CC BY
47
Г.М. Элбакидзе 1, А.Г. Меденцев2, А.Г. Элбакидзе1
1 Медико-биологический центр Ассоциации содействия международному центру научной культуры — «Всемирная
лаборатория», Москва, Российская Федерация 2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область,
Российская Федерация
Влияние продигиозанзависимого комутона на устойчивость митохондрий печени к повреждению протонофором
Эффектор тканевого стресса гепатоцитов — продигиозанзависимый комутон (ПЗК) — вызывает деэнергизацию митохондрий печени, предварительно нагруженных ионами Са2+. При этом наблюдается снижение мембранного потенциала (МП) и выход ионов Са2+ из матрикса по циклоспорин А-чувствительному механизму мегапоры. В условиях блокирования мегапоры циклоспорином А протонофор ¥ССР вызывает снижение МП и выход ионов Са2+ по циклоспориннечувствительному механизму. Показано, что ПЗК повышает устойчивость митохондрий к действию упомянутого протонофора, вызывая ингибирование этих эффектов. Ингибирующее действие ПЗК осуществляется по К+- и НАДН-зависимому механизму. Протекторное действие распространяется не на весь пул митохондрий в таких клетках, а только в отношении митохондрий, сохранивших высокую интактность, и при условии, что в них не активирован механизм мегапоры. Кроме того, представленные в настоящей статье результаты свидетельствуют о том, что в определенных условиях ПЗК может оказывать протекторное действие и посредством усиления энергопродукции в поврежденных митохондриях. Ключевые слова: тканевый стресс, комутон, кальций, мегапора, протонофор. (Вестник РАМН. 2014; 1-2: 75-79)
75
Введение
#
Ранее было показано, что активация клеток Купфера введением эндотоксина продигиозана вызывает накопление в печени эффектора тканевого стресса гепатоци-тов комутона [1]. Механизм действия этого регулятора на митохондрии малоизучен. Показано, что продигиозан-зависимый комутон (ПЗК), выделенный из печени крысы и охарактеризованный как термостабильное соединение с молекулярной массой 617 Да [2], оказывает тканеспе-
цифическое деэнергизующее влияние на митохондрии из гомологичной ткани, предварительно нагруженные ионами Са2+ [3]. Оно выражается как в стимуляции быстрого выброса упомянутых ионов из матрикса митохондрий, так и в ускорении их медленного выхода [4]. Нельзя исключать, что оба эффекта ПЗК реализуются по одному механизму, а именно путем активации им мегапоры (неселективной поры) во внутренней мембране митохондрий, и отличаются лишь по своей интенсивности. В связи с этим было необходимо исследовать действие
1, A.G. Medentsev2, A.G. Elbakidze1
1 Association for World Laboratory, Biomedical Centre, Moscow, Russian Federation 2 G.K. Skryabin's Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, RAS, Puschino, Moscow district, Russian
Federation
Influence of Prodigiozan-Dependent Comuton on the Resistance of Liver Mitochondria Against Damage by Protonofor
An effector of tissue stress of hepatocytes, prodigiozan-dependent comuton (PDC), provokes deenergiezation of liver mitochondria, preloaded by Ca2+ ions. In this case a decrease of membrane potential (MP) and Ca2+ efflux by cyclosporine A sensitive mechanism of megapore is observed. If megapore is blocked by cyclosporin A, protonofor FCCP provoked decrease of MP and Ca2+ efflux by cyclosporin A-insensitive mechanism. It is shown that PDC increases resistance of mitochondria to mentioned protonofor action by inhibition of both these effects. An inhibitory action of PDC is realized by K+ and NADH-dependent mechanism. The effector of hepatocyte tissue stress, prodigiozan-dependent comuton (PDC), evokes deenergizing liver mitochondria preloaded with Ca2+, both membrane potential (MP) decrease and Ca2+ release in according to cyclosporine A- sensitive mechanism of megapore being observed. If megapore is blocked by cyclosporin A, protonophore FCCP reduces of MP and Ca2+ release in according to cyclosporin A-insensitive mechanism. PDC is shown to increase the resistance of mitochondria against protonophore action mentioned above by means of inhibition of both these effects. Inhibitory action of PDC is realized due to both K+ and NADH-dependent mechanism. protective effect takes place only in intact mitochondria of these cells providig (on condition that) its megapore mechanism is not activated. Moreover, the results obttained are evidence of PDC can function as protector due to intensification of energy generation in damaged. Key words: tissue stress, comuton, calcium, megapore, protonophore.
(Vestnik Rossiiskoi Akademii Meditsinskikh Nauk — Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2014; 1—2: 75—79)
G.M. Elbakidze
ВЕСТНИК РАМН /2014/ № 1-2
Рис. 1. Влияние циклоспорина А на МП (а) и выход ионов Са2+ (Ь) из митохондрий печени, индуцированный добавлением ПЗК. Примечание. Добавки в среду: МХ — митохондрии печени, 1,8 мг белка/мл, ЦсА — 5 мкМ циклоспорина А, Са2+ — 130 нг-моль СаС12/1 мг белка, продигиозанзависимый комутон (ПЗК) — 5,5 мкг/мг белка. МП — мембранный потенциал.
ПЗК на митохондрии печени в условиях блокирования 76 мегапоры циклоспорином А с учетом того, что ПЗК обладает гепатопротекторным действием на гепатоциты [2, 5].
Цель исследования: изучить влияние комутона на устойчивость таких интегральных показателей физиологического состояния митохондрий, как метаболизм ионов Са2+ и величина мембранного потенциала (МП) в условиях повреждения этих органелл протонофором FCCP
Материалы и методы
Материал для исследования
Эксперименты проводили на самцах беспородных белых крыс массой 200-230 г. Митохондриальную фракцию из печени крысы выделяли методом Шнейдера в модификации [6].
Методы исследования
Измерение транспорта ионов Са2+ и регистрацию величины МП митохондрий осуществляли синхронно, Са2+-селективным электродом фирмы «НИКО АНА-ЛИТ» [7] и ТФФ+-чувствительным электродом той же фирмы [8], соответственно. Суспензию митохондрий в процессе измерений инкубировали в открытой, тер-мостатируемой при 28 °С, ячейке объемом 1 мл при непрерывном перемешивании. Состав среды инкубации: 250 мМ сахарозы, 30 мМ КС1, 1 мМ КН2РО4, 10 мМ трис-буфера; рН 7,2. Изменения в составе среды инкубации митохондрий, равно как и добавки в эту среду, оговорены в подписях к рисункам. Величину дыхательного контроля по Чансу рассчитывали на основании измерений скоростей поглощения кислорода суспензией митохондрий печени в закрытой полярографической ячейке объемом 1 мл электродом Кларка при 28 °С. Состав среды инкубации: 280 мМ сахарозы, 3 мМ КН2РО4, 10 мМ трис-буфера; рН 7,5. В эту среду добавляли 2 мг белка митохондрий, затем 200 мкмоль аденозиндифосфата и проводили регистрацию поглощения кислорода вплоть до его полного исчерпания в ячейке. Концентрацию белка в митохон-дриальной фракции измеряли методом, описанным в [9]. В экспериментах использовали высокоочищенный ПЗК из печени крысы, гомогенный в процедурах высокоэф-
фективной жидкостной хроматографии. Использовали химические реактивы фирмы Sigma-Aldrich (США).
Статистическая обработка данных
При статистической обработке результатов рассчитывали ошибку генерального среднего.
Результаты
Как видно из рис. 1а, предварительно нагруженные ионами Са2+ митохондрии печени сохраняют интакт-ность, о чем свидетельствует стабильно высокая величина МП и удержание ими ионов Са2+ в матриксе в течение всего эксперимента. Между тем добавление ПЗК в среду измерения вызывает у этих митохондрий выраженное снижение МП (рис. 1 и 2а), которое сопровождается быстрым выходом ионов Са2+ из матрикса митохондрий в окружающее пространство (рис. 1 и 2Ь). Оба этих эффекта ПЗК блокировались при добавлении в среду измерения циклоспорина А перед введением ПЗК (рис. 1, 3а и 3Ь). Показано, что ПЗК не влияет на величину МП митохондрий печени, предварительно нагруженных ионами Са2+ в среде с циклоспорином А и рутениевым красным (РК) (рис. 1а и 2). При этом после добавления в среду измерения с циклоспорином А и ПЗК рутениевого красного наблюдается медленный выход ионов Са2+ из матрикса митохондрий (рис. 2 и 1Ь).
Исследование влияния ПЗК на устойчивость митохондрий к повреждению проводили на суспензии этих органелл, предварительно нагруженных ионами Са2+. Как известно, под влиянием FCCP митохондрии повреждаются. При этом наряду с падением МП происходит выход ионов Са2+ из матрикса в окружающее пространство по циклоспорин А-нечувствительному механизму [10]. Оба этих эффекта FCCP наблюдали и в нашем эксперименте (рис. 2а и 2Ь). Обнаружено, что добавление в среду измерения ПЗК в этих условиях не только полностью снимает эффект FССР в отношении МП (рис. 2 и 3а), но также блокирует быстрый выход ионов Са2+ из матрикса в окружающее пространство по циклоспорин А-нечувствительному механизму При этом ПЗК инициирует медленный выход ионов Са2+
Рис. 2. Влияние ПЗК на МП (а) и выход ионов Са2+ (Ь) из митохондрий печени после добавления 4 мкМ FCCP.
Примечание. Добавки в среду: то же, что на рис. 1, а также МХ — 1,4 мг белка, ЦсА — 2,2 мкМ циклоспорина А, РК — рутениевый красный, 2,4 нг, Са2+ — 130 нг-моль СаС12/1 мг белка, ПЗК — 7,0 мкг/мг белка.
77
Рис. 3. Влияние ионов К+ и №+ на эффект ПЗК в отношении МП и выхода ионов Са2+ у митохондрий печени, поврежденных добавлением 4 мкМ FCCP: а — влияние на МП митохондрий, Ь — влияние на метаболизм ионов Са2+. FCCP — протонофор. Примечание. Добавки в среду: то же, что на рис. 1 и 2, а также МХ — 1,5 мг белка/1 мл митохондрий печени, ЦсА — 2,1 мкМ циклоспорина А, РК — 2,6 нг, Са2+ — 140 нг-моль СаС12/1 мг белка, ПЗК — 6,8 мкг/мг белка.
из матрикса митохондрий, который сохраняется и после добавления в среду измерения FССР (рис. 2 и 3Ь).
На рис. 3 представлены результаты влияния замены ионов К+ на ионы №+ в среде измерения на эффекты ПЗК в отношение МП и выброса ионов Са2+ у поврежденных добавлением FССР митохондрий в присутствии циклоспорина А и РК. Как видно из рисунков, в среде измерения с ионами К+ циклоспорином А и РК вызываемые у митохондрий добавлением FССР быстрые процессы (снижение МП и выброс ионов Са2+ из матрикса; рис. 1а, 1Ь и 3) блокируются добавлением ПЗК (рис. 2а, 2Ь и 3). Между тем замена ионов К+ на ионы №+ в тех же условиях полностью снимает эти эффекты ПЗК (рис. 3а и 3Ь).
На рис. 4 представлены результаты экспериментов по исследованию влияния степени интактности митохондрий, поврежденных FССР, на эффекты ПЗК в отношение МП в среде измерения с циклоспорином А и РК. Из рисунка следует, что при окислении сукцината эффект блокирования снижения МП у поврежденных FССР митохондрий под действием ПЗК наблюдается у митохондрий с высоким дыхательным контролем (рис. 4А). У митохондрий с низким дыхательным контролем в тех же условиях ПЗК вызывает противоположный по знаку эффект, а именно: усиливает снижение МП, вызванное FССР (рис. 4В). Замена сукцината на р-оксибутират приводит к реставрации «нормализующего» эффекта ПЗК в отношении МП
ВЕСТНИК РАМН /2014/ № 1-2
1х10-7 М
-т-
1х10-6 М А В С
Рис. 4. Влияние степени интактности митохондрий печени и субстратов окисления на протекторный эффект ПЗК в отношении митохондрий печени при повреждении митохондрий под действием 1,6 мкМ FCCP.
Примечание. Ордината — концентрация ТФФ+ в среде инкубации (СИ). В СИ перед введением митохондрий (1,2 мг) добавлены: 1 мМ MgCI2, 1,3 мкг/мл олигомицина, 5 мкМ циклоспорина А. После введения митохондрий в СИ добавлено 130 нг-моль СаС12/1 мг белка Белые столбики — добавление ПЗК (5,2 мкг/мг) белка), заштрихованные — без ПЗК. А — мито-78 хондрии с ДК =3,0-3,2; В и С — митохондрии с ДК =1,5-1,3.
А и В — в СИ 5 мМ сукцината, С — в СИ с 2 мМ малоната добавлено 2,5 мМ р-оксибутирата.
и метаболизма ионов Са2+ у митохондрий с низким дыхательным контролем, поврежденных добавлением FССР (рис. 4С).
Обсуждение
Вызываемая ПЗК стимуляция быстрого выхода ионов Са2+ из предварительно нагруженных этими ионами митохондрий развивается на фоне снижения МП по циклоспорин А-чувствительному механизму (см. рис. 1). Эти данные свидетельствуют об активации мегапоры во внутренней мембране митохондрий. Чувствительность вызываемых ПЗК эффектов к циклоспорину А указывает на активацию им мега-поры. Эти результаты согласуются также с данными о способности ПЗК индуцировать такой характерный признак открытия мегапоры, как высокоамплитудное набухание митохондрий печени в присутствии ионов Са2+ [4]. Вызываемый ПЗК медленный выход ионов Са2+ в присутствии РК наблюдается в среде измерения с циклоспорином А. Таким образом, ПЗК обладает способностью стимулировать выход ионов Са2+ из матрикса митохондрий печени не только путем индукции мегапоры, но и при посредстве Са2+/Н+-обменного механизма.
В экспериментах по повреждению митохондрий в среде измерения с РК протонофором FССР вызывал нечувствительное к циклоспорину А быстрое снижение МП и выход ионов Са2+ из матрикса митохондрий. Выход ионов Са2+ в вышеописанных условиях не может быть объяснен обратимостью функционирования унипортера в результате падения МП ввиду присутствия в среде измерения РК [11]. В связи с этим можно предположить, что циклоспорин А-нечувствительная Са2+-проницаемость внутренней мембраны митохондрий индуцируется здесь по иному механизму: возможно, при участии митохон-
дриальной фосфолипазы А2 [12]. Была обнаружена способность ПЗК ингибировать оба эти эффекта FССР
Можно предположить, что обнаруженная способность ПЗК препятствовать снижению МП и выходу ионов Са2+ из матрикса митохондрий под действием FССР является результатом усиления энергопродукции в митохондриях этим регулятором. Такое объяснение согласуется с ранее полученными данными об усилении под действием ПЗК продукции восстановленных пиридиннуклеотидов в экспериментах с суспензией гепатоцитов [2]. Тот факт, что замена ионов К+ на ионы №+ снимает ингибиторное действие ПЗК на снижение МП и выход ионов Са2+ из матрикса митохондрий, поврежденных под действием FССР (см. рис. 3), свидетельствует, что эти эффекты ПЗК реализуются при участии К+-зависимого механизма. То обстоятельство, что при замене субстрата окисления с сукцината на р-оксибутират удается получить эффект ингибирования падения МП под действием FССР в присутствии ПЗК, может указывать на вклад никотинамида-дениндинуклеотида (НАДН) в его реализацию.
На основании полученных результатов можно сформулировать совокупность условий, необходимых для повышения устойчивости митохондрий к повреждению под влиянием ПЗК. К ним относятся «нагруженность» митохондрий ионами Са2+, высокая интактность этих органелл, а также «закрытое» состояние их мегапоры, несмотря на повышение протонной проницаемости у внутренней мембраны, вызванное повреждающим воздействием. В связи с этим можно полагать, что протекторное действие ПЗК может осуществляться в гепатоцитах, накапливающих ионы Са2+ в митохондриях в результате перегрузки физиологических функций этих клеток или вследствие их повреждения [14]. При этом протекторное действие распространяется не на весь пул митохондрий в таких клетках, а только в отношении митохондрий, сохранивших высокую интактность, и при условии, что в них не активирован механизм мегапоры.
Ранее было предложено объяснение механизма тканевого стресса, согласно которому протекторное действие его эффектора — комутона — осуществляется путем активации неспецифической реакции клеток на повреждение [12]. На основании данных, свидетельствующих о деэнергизующем действии ПЗК на гомологичные митохондрии [4], предполагалось, что протекторное действие этого внутритканевого регулятора обусловлено формированием в клетке второй фазы данной физиологической реакции [12], для которой характерно торможение клеточного метаболизма [13]. Между тем рассмотренные в настоящей статье результаты свидетельствуют о том, что в определенных условиях ПЗК может оказывать протекторное действие и посредством усиления энергопродукции в поврежденных митохондриях. Как известно, усиление метаболизма является признаком первой фазы неспецифической реакции клеток на повреждение [13], поэтому можно полагать, что протекторное действие ПЗК на гепатоциты может быть обусловлено также путем формирования этой фазы неспецифической реакции клеток на повреждение. В данных условиях можно было бы ожидать усиления в поврежденной клетке репаративных процессов механизмом тканевого стресса.
Заключение
Таким образом, эффектор тканевого стресса гепатоцитов, продигиозанзависимый комутон, вызывает деэнергизацию митохондрий печени, предваритель-
но нагруженных ионами Са2+. При этом наблюдается снижение мембранного потенциала и выход ионов Са2+ из матрикса по циклоспорин А-чувствительному механизму мегапоры. В условиях блокирования ме-гапоры циклоспорином А протонофор FCCP вызывает снижение МП и выход ионов Са2+ по цикло-
спориннечувствительному механизму. Показано, что ПЗК повышает устойчивость митохондрий к действию упомянутого протонофора, вызывая ингиби-рование этих эффектов. Ингибирующее действие ПЗК осуществляется по К+- и НАДН-зависимому механизму.
ЛИТЕРАТУРА
1. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе А.Г, Куликова Л.А. Исследование участия клеток Купфера в инициации процесса продигиозан-зависимого накопления комутона в печени крысы. Докл. АН. 2006; 407 (1): 119-123.
2. Elbakidze G.M., Elbakidze A.G. Tissue stress — the tissuespecific intratissue adaptation mechanism. VIII World Congr. of Int. Soc. for Adapt. Med., Abstract book. Moscow. 2006. P. 135-136.
3. Элбакидзе ГМ., Федоров В.П., Элбакидзе И.М. Индукция в- и у-состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени и почки крысы ионами кальция. Изв. АН СССР. Сер. биол. 1986; 3: 400-409.
4. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе А.Г., Меденцев А.Г. Исследование влияния продигиозанзависимого комутона на медленный выход ионов кальция из матрикса митохондрий различной тканевой и видовой принадлежности. Докл. АН СССР. 2011; 437 (6): 842-845.
5. Elbakidze G.M., Elbakidze A.G. Principles of tissue growth intratissue regulation, Collierville. USA: InstantPublisher. 2009. 163 p.
6. Мосолова И.М., Горская И.А., Шольц К.Ф., Котельни-кова А.В. В кн.: Методы современной биохимии. Под ред. В.Л. Кретовича. М.: Наука. 1975. С. 45-47.
7. Хавш Е. Ионо- и молекулярноселективные электроды в биологических системах. М.: Мир. 1988. 221 с.
8. Kamo N., Muratsugu M., Hongoh R., Kobatake Y. Membrane potential of mitochondria measured with electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J. Membr. Biol. 1979; 49: 105-121.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275.
10. Chinopoulos C., Starkov A. A., Fiskum G.J. Cyclosporin A-insen-sitive permeability transition in brain mitochondria: inhibition by 2-aminoethoxydiphenyl borate. Biol. Chem. 2003; 278 (30): 27382-27389.
11. Montero M., Alonso M.T., Albillos A., Garcia-Sancho J., Alvarez J. Mitochondrial Ca2+-induced Ca2+ release mediated by the Ca2+ uniporter. Mol. Biol. of the Cell. 2001; 12 (1): 63-71.
12. Halestrap A.P., McStay G.P., Clarke S.J. The permeability transition pore complex: another view. Biochimie. 2002; 84 (2-3): 153-166.
13. Элбакидзе ГМ., Элбакидзе А.Г Механизмы гиперметаболических состояний. Вестник РАМН. 2011; 7: 50-54.
79
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Элбакидзе Георгий Михайлович , доктор биологических наук, академик РАЕН, директор Медико-биологического центра Ассоциации содействия Всемирной лаборатории
Адрес: 129344, Москва, ул. Искры, д. 13, к. 1, кв. 40, тел.: (499) 198-72-28, e-mail: gmelbakidze@hotmail.com Меденцев Александр Григорьевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией Института физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Адрес: Московская область, Пущино, Институтская, д. 4, тел.: (4967) 31-86-43, e-mail: Medentsev-AG@rambler.ru Элбакидзе Андрей Георгиевич, младший научный сотрудник Медико-биологического центра Ассоциации содействия Всемирной лаборатории
Адрес: 129344, Москва, ул. Искры, д. 13, к. 1, кв. 40, тел.: (499) 198-72-28
