вызывала снижение ответа на ЛПС. Добавление мевалоната в культуру с ХС, 7-кето-ХС или АС приводила к снижению ЛПС-индуциро-ванной продукции ТФР-Р1, по сравнению с не стимулированными макрофагами. В контрольных макрофагах, и в преинкубированных с 25Ю^ХС или фарнезолом, при добавлении мевалоната наблюдалось незначительное повышение ЛПС-индуцированной продукции ТФР-Р1 макрофагами.
Т.о. ХС вызывает формирование фенотипа макрофага с пониженной способностью продуцировать ФНО-а и ИЛ-10, и с повышенным потенциалом для продуцирования TGF-P1, тогда как мевалонат предотвращают формирование этого фенотипа. Так как экзогенный ХС и мевалонат увеличивают внутриклеточный уровень ХС, их противоположные эффекты на продукцию цитокинов являются доказательством того, что формирование ХС-индуциро-ванного фенотипа макрофага зависит от дефицита промежуточных продуктов мевалонатного пути. Принимая во внимание ингибирование сквален синтазы в макрофагах при воспалении [9, 10] промежуточными продуктами являются, очевидно, нестерольные изопреноиды. Поскольку мавалонат неспособен изменить эффекты фарнезола на продукцию цитокинов, можно предположить, что фарнезол - один из таких промежуточных звеньев. В то же время главные механизмы, лежащие в основе эффектов гидроксистеролов, кажется, не зависят от ингибирования ГМГ-КоА редуктазы.
Т.о., гиперхолестеринемия, связанная с воспалительными процессами, может быть вовлечена в формирование подобного M2 фенотипа макрофагов. Связь, установленная между макрофагальным фенотипом и дефицитом промежуточных звеньев мевалонатного пути, позволяет искать новые подходы фармакологического коррекции реактивности макрофага при различных воспалительных заболеваниях.
Список литературы:
1. Шварц Я.Ш., Душкин М.И., Комарова Н.И. Холестерининдуцирован-ная стимуляция поствоспалительного гепатофиброза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145, № 6. - С. 638-641.
2. Poli G, Biasi F., Leonarduzzi G Oxysterols in the pathogenesis of major chronic diseases // Redox Biology. - 2013. - Vol. 1, № 1. - Р. 125-130.
3. Hansson G.K., Robertson A.K., Soderberg-Nauclér C. Inflammation and atherosclerosis // Annual Review of Pathology. - 2006. - Vol. 1. - Р. 297-329.
4. Душкин М.И., Верещагин Е.И., Гребенщиков А.И. Эффект оксисте-ринов на экспрессию генов воспалительных цитокинов и их уровень в макрофагах, толерантных к эндотоксину // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 127. - № 1. - С. 71.
5. Sadamatsu K., Shimokawa H., Tashiro H. Different effects of simvastatin and losartan on cytokine levels in coronary artery disease // American Journal of Cardiovascular Drugs. - 2006. - Vol. 6, № 3. - Р. 169-175.
6. Porreca E., Di Febbo C., Baccante G Increased transforming growth factor-beta^) circulating levels and production in human monocytes after 3-hydro-xy-3-methyl-glutaryl-coenzyme a reductase inhibition with pravastatin // Journal of the American College of Cardiology. - 2002. - Vol. 39, № 11. - Р. 1752-1757.
7. Siegemund S., Sauer K. Balancing pro- and anti-inflammatory TLR4 signaling // Nature Immunology. - 2012. - Vol. 13, № 11. - Р. 1031-1033.
8. Huynh M.L., Fadok VA., Henson P.M. Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic cells promotes TGF-beta1 secretion and the resolution of inflammation // Journal of Clinical Investigation. - 2002. - Vol. 109, № 1. - Р. 41-50.
9. Khovidhunkit W., Kim M.S., Memon R.A. Effects of infection and inflammation on lipid and lipoprotein metabolism // Journal of Lipid Research. - 2004. -Vol. 45. - № 7. - Р. 1169-1196.
10. Memon R.A., Shechter I., Moser A.H. Endotoxin, TNF and IL-1 decrease hepatic squalene synthase activity, protein and mRNA levels // Journal of Lipid Research. - 1997. - Vol. 38, № 8. - Р. 1620-1629.
