CC BY
28УДК 66.085.3/.5 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-4-20-26
ВЛИЯНИЕ ПРИЦЕЛЬНОГО ОБЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОНАМИ НА ГИСТОАРХИТЕКТОНИКУ
ПОЧЕК КРЫС ПОРОДЫ WISTAR В ДОЗЕ 8 ГР
Г.АДемяшкин, 12 кандидат медицинских наук, С.Н.Корякин, 1 кандидат биологических наук, Ю.Ю. Степанова 2, В.И. Щекин 2, П.В.Шегай,1 кандидат медицинских наук.
1ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии » Минздрава России.
249036, г. Обнинск, ул. Королева, д.4
2ФГАОУ ВО Первый Московский Государственный Университет им. И. М. Сеченова Минздрава России 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2 e-mail: dr.dga@mail.ru
Наряду с химиотерапией в лечении рака почки широко используются методы лучевой терапии. Почки являются радиочувствительнм органом, облучение которого дозой 5-10 Гр в одной фракции может привести к развитию лучевой нефропатии. Именно поэтому подбор оптимальных доз излучения и их корректировка для уменьшения токсичности данной терапии становится все более важной задачей современной радиобиологии. Целью исследования является морфологическая оценка почек после прицельного облучения электронами дозой 8 Гр (экспериментальное исследование). Крыс породы Wistar (n=20) однократно подвергали прицельному ионизирующему облучению на импульсном ускорителе электронов «NOVAC-11» дозой 8 Гр и через неделю оценивали патоморфологические изменения при помощи метода световой микроскопии. В образцах опытной группы дозой облучения электронами 8 Гр выявили уменьшение количества почечных телец и клубочков, расширение капсулы Боумэна, полнокровие кровеносных сосудов, признаки дегенеративных изменений эпителия канальцев нефрона с появлением интенсивных пикнотических ядер в проксимальных канальцах нефрона, а также отмечались выраженные фиброзные изменения. В паренхиме почек на фоне облучения электронами дозой 8 Гр прослеживаются прогрессирующие патоморфологические изменения гистоархитектоники, среди которых наиболее важным является развитие в тканях интерстициального фиброза.
фиброз.
Ключевые слова: облучение электронами, почки, лучевая нефропатия, тубулоинтерстициальный
Введение. На рак почки приходится 5% всех злокачественных новообразований среди мужчин, занимая 7-е место по распространенности и 3% среди женщин, занимая 10-е место по частоте возникновения онкологических заболеваний. Почечно-клеточная карцинома, которая наиболее часто развивается на фоне терминальной стадии почечной недостаточности, составляет 80% всех случаев рака почек и является наиболее распространенным подтипом. Оставшиеся 20% приходятся на другие подтипы рака почек с различными гистологическими, молекулярными и цитогенетическими профилями [1].
Одним из наиболее распространенных методов лечения онкологических заболеваний, наряду с применением химиотерапевтических препаратов, является лучевая терапия (ЛТ). В основе которой лежит ионизирующие излучения, вызывающие гибель опухолевых клеток, глав-ным образом, за счет повреждения
ДНК, что делает ЛТ полезным методом лечения опухолей [2]. Побочные эффекты ЛТ, включая рецидивы, вторичный рак и повреждение здоровых тканей, относятся к числу клинических проблем, с которыми чаще всего сталкиваются пациенты [3]. В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании уже имеющихся методов и разработки новых.
Хорошо известно, что почки одни из наиболее радиочувствительных органов, страдающих от побочных радиационных повреждений во время лечения. Частичное или полное облучение тела 5 - 10 Гр в одной фракции не является летальным, но может привести к нефропатии [4]. Данные литературы по влиянию лучевой терапии на функции почек свидетельствуют о клеточном повреждении всех компонентов почек, включая клубочки, кровеносные сосуды, эпителий канальцев нефрона и интерстициальные ткани. Среди них, наиболее выраженные морфологические изменения были зарегистрированы в
эндотелиальных клетках клубочков, отслоившихся от базальных мембран [5, 6]. Однако нарушения в работе почек при проведении ЛТ наблюдается как при лечении рака почки, так и при лечении опухолей другой локализации. Вторичные изменения при применении ЛТ развивались у пациентов с желудочно-кишечным или гинеекологическим раком, лимфомой и саркомой верхней части живота [7].
Поэтому подбор оптимальных доз излучения и их корректировка для уменьшения токсичности данной терапии становится все более важной задачей современной радиобиологии. Моделирование лучевого повреждения почек у лабораторных животных, и дальнейшая морфологическая оценка является одной из ключевых задач для подробного изучения данной проблемы и приобретает все большее значение в клинической практике с целью подбора оптимальных доз.
Цель исследования - морфологическая оценка почек после прицельного облучения электронами дозой 8 Гр (экспериментальное исследование).
Материалы и методы Животные для исследования in vivo. Самцов крыс Wistar (220±20 г; 9 -10 недель; n=30) содержали в виварии при контролируемой температуре (22°С) и световом периоде (12L:12D) со свободным доступом к воде и стандартному корму. Крысы были разделены на контрольную (n=10) и опытную (n=20) группы, которых подвергли однократному прицельному облучению электронами брюшно-тазового сегмента в проекции почек в дозе 8 Гр.
Все манипуляции осуществляли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ЕЭС, Страсбург, 1986) и Руководствам по проведению медико-биологических исследований по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS) и Правилам лабораторной практики и приказу Министерства здравоохранения РФ № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении правил лабораторной практики», а также одобрены Локальным этическим комитетом.
Облучение проводили в отделе радиации-онной биофизики МРНЦ им. А.Ф. Цыба на импульсном ускорителе электронов «NOVAC-11». Данная установка позволяет получить пучок электронов с энергиями 4, 6, 8, 10 МэВ; пучок возможно отколимировать до 0 30-100 мм с шагом по 10 мм; частоту бенчей в пучке можно регулировать от 1 до 24 Гц с шагом по 1 Гц.
Исходя из представленных требований, для облучения была выбрана энергия 10 МэВ и частота 9 Гц, размер поля - 0 100 мм. Данный выбор позволяет гарантированно провести облучение зоны интереса требуемой дозой. Согласно проведенным дозиметрическим исследованиям пучок электронов с такой энергией проникает на глубину не более 50 мм в водно-эквивалентном материале. Данный выбор позволяет гарантии-рованно провести облучение зоны интереса требуемой дозой, а поле 0 100 мм позволяет уменьшить паразитную дозу на соседние ткани.
Перед облучением крыс опытных групп седировали однократным введением кетамина (50 мг / кг, внутримышечно) и ксилазина (5 мг / кг, внутрибрюшинно). Анестезированных крыс помещали на предметный стол по одному, в положении лежа на спине, с расставленными в стороны лапами, таким образом, чтобы в зону облучения попадали семенники, а легкие и сердце оставались в зоне радиационной тени (рисунок 2). Тубус подводился к облучаемой области таким образом, чтобы его срез находился не выше двух миллиметров от кожи, а сам тубус был перпендикулярен плоскости кожи.
Выведение животных из эксперимента. Животных выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика. После плановой эвтаназии у крыс были изъяты почки согласно дизайну. При этом оценивали внешний вид; вес (абсолютный - в граммах и относительный - по отношению к массе тела, в %); размеры и состояние
паренхимы на разрезе. Сроки умерщвления: для всех групп через семь дней.
Морфологический блок. После извлечения оценивали внешний вид почек и состояние паренхимы на разрезе (кровенаполнение, воспалительные изменения, атрофия, и т. д.), взвешивали (вес в граммах и отношение веса семенников к весу тела) и измеряли. Затем нарезали параллельно сагиттальной плоскости каждые 2 мм, фиксировали в растворе нейтрального формалина, после проводки (аппарат гистологической проводки тканей, «Leica Biosystems», Германия) заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы (толщиной 3 мкм), депарафинировали, дегидратировали их и окрашивали гематоксилином Майера и эозином.
Количественную оценку интерстициального фиброза выполняли с применением компьютерной морфометрии на препаратах почки, окрашенных трихромом по Массону.
Морфологический анализ проводили в 10-ти случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении ><100 и ><400 в 4-х рандомных срезах с каждого образца, перемещая предметные стёкла с равными интервалами вдоль осей X и Y.
Оценку степени фиброзирования проводили в баллах, учитывая площадь и оптическую плот-
ность (окрашивания волокон по Массону) в относительных единицах: «0» - отсутствует; «1» - слабое (0 - 0,3; < 25%); «2» - умеренное (0,3 - 0,6; 25 -50%); «3» - сильное (0,6 - 0,9; 50 - 75%); «4» -выраженное (>0,9; >75%).
Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали при помощи компьютерной программы SPSS 12.0 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США) все данные представлены как M±m. Гипотезу нормальности распределения значений в выборках проверяли при помощи теста Колмогорова-Смирнова, после чего использовали t-тест Стьюдента для малых выборок, непараметрический U критерий Манна-Уитни и
точный критерий Фишера. Различия между выборками считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследований. Масса тела животных экспериментальной группы уменьшилась в среднем на 15% по сравнению с контрольной.
Вес и объем почек уменьшился в 1,5 и более раза после облучения электронами по сравнению с контрольной, что составляет в среднем 0,3% потери от общей массы тела (р<0,05)
При световой микроскопии срезов почек контрольной группы (интактные животные) наблююдали нормальную гистоархитектонику (рисунок 1).
Рисунок 1 - Сосудистый клубочек крысы контрольной группы; окраска - гематоксилином и эозином,
увелич. х400.
В почках группы после облучения электронами дозой 8 Гр по сравнению с контрольной наблюдали: уменьшение количества сосудистых клубочков, расширение капсулы Боумэна, полнокровие кровеносных сосудов с повышением индекса васкуляризации, а также признаки дистрофических изменений эпителия канальцев нефрона с появлением интенсивных пикнотических ядер в проксимальном отделе (рисунок. 2). На долю поврежденных клубочков приходилось до 1/6 части почки. В интер-стициальной ткани почек обнаружили зоны фиброза (рисунок. 3), разобщенность клеток macula
densa, а также периваскулярный и парагломе-рулярный отек. Настоящее экспериментальное исследование посвящено изучению морфологических изменений почек после воздействия прицельным облучением электронами дозой 8 Гр с энергией 10 МэВ.
Использование методов лучевой терапии в лечении как первичных, так и вторичных опухолей почки нередко приводят к функциональным нарушениям. В связи с чем, одной из главных задач современной радиотерапии является повышение безопасности облучения и минимизация побочных эффектов, развивающихся на
Гр | Gy scan увелич. | magn *200 увелич. | magn *400
Контрольная группа| control
8Гр | 8Gy
Рисунок 2 - Почки крыс контрольной и экспериментальной группы дозой облучения электронами 8
Гр; окраска - гематоксилином и эозином.
Рисунок 3 - Почка крысы дозой облучения электронами 8 Гр; окраска - трихром по Массону, увелич.
х200 - слева; увелич. ><400 - справа.
фоне лечения. Обнаруженные нами патоморфо-логические изменения, в целом находят отражение в последних исследованиях, связанных с другими видами обучения, несмотря на некоторые существенные различия. Так по данным литературы, при изучении влияния рентгеновского излучения на почки крыс дозой 6 Гр авторы наблюдали дегенеративные изменения эпителия канальцев нефрона, а также наличие атипичных клубочков и полнокровие кровеносных сосудов в интерстициальной ткани [8].
При облучении крыс той же дозой, но использовав гамма-лучи также отмечали дегенерацию выстилающего эпителия и полнокровие кровеносных сосудов [9].
Изменения гистоархитектоники при увеличении дозы облучения до 8 Гр при использовании гамма-излучения проявлялись гломеруло-
склерозом и интерстициальным нефритом [10]. Однако в некоторых работах, помимо вышеописанных изменений, отмечались массивные участки некроза, кистозная трансформация канальцев нефрона и наличие внутрика-нальцевых эозинофильных цилиндров альбумина [11, 12]. Однако после облучения электронами, используемого в нашей работе, эти изменения отсутствовали, что можно объяснить более «мягким» воздействием в отличие от гамма-облучения
Заключение: В паренхиме почек на фоне облучения электронами дозой 8 Гр, которую можно считать сублетальной, прослеживаются прогрессирующие патоморфологические изменения гистоархитектоники, среди которых одним из наиболее важных является развитие интерстициального фиброза.
Литература
1. Escudier B., Porta C., Schmidinger M., Rioux-Leclercq N., Bex A., Khoo V., Grünwald V., Gillessen S., Horwich A. ESMO Guidelines Committee. Renal cell carcinoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2019; 30(5):706-720. doi: 10.1093/annonc/mdz056.
2. Mehrvar S, la Cour MF, Medhora M, Camara AKS, Ranji M. Optical Metabolic Imaging for Assessment of Radiation-Induced Injury to Rat Kidney and Mitigation by Lisinopril. Ann Biomed Eng. 2019; 47(7):1564-1574. doi: 10.1007/s10439-019-02255-8.
3. Kim, D. Y., Lee, M., Kim, E. J."Involvement of Klotho, TNF-α and ADAMs in radiation-induced senescence of renal epithelial cells". Molecular Medicine Reports 2021; 23(1): 22. https://doi.org/10.3892/mmr.2020.11660
4. Ahmad A., Mitrofanova A., Bielawski J., Yang Y., Marples B., Fornoni A., Zeidan Y.H. Sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3b mediates radiation-induced damage of renal podocytes. FASEB J. 2017; 31(2):771-780. doi: 10.1096/fj.201600618R.
5. Abou Daher A, Francis M, Azzam P, Ahmad A, Eid AA, Fornoni A, Marples B, Zeidan YH. Modulation of radiation-induced damage of human glomerular endothelial cells by SMPDL3B. FASEB J. 2020; 34(6):7915-7926. doi: 10.1096/fj.201902179R.
6. Aratani S, Tagawa M, Nagasaka S, Sakai Y, Shimizu A, Tsuruoka S. Radiation-induced premature cellular senescence involved in glomerular diseases in rats. Sci Rep. 2018; 8(1):16812. doi: 10.1038/s41598-018-34893-8.
7. Baradaran-Ghahfarokhi, Milad Radiation-induced kidney injury. Journal of renal injury prevention 2012; 1,2:49-50. doi:10.12861/jrip.2012.17
8. Wegner, R. E., Abel, S., Vemana, G., Mao, S., Fuhrer, R. Utilization of Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy for Intact Renal Cell Carcinoma: Trends in Treatment and Predictors of Outcome. Advances in Radiation Oncology 2020; 5(1): 85-91. https://doi.org/10.1016/j.adro.2019.07.018
9. Abozaid, O. A. R., Moawed, F. S. M., Farrag, M. A., Abdel Aziz, A. A. A. 4-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-butanone modulates redox signal in gamma-irradiation-induced nephrotoxicity in rats. Free Radical Research 2017; 57(11-12): 943-953. https://doi.org/10.1080/10715762.2017.1395025
10. Karami, M., Asri-Rezaei, S., Dormanesh, B., Nazarizadeh, A. Comparative study of radioprotective effects of selenium nanoparticles and sodium selenite in irradiation-induced nephropathy of mice model. International Journal of Radiation Biology 2018; 94(\): 17-27. https://doi.org/10.1080/09553002.2018.1400709
11. Mohamed, M. A. E. H., Mohammed, H. S., Mostafa, S. A., Ibrahim, M. T. Protective effects of Saraca indica L. leaves extract (family Fabaceae) against gamma irradiation induced injury in the kidney of female albino rats. Environmental Toxicology 2020; 2021; 36: 506- 519. https://doi.org/10.1002/tox.23056
12. Abdel-Magied, N., Elkady, A. A. Possible curative role of curcumin and silymarin against nephrotoxicity induced by gamma-rays in rats. Experimental and Molecular Pathology 2019; 111: 104299. https://doi.Org/10.1016/j.yexmp.2019.104299
EFFECT OF AIMED IRRADIATION BY ELECTRONS ON HISTOARCHITECTONICS OF KIDNEYS OF
WISTAR RATS AT A DOSE OF 8 GR
G. A.Demyashkin 12, Candidate of Medical Sciences, S.N. Koryakin \ Candidate of Biological Sciences, Y.Y.Stepanova 2, V.I.Shchekin 2, P.V.Shegai Candidate of Medical Sciences.
'National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation.
249036, Obninsk, st. Koroleva, 4
2I. M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University).
119991, Moscow, st. Trubetskaya, 8, building 2 e-mail: dr.dga@mail.ru
Radiation therapy is widely used in the treatment of kidney cancer along with chemotherapy. The kidneys are a radiosensitive organ, irradiation of which with a dose of 5-10 Gy in one fraction can lead to the development of radiation nephropathy. That is why the selection of optimal doses of radiation and their adjustment to reduce the toxicity of this therapy is becoming an increasingly important task of modern radiobiology. The aim of the study is the morphological assessment of the kidneys after targeted electron irradiation with a dose of 8 Gy (experimental study). Wistar rats (n = 20) were once subjected to targeted ionizing irradiation on a pulsed electron accelerator "NOVAC-11" with a dose of 8 Gy, and a week later, pathomorphological changes were assessed using the method of light microscopy. In the samples of the experimental group with a dose of electron irradiation of 8 Gy, a decrease in the number of renal corpuscles and glomeruli, expansion of Bowman's capsule, plethora of blood vessels, signs of degenerative changes in the epithelium of the nephron tubules with the appearance of intense pycnotic nuclei in the proximal tubules of the nephron were revealed, and pronounced fibrotic changes were also noted. In the renal parenchyma, against the background of electron irradiation with a dose of 8 Gy, progressive pathomorphological changes in histoarchitectonics are traced, among which the most important is the development of interstitial fibrosis in the tissues.
Keywords: electron irradiation, kidney, radiation nephropathy, tubulointerstitial fibrosis.
References:
1. Escudier B., Porta C., Schmidinger M., Rioux-Leclercq N., Bex A., Khoo V., Grunwald V., Gillessen S., Horwich A. ESMO Guidelines Committee. Renal cell carcinoma: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2019; 30(5):706-720. doi: 10.1093/annonc/mdz056.
2. Mehrvar S, la Cour MF, Medhora M, Camara AKS, Ranji M. Optical Metabolic Imaging for Assessment of Radiation-Induced Injury to Rat Kidney and Mitigation by Lisinopril. Ann Biomed Eng. 2019; 47(7):1564-1574. doi: 10.1007/s10439-019-02255-8.
3. Kim, D. Y., Lee, M., Kim, E. J."Involvement of Klotho, TNF-α and ADAMs in radiation-induced senescence of renal epithelial cells". Molecular Medicine Reports 2021; 23(1): 22. https://doi.org/10.3892/mmr.2020.11660
4. Ahmad A., Mitrofanova A., Bielawski J., Yang Y., Marples B., Fornoni A., Zeidan Y.H. Sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3b mediates radiation-induced damage of renal podocytes. FASEB J. 2017;31(2):771-780. doi: 10.1096/fj.201600618R.
5. Abou Daher A, Francis M, Azzam P, Ahmad A, Eid AA, Fornoni A, Marples B, Zeidan YH. Modulation of radiation-induced damage of human glomerular endothelial cells by SMPDL3B. FASEB J. 2020; 34(6):7915-7926. doi: 10.1096/fj.201902179R.
6. Aratani S, Tagawa M, Nagasaka S, Sakai Y, Shimizu A, Tsuruoka S. Radiation-induced premature cellular senescence involved in glomerular diseases in rats. Sci Rep. 2018; 8(1):16812. doi: 10.1038/s41598-018-34893-8.
7. Baradaran-Ghahfarokhi, Milad Radiation-induced kidney injury. Journal of renal injury prevention 2012; 1,2:49-50. doi:10.12861/jrip.2012.17
8. Wegner, R. E., Abel, S., Vemana, G., Mao, S., Fuhrer, R. Utilization of Stereotactic Ablative Body Radiation Therapy for Intact Renal Cell Carcinoma: Trends in Treatment and Predictors of Outcome. Advances in Radiation Oncology 2020; 5(1): 85-91. https://doi.org/10.1016Zj.adro.2019.07.018
9. Abozaid, O. A. R., Moawed, F. S. M., Farrag, M. A., Abdel Aziz, A. A. A. 4-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-butanone modulates redox signal in gamma-irradiation-induced nephrotoxicity in rats. Free Radical Research 2017; 57(11-12): 943-953. https://doi.org/10.1080/10715762.2017.1395025
10. Karami, M., Asri-Rezaei, S., Dormanesh, B., Nazarizadeh, A. Comparative study of radioprotective effects of selenium nanoparticles and sodium selenite in irradiation-induced nephropathy of mice model. International Journal of Radiation Biology 2018; 94(\): 17-27. https://doi.org/10.1080/09553002.2018.1400709
11. Mohamed, M. A. E. H., Mohammed, H. S., Mostafa, S. A., Ibrahim, M. T. Protective effects of Saraca indica L. leaves extract (family Fabaceae) against gamma irradiation induced injury in the kidney of female albino rats. Environmental Toxicology 2020; 2021; 36: 506- 519. https://doi.org/10.1002/tox.23056
12. Abdel-Magied, N., Elkady, A. A. Possible curative role of curcumin and silymarin against nephrotoxicity induced by gamma-rays in rats. Experimental and Molecular Pathology 2019; 111: 104299. https://doi.org/10.1016/j.yexmp.2019.104299
