CC BY
25
Влияние природных комплексных соединений с гиполипидемической активностью на экспрессию факторов вирулентности бактерий
В. Ю. ГОТОВЦЕВА1, Н. Э. ГРАММАТИКОВА2, М. В. БИБИКОВА2, А. В. КАТЛИНСКИЙ3
1 Московский государственный университет инженерной экологии, Москва
2 Государственный научный центр антибиотиков, Москва
3 НПО «Микроген»
Influence of Natural Complex Compounds with Hipolipidemic Activity on Expression of Bacteria Virulence Factors
V. YU. GOTOVTSEVA, N. E. GRAMMATIKOVA, M. V. BIBIKOVA, A. V. KATLINSKY
Moscow State University of Environmental Engineering, Moscow National Research Centre of Antibiotics, Moscow Microgen Co., Moscow
Отобраны природные комплексные соединения с гиполипидемической активностью, оказывающие значительный ингиби-рующий эффект на экспрессию факторов вирулентности бактерий. Выявлены ингибирующие свойства отобранных соединений в отношении образования пиоцианина и протеазы, а также их влияние на механизм кворум сенсинга у Chromobacterium violacium.
Ключевые слова: кворум сенсинг, факторы вирулентности, Chromobacterium violacium, Pseudomonas aeruginosa.
Natural complex compounds with hipolipidemic activity, having considerable inhibitory effect on expression of bacteria virulence factors were isolated. Inhibitory properties of the compounds with respect to pyocyanine and protease formation, as well as their influence on the quorum sensing mechanism in Chromobacterium violacium were shown.
Key words: quorum sensing, virulence factors, Chromobacterium violacium, Pseudomonas aeruginosa.
Впервые возможность регуляции метаболизма клетками различных клонов бактерий быша описана Хохловым А. С. и Овчинниковым Ю. А. у ак-тиномицетов, продуцирующих стрептомицин. Был выделен А-фактор, наличие которого в среде культивирования регулирует образование воздушного мицелия, продукцию стрептомицина, резистентность к стрептомицину у Streptomyces %г1$ги$, установлена его структура (2-изо-каприло-ил-3-оксиметил-у-бутиролактон) [1].
Позднее, в 1994 году, было предложено понятие «кворум сенсинг» (08). Это восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения, что во многом позволяет рассматривать их как микробное сообщество. Взаимосвязь между клетками осуществляется посредством синтеза определённых молекул, которые выделяются в
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 105066, г. Москва, ул. Старая Басманная, д. 21/4. Московский государственный университет инженерной экологии
окружающую среду, сообщая клеткам об определённой плотности популяции и необходимости изменения метаболизма [2].
В дальнейшем было показано, что у многих бактерий система 08 контролирует различные физиологические процессы, включая биолюминесценцию, подвижность, синтез антибиотиков, образование биоплёнок, споруляцию, образование факторов вирулентности [3].
В связи с распространением возбудителей инфекционных заболеваний, устойчивых к большинству известных антибиотиков, возник большой интерес к развитию альтернативных подходов к лечению бактериальных инфекций. Перспективным является поиск и изучение природных ингибиторов системы 08. Предполагается, что воздействие на элементы 08 будет дополнительным способом борьбы со многими инфекционными заболеваниями человека и животных, позволяющим ингибировать факторы вирулентности патогенов без воздействия на их рост. Способность к образованию ингибиторов бактериальных аутоиндукторов бактерий описана
у некоторых бактерий, растений, грибов, а также у синтезированных аналогов аутоиндукторов [4, 5].
В работе была проведена оценка влияния ги-полипидемических соединений, продуцируемых актиномицетами, на экспрессию факторов вирулентности ряда бактерий.
На данный момент одной из наиболее изученных является система регуляции QS у бактерий Pseudomonas aeruginosa, вызывающих тяжёлые заболевания у людей с ослабленным иммунитетом. Патогенность P.aeruginosa обусловлена широким арсеналом факторов вирулентности. Одни из них ассоциированы с клеткой (пили, адгезины, липо-полисахариды), другие секретируются (протеазы, рамнолипиды, экзофермент S, экзотоксин А, пи-оцианин и т. д.). Проявление генов системы QS играет основную роль в вирулентности и патоген-ности P.aeruginosa. Мутанты, дефицитные по QS, вызывают менее серьёзные последствия в модельных опытах на инфицированных животных. В связи с этим P.aeruginosa является модельной культурой как для разработки молекулярно-гене-тических исследований системы QS, так и тест-оранизмом для проведения поисковых исследований ингибиторов этой системы [6].
Материал и методы
В работе использовали 16 штаммов актиномицетов, отобранных как продуценты гидрофобных соединений с гиполи-пидемическим действием, подавляющих включение 3Н-аце-тата в стиролы культуры клеток гепатоцитов Hep G2 и синтез эргостерола у грибных культур [7]. В опытах in vivo на кроликах с экспериментальной гиперхолестеринемией эти соединения снижали синтез холестерина, триглицеридов, содержание липопротеидов низкой плотности [8].
Тест-организмы были получены из коллекции культур ГНЦА: клинический изолят Pseudomonas aeruginosa 71, штамм Chromobacterium violacium CV02.
Питательные среды: Для поддержания актиномицетов использовали агаризованную среду Гаузе-1. В погружённых условиях культуры актиномицетов растили в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл со 100 мл среды М-1 [9], при 28°С в течение 5 суток на качалке с оборотами от 3,3 с-1 до 4,3 с-1. Образование исследуемыми штаммами актиномицетов ингибиторов QS (IQS) бактерий определяли в нативном растворе и в водном остатке ацетонового экстракта из мицелия, полученного после отделения растворителя на вакуум-выпарной установке (ИР-1). Образцы мицелиального экстракта хранили при 4—10°С.
Для культивирования бактерий использовали агар Сабуро, бульон Мюллера-Хинтон (МХБ), агаризованную среду Мюл-лера-Хинтон (МХА) — BioMerieux (Франция), среду Кинга.
Для экспериментов на ингибирование образования пио-цианина и протеазы использовали жидкую среду Кинга и голодный агар соответственно.
Ингибирование образования пигмента виолацеина. На поверхность застывшей агаризованной среды МХА наносили суспензию клеток штамма C.violaceum CV02 в титре 105 КОЕ/мл. Исследуемые нативные растворы и мицелиальные экстракты в количестве 100 мкл вносили в лунки, вырезанные в МХА. Активность экстрактов оценивали после 24—48 ч инкубации при 26°С по диаметру зон отсутствия пигментации вокруг лунок с экстрактами.
Ингибирование образования пиоцианина. В среду Кинга, содержащую суспензию P.aeruginosa 71 с титром 105 КОЕ/мл
вносили исследуемые вещества в максимальной концентрации 200 мкл/мл с последующим двукратным разведением до конечной концентрации 12,5 мкл/мл. Инкубировали при 37°С в течение 18—24 ч. Для выделения пиоцианина, в каждую пробирку вносили по 5 мл хлороформа и выдерживали 5 мин. После разделения фаз к нижнему слою добавляли по 1,5 мл 0,2N HCl, центрифугировали, отбирали кислотную фракцию и вносили по 100 мкл в 96-луночные планшеты. Интенсивность окраски экстракта (оптическую плотность) измеряли при длине волны 540 нм с помощью анализатора Labsystems Bioscreen. Уровень образования пиоцианина в экстрактах оценивали по изменению оптической плотности по отношению к интактному контролю, принятому за 100%.
Ингибирование образования протеазы. Использовали про-теазу С — сериновую протеазу (1 мг/мл), любезно предоставленную И. Н. Крестьяновой. Препарат контрикал (1 мг/мл) — как контрольный ингибитор.
В расплавленный голодный агар добавляли 30% цельного пастеризованного молока 1,5% жирности и разливали по 15 мл в чашки Петри (диаметр 90 мм). В лунки, вырезанные в агаре, вносили по 50 мкл раствора протеазы и по 25 мкл исследуемых нативных растворов и мицелиальных экстрактов, а также контрольный препарат контрикал. Чашки выдерживали в термостате при 37°С 24 часа. Активность оценивали по величине зон просветления агара вокруг лунок: чем меньше зона, тем лучше проходило ингибирование.
Результаты и обсуждение
Образование фиолетового пигмента виолацеина культурой C.violaceum CV02 регулируется синтезом ацил-гомосеринлактона (AHL) — сигнальной молекулы QS [10].
Была изучена способность исследуемых комплексных соединений с гиполипидемичес-кой активностью, продуцируемых актиномице-тами, ингибировать образование фиолетового пигмента виолацеина штаммом C.violaceum CV02 через 24—48 ч роста. Из 16 исследованных штаммов, способность к образованию ингибиторов бактериальных аутоиндукторов проявили 9 штаммов (56%), из которых у 6 штаммов активность установлена только в экстракте из мицелия, а у трёх штаммов — в нативном растворе и в мицелии (табл. 1).
Плотность роста в зоне отсутствия пигментации не отличалась от окрашенных участков газона. Ни один из изучаемых образцов не проявлял антибактериальной активности в отношении тест-культуры C.violaceum CV02, что свидетельствует о специфическом воздействии испытуемых соединений на образование пигмента, продукция которого определяется присутствием в среде индуктора ацил-гомосеринлактона.
На втором этапе была изучена способность исследуемых образцов ингибировать образование пигмента-антибиотика пиоцианина штаммом P.aeruginosa 71. Пиоцианин является фактором вирулентности P.aeruginosa, вызывающим воспаление тканей макроорганизма, инициируя секрецию ключевого провоспалительного медиатора — фактора некроза опухолей (TNF). Показано, что синтез этого пигмента запускается комплексом
Таблица 1. Влияние мицелиальных экстрактов и на-тивных растворов актиномицетов на синтез пигмента виолацеина культурой Chromobacterium violaceum ^02
№ _Диаметр зон ингибирования, мм_
штамма мицелиальный экстракт нативный раствор
27 14 —
59 16 12
108 14 ±
133 — —
221 — —
229 — —
269 16 12
270 — —
279 17 —
325 16 —
351 — —
379 18 13
470 15 ±
484 — —
525 17 ±
544 — —
Таблица 2. Образование пиоцианина в присутствии
экстрактов из мицелия актиномицетов
Количество Уровень образования пиоцианина
вещества, по отношению к контролю. %
мкл/мл № 525 (миц. экстракт) № 108 (миц. экстракт)
200 45 67
100 64 79
50 87 92
25 95 98
12,5 107 102
RhR/C4-HSL(N-6yTHpHë-r0M0cepHH-ëaKT0H). Однако системы C4-HSL и AHL (3-OXO-C12-HSL) взаиморегулируемы на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях [11].
Из 16 исследованных штаммов 2 штамма проявили способность ингибировать образование пи-оцианина клиническим штаммом P.aeruginosa 71 (табл. 2). Возможно для подавления синтеза пио-цианина необходимы более высокие концентрации вещества, чем для подавления образования виолацеина.
На следующем этапе была исследована способность исследуемых препаратов ингибиро-вать протеазную активность. Одним из высоковирулентных факторов P.aeruginosa является протеаза (эластаза) LasA , активность которой определяет способность возбудителя проникать в эпителиальные клетки, гидролизовать некоторые иммунокомпетентные клетки [12]. Штаммы с «выбитым» геном протеазы LasA, теряют способность к инвазии в эпителиаль-ЛИТЕРАТУРА
1. Хохлов А. С, Овчинников Ю. А. Химические регуляторы биологических процессов. М.: Знание, 1969; 142.
2. Eberl L. N-Acyl homoserinelactone-mediated gene regulation in gramnegative bacteria. Syst Appl Microbiol 1999; 22: 493—506.
3. Waters C. M, Bassler B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol 2005; 21: 319—346.
Таблица 3. Влияние нативных растворов и мицелиальных экстрактов актиномицетов на ингибирова-ние образования протеазы
№ Диаметр зон ингибирования
штамма образования протеазы, мм
мицелиальный экстракт нативный раствор
27 13 п/и
59 12 п/и
108 ± п/и
133 нет нет
221 нет нет
229 нет нет
269 14 12
270 нет нет
279 11 п/и
325 13 п/и
351 нет нет
379 13 п/и
470 15 12
484 нет нет
525 14 п/и
544 нет нет
Контроль п/и п/и
Примечание. п/и - полное ингибирование; нет - инги-бирование отсутствует.
ные клетки, а также способность образовывать биоплёнки. Имеются данные, что внеклеточная протеаза у Pseudomonas fluorescens является регулятором обратимой адгезии [13]. Таким образом оценка способности исследуемых препаратов ингибировать внеклеточную протеазу является существенной характеристикой исследуемых препаратов.
Способность изучаемых препаратов к инги-бированию протеазы С была выявлена у всех экстрактов, которые проявили способность к подавлению синтеза виолацеина (табл. 3). Представляет интерес, что в данном эксперименте нативные растворы проявили в большинстве случаев большую активность, чем экстракты из мицелия культур актиномицетов, что возможно связано с различной гидрофильностью исследуемых препаратов.
Заключение
Таким образом, в процессе работы из 16 штаммов, продуцирующих гиполипидемические соединения, было отобрано 9 штаммов (27, 59, 108, 269, 279, 325, 379, 470, 525) способных ингибировать факторы вирулентности бактерий. Это позволяет рассматривать выделенные препараты как перспективные для дальнейшего изучения в качестве средств химиотерапии.
4. Hentzer M. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors. EMBO J 2003; 22: 3803-3815.
5. Smith K. M, Bu Y, Suga H. Induction and inhibition of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by synthetic autoinducer analogs. Chem Biol 2003; 10: 81-89.
6. Andy Schaber K. et al. Analysis of quorum sensing-deficient clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Med Microbiol 2004; 53: 841—853.
7. Чмелъ Я. В, Бибикова М. В, Спиридонова И. А. и др. C^mmm^ природные соединений с гиполипидемической активностью. Антибиотики и xимeoтep 2004; 8—9: 8—12.
8. Чмелъ Я. В., Бибикова М. В., Спиридонова И. А. и др. Изучение в опыи^ in vivo отобранный биологически активные веществ, обла-дaющиx гиполипидемическими свойствами. Уcпexи медицинской микологии: Maт. Всероссийского конгресса по медицинской микологии. M: 2004; 3: 138—139.
9. Бибикова М. В., Селехова Г. Н., Востров С. Н. и др. Оптимизация состава ферментационной среды для выделения продуцентов антибиотиков из микромоноспор. Антибиотики. 1981; 12: 899—904.
10. McClean K. N., Winson M. K., Fish L. et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and
inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones. Microbiology 1997; 143: 3703—3711.
11. Latifi A., Winson M. K, Foglino M. et al. Multiple homologues of LuxR and LuxI control expression of virulence determinants and secondary metabolites through quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Mol Microbiol 1995; 17: 333-343.
12. Kessler E, Safrin M, Abrams W. R. et al. Inhibitors and specificity of Pseudomonas aeruginosa LasA. JBC 1997; 272: 15: 9884—9889.
13. Николаев Ю. А., Паников Н. С. Внеклеточная протеаза как регулятор обратимой адгезии Pseudomonas fluorescens. Микробиология 2002; 71: 5: 629—634.
