CC BY
79
© Т. Ю. Львова, О. И. Степанова, К. Н. фураева, Д. И. Соколов, С. А. Сельков
НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН
влияние препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на пролиферативную и миграционную
активность эндотелиальных клеток
УДК: 611.018.77.74-07:618.3-008.6-085
■ Спектр препаратов, применяемых в акушерстве с целью коррекции эндотелиальной дисфункции, ограничен. Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение влияния препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926. Установлено, что препарат, содержащий янтарную кислоту, инозин, никотинамид
и рибофлавин, стимулировал пролиферативную и миграционную активность клеток линии EA.Hy926 и может быть рекомендован для клинических испытаний. Работа поддержана Министерством образования и науки РФ ГК № 02.740.11.0711 и грантами Президента РФ №НШ-3594.1010.7 и МД-150.2011.7.
■ Ключевые слова: гестоз; эндотелиальные клетки; препарат; содержащий янтарную кислоту; инозин; никотинамид
и рибофлавин.
Несмотря на то что эндотелиальные клетки (ЭК) выстилают сосуды, располагаясь в один слой, их общий объем сопоставим с объемом печени [13]. В ответ на различные физиологически активные вещества (гормоны, цитокины), физические и химические стимулы (изменение давления или рН) ЭК синтезируют и выделяют факторы, регулирующие ангиогенез, воспалительный ответ, гемостаз и проницаемость сосудов. Эндотелий поддерживает баланс между вазодилататорами и вазоконстрикто-рами, ингибирует или стимулирует пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, предотвращает или стимулирует адгезию и агрегацию тромбоцитов, контролирует процессы тромбогенеза и фибринолиза [10]. Нарушения в поддержании описанного баланса приводят к дисфункции эндотелиальных клеток. Термин «эндотелиальная дисфункция» был впервые предложен Furchgott R. Е и Zawadzki J. V [11]. На сегодняшний день термин «эндотелиальная дисфункция» применяется для описания патогенеза не только гипертензии и атеросклероза, но и различных физиологических и патологических процессов, включая гестоз беременных [7].
Объединяющим патогенетическим звеном, сопутствующим эндотелиальной дисфункции при различных патологиях, в том числе при гестозе, является окислительный стресс [2, 4, 5, 6]. Активные кислородные радикалы (О2-, гидрок-сильный радикал (•ОН), Н202, пероксинитрит (ONOO-)) продуцируются в стенке сосудов как в норме, так и в условиях стресса, при воспалительной реакции, различных повреждениях стенки сосуда. Существуют физиологические механизмы, позволяющие эффективно нейтрализовать выделяющиеся реактивные радикалы: ферменты, экспрессированные в клетках (каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионперок-сидаза, оксигемоглобин). Активные кислородные радикалы регулируют экспрессию адгезионных молекул, секрецию хе-моаттрактантов и антиоксидантных ферментов, активность металлопротеиназ, активируют ЭК, стимулируя продукцию вазоконстрикторов, инициируют патологические реакции в сосудистой стенке [12]. Накопление активных кислородных радикалов, снижение активности антиокислительной системы [18], повышение продукции эндотелина-1 [19] способствует нарастанию окислительного стресса и нарушению функций эндотелиальных клеток при различных патологиях, в том числе при гестозе [23]. В норме ЭК, выстилающие сосуды, находятся в состоянии относительного «покоя» и период их полной замены составляет более ста дней. Однако во время ангиогенеза, на фоне патологических процессов и после хирургических вмешательств эндотелиальные клетки способны быстро пролиферировать с периодом полной замены в течение 5 дней. Способность эндотелиальных клеток к делению ограничена, поэтому в итоге клетки прекращают делиться и
стареют. Такие стареющие клетки имеют нарушенную морфологию, обладают повышенной секрецией активных кислородных радикалов, сниженной продукцией N0 и чувствительностью к апоптогенным стимулам [8]. Восстановление эндотелиальных клеток поврежденного сосуда, сопровождающееся восстановлением их функций, в норме также происходит за счет предшественников эндотелиальных клеток костномозгового происхождения [9]. Фактором риска повторного возникновения дисфункции эндо-телиальных клеток при ангиопластике и ресте-нозе, является недостаточное количество таких клеток-предшественников [15].
Необходимо отметить, что особое внимание в терапии патологий, сопровождающихся эндо-телиальной дисфункцией, например таких как гестоз беременных женщин, уделяют поддержанию функционального состояния ЭК. Вместе с тем спектр препаратов, применяемых в акушерстве с целью коррекции эндотелиальной дисфункции, ограничен, что определяет актуальность поиска новых лекарственных средств. Санкт-Петербургской научно-технологической фармацевтической фирмой разработан препарат, содержащий янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, раствор для внутривенного введения. Препарат оказывает про-тивогипоксическое и антиоксидантное действие, положительно влияет на процессы энергообразования в клетке, уменьшая продукцию свободных радикалов и восстанавливая активность ферментов антиоксидантной защиты [1]. Благодаря этим свойствам препарата его использование рекомендовано в составе комплексной терапии ге-стоза [3]. Препарат состоит из двух метаболитов — янтарной кислоты и рибоксина, а также двух коферментов-витаминов — никотинамида и рибофлавина мононуклеотида (рибофлавин). [1]. Состав препарата предполагает непосредственное влияние на функциональное состояние всех клеток организма, в том числе ЭК. Целью настоящего исследования явилась оценка влияния препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на проли-феративную и миграционную активность эндо-телиальных клеток.
Материалы и методы
Препарат, содержащий янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, предоставлен Санкт-Петербургской научно-технологической фармацевтической фирмой — комплексный раствор для внутривенного введения. В 1 мл раствора содержится: янтарной кислоты 100 мг, инозина (рибоксина) 20 мг, никотинамида 10 мг, рибоф-
лавина мононуклеотида 2 мг, вспомогательные вещества (N-метилглюкамин, натрия гидроксид, вода для инъекций).
Работа выполнена с использованием ЭК линии EA.Hy926. Линия клеток EA.Hy926 была любезно предоставлена Dr. C. J. Edgel (Университет Северной Каролины, США). Клетки линии EA.Hy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелию человека.
Для определения минимальной токсической дозы препарата в отношении ЭК линии EA.Hy926 в 96-луночном круглодонном планшете (Sarstedt, Австрия) готовили серию разведений: от чистого препарата до разведения 1:1048576 в объеме 100 мкл путем последовательного титрования препарата в 2 раза на среде DMEM\F12. После разведения в каждую лунку к 100 мкл пробы препарата добавляли по 10 мкл ЭТС. Клетки линии EA.Hy926 вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (BD, США) в концентрации 35000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM/ F12 (Sigma, США) c добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma, США) и культивировали 20 часов при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2 до образования конфлюэнтного монослоя. Затем заменяли куль-туральную среду в лунках с клетками на приготовленные разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, и культивировали клетки 24 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2. В качестве контроля использовали культуральную среду с добавлением 10 % ЭТС. После инкубации клетки линии EA.Hy926 окрашивали 0,2 % раствором кристаллического фиолетового (Sigma, США), содержащего 5 % метанола и отмывали дистиллированной водой. Планшет высушивали, проводили экстракцию красителя 10 % раствором уксусной кислоты. Учет оптической плотности раствора проводили на микропланшетном риде-ре Labsystems (Финляндия) при длине волны 540 нм. Результаты выражали в единицах оптической плотности. О снижении жизнеспособности клеток судили по снижению оптической плотности пробы по сравнению с клетками, к которым при инкубации не добавляли препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин.
Для оценки влияния препарата на пролифе-ративную активность эндотелиальных клеток в 96-луночном круглодонном планшете (Sarstedt, Австрия) готовили серию разведений препарата: от разведения 1 : 4 до разведения 1 : 1048576 в объеме 100 мкл и добавляли по 2,5 мкл ЭТС. Клетки линии EA.Hy926 вносили в лунки 96-
Рис. 1. Влияние препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926.
А — начальная ширина линии разрушенного монослоя (миграционной поверхности); Б — клетки линии EA.Hy926 в культу-ральной среде DMEM\F12, 2,5 % ЭТС без добавления препарата; В — клетки без добавления препарата в присутствии 10 % ЭТС; Г — клетки, проинкубированные в культуральной среде DMEM\F12, 2,5 % ЭТС в присутствии препарата в разведении 1 : 4096
луночного плоскодонного планшета (BD, США) в концентрации 5000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM/F12 (Sigma, США) c добавлением 10 % ЭТС (Sigma, США) и культивировали 24 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2. Затем отмывали клетки теплой средой без ЭТС и добавляли в лунки с клетками разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин. В качестве контроля использовали культуральную среду с добавлением 2,5 % ЭТС. Для дополнительного контроля оценивали степень усиления пролиферативной активности клеток линии EA.Hy926 в присутствии культуральной среды с добавлением 10 % ЭТС по сравнению с влиянием той же среды с добавлением 2,5 % ЭТС. Затем клетки линии EA.Hy926 культивировали 72 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2, после чего клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым согласно методике, описанной выше. После инкубации клеток линии EA.Hy926 в присутствии препарата, в разведениях начиная с минимальной токсической дозы также оценивали их жизнеспособность, окрашивая трипановым синим, при этом она составляла 95-97 %.
Для оценки миграционной активности клетки линии EA.Hy926 вносили в лунки 96-луночного
плоскодонного планшета (BD, США) в концентрации 35000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM/F12 (Sigma, США), 10 % ЭТС (Sigma, США) и культивировали 24 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2. Затем монослой нарушали, соскабливая часть клеток наконечником для пипетки на 200 мкл (рис. 1А) и отмывали теплым (37 °С) раствором Хенкса. В лунки с клетками добавляли разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, приготовленные на среде DMEM/ F12 с добавлением 2,5 % ЭТС. В качестве контроля использовали культуральную среду с добавлением 2,5 % ЭТС. В качестве положительного контроля использовали культуральную среду с добавлением 10 % ЭТС (рис. 1Б и 1В). Затем клетки линии EA.Hy926 культивировали 24 часа при 37 °С во влажной атмосфере, 5 % СО2, после чего окрашивали 0,2 % раствором кристаллического-фиолетового (Sigma, США). Учет данных проводили при помощи микроскопа
AxioObserver.Z1 и компьютерной системы анализа изображений (Zeiss, Германия). Для каждой лунки фотографировали 3 поля зрения. Анализ полученных данных проводили при помощи компьютерной программы Морфология 5.0. На каждой фотографии откладывали две прямые
параллельные линии разрушенного монослоя. Расстояние между прямыми равнялось ширине линии разрушенного монослоя (в пикселях), сфотографированной сразу же после разрушения (начальная ширина, рисунок 1А). Учитывали количество клеток на участке, ограниченном двумя прямыми и измеряли ширину линии разрушенного монослоя после миграции клеток (рис. 1Б). Об изменении миграционной активности клеток судили по изменению количества мигрировавших клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде DMEM/F12, содержащей 2,5 % ЭТС), а также по изменению ширины линии разрушенного монослоя после миграции клеток в пробе по сравнению с контролем.
Все разведения препарата в каждом эксперименте дублировались четыре раза. Эксперименты
Влияние препарата, содержащего янтарную кислоту, ин клеток линии EA.Hy926
по оценке минимальной токсической дозы препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, а также оценке его влияния на пролиферацию и миграцию клеток линии EA.Hy926 проводили трижды. Статистическую обработку результатов проводи в программе Attestat 12.1.7 с использованием критерия Стьюдента.
Результаты исследования
Установлено, что неразведенный препарат, а также его разведения от 1:1 до 1:256 оказывали токсическое действие на клетки линии EA.Hy926. Минимальной токсической дозой препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, являлось его разведение на среде DMEM/F12 1:256 (табл. 1). При ис-
Таблица 1
н, никотинамид и рибофлавин, на выживаемость
Инкубация клеток в течение 24 часов в присутствии Оптическая плотность раствора
среда БМЕМ/Р12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки 1,54 ± 0,08
чистый препарат с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки 0,053 ± 0,01**
Разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на культуральной среде БМЕМ/Р12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки 1:1 0,069 ± 0,01**
1:2 0,096 ± 0,02**
1:4 0,58 ± 0,08**
1:8 1,09 ± 0,03**
16 1,21 ± 0,06*
32 1,45 ± 0,07
64 1,34 ± 0,16
1 128 1,34 ± 0,13
1 256 1,26 ± 0,03*
1 512 1,63 ± 0,11
1 024 1,64 ± 0,09
1 2048 1,77 ± 0,06*
Достоверное отличие количества клеток линии ЕА.Ну926 при их культивировании в присутствии культуральной среды БМЕМ/Р12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, от культивирования клеток только в культуральной среде с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки: * — р < 0,05; ** — р < 0,001.
Таблица 2
Влияние препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на миграционную активность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926
Инкубация клеток в течение 24 часов в присутствии Количество клеток Ширина линии разрушенного монослоя, пиксели
среда БМЕМ^12 с добавлением 0 % ЭТС 330 ± 8* 368,0 ± 9,8***
среда БМЕМ^12 с добавлением 2,5 % ЭТС 372 ± 13 215,3 ± 15,5
среда БМЕМ^12 с добавлением 10 % ЭТС 495 ± 15*** 38,8 ± 10,0***
Разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на культуральной среде БМЕМ/Р12 с добавлением 2,5 % эмбриональной телячьей сыворотки 1:512 260 ± 13*** 230,2 ± 9,1
1:1024 375 ± 20 190,7 ± 12,3
1:2048 395 ± 7 167,6 ± 8,0**
1:4096 471 ± 12*** 42,3 ± 11,4***
1:8192 426± 12** 110,7 ± 14,2***
1:16384 401 ± 14 156,1 ± 9,6**
1:32768 388 ± 38 185,2 ± 11,5
Достоверно отличается от инкубации клеток линии ЕА.Ну926 в среде БМЕМ/Р12 с добавлением 2,5 % эмбриональной телячьей сыворотки * р < 0,05; ** р < 0,01, *** р < 0,001
0,700 -
0,600 -
0,540 0,500
0,400 -
оп
0,300 -0,200 0,100 -
0,000
tio ,0 jS3
^ # #
\>° "ч> V" V V V V" V V V" ч^ ч\~
Рис. 2. Влияние препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, на пролиферативную активность эндотелиальных клеток.
По оси абсцисс отложено разведение препарата, по оси ординат — оптическая плотность (ОП) образца после экстракции красителя, отражающая относительное количество клеток в лунке. Спонтанный уровень пролиферативной активности клеток линии ЕА.Ну926 отмечен сплошной линией на уровне ОП = 0,540. Достоверность отличия от спонтанного уровня пролиферации **— р < 0,01; *— р < 0,001
пользовании разведения препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, 1:512 и 1:1024 не отмечали снижения жизнеспособности клеток линии ЕА.Ну926 по сравнению со средой DMEM/F12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. При инкубации в присутствии разведения препарата 1:2048, приготовленного на среде DMEM/F12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, отмечали небольшое достоверно значимое увеличение плотности клеток по сравнению со спонтанным уровнем образования монослоя в присутствии культуральной среды DMEM/F12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Этот факт свидетельствует о том, что внесение в культуральную среду препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никоти-намид и рибофлавин, повышает пролифератив-ную активность клеток и, возможно, сни-жает эффект контактного торможения клеток в плотном монослое.
В разведениях 1:512 и 1:1024 препарат вызывал снижение пролиферативной активности клеток линии ЕА.Ну926 (рис. 2) при сохранении их жизнеспособности. Препарат в разведении 1:4096 оказывал стимулирующее влияние на пролифератив-ную активность клеток линии ЕА.Ну926 (рис. 2) по сравнению со спонтанным уровнем пролифе-
ративной активности. В разведении 1:2048, а также 1:8192 и выше препарат не оказывал влияния на пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926.
Препарат в разведениях от 1: 2048 и до 1: 16384 усиливал миграционную активность эн-дотелиальных клеток линии ЕА.Ну926 (табл. 2). При этом препарат в разведении 1:4096 усиливал миграционную активность эндотелиаль-ных клеток (рис. 1Г) сильнее, чем в разведениях 1:2048, 1:8192, 1:16384 (р < 0,01), а в разведении 1:8192 сильнее, чем в разведениях 1:2048, 1:16384 (р < 0,01). При разведении 1:512 препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, отмечали уменьшение количества мигрировавших клеток по сравнению с контролем (табл. 2).
Обсуждение
Способности к самовоспроизведению и миграции являются одними из важнейших свойств ЭК. Ингибирование пролифератив-ной и миграционной активности ЭК может вносить значительный вклад в развитие эн-дотелиальной дисфункции при гестозе. Ранее в исследованиях показано, что плазма крови беременных женщин с гестозом ингибирует пролиферативную активность ЭК, при этом ингибирование пролиферативной активности
клеток тем значительнее, чем тяжелее степень гестоза [21]. На модели ЭК было показано, что факторы, секретируемые тканью плацент беременных женщин с гестозом, снижают про-лиферативную активность эндотелиальных клеток, что свидетельствует о нарушении их функционального состояния. Обнаруженное нами усиление пролиферативной активности ЭК линии ЕА.Ну926 под действием препарата может способствовать нормализации физиологического состояния ЭК и восстановлению эндотелиальной выстилки сосудистого русла в условиях эндотелиальной дисфункции, развивающейся при гестозе.
Клеточная пролиферация — процесс, требующий больших затрат энергии. Уменьшение поступления питательных веществ в клетку может ограничить клеточную пролиферацию или привести к гибели клетки из-за недостатка АТФ. [22]. Препарат относится к группе метаболических средств и состоит из янтарной кислоты, инозина, никотинамида и рибофлавина. Компоненты препарата являются индукторами основных метаболических путей в клетках, увеличивают образование энергии и активируют внутриклеточный синтез белка и нуклеиновых кислот [1]. Так, янтарная кислота, входящая в состав препарата, является центральным субстратом цикла Кребса и может включаться в этот цикл, преодолевая клеточные и митохондриальные мембраны. Янтарная кислота ускоряет оборот дикарбоновой части цикла Кребса, увеличивает синтез АТФ. Рибофлавин обладает антигипок-сическим действием, связанным с увеличением активности флавинредуктаз и восстановлением уровня соединений с макроэргическими химическими связями — АТФ и креатинфосфата. Рибофлавин также стимулирует утилизацию янтарной кислоты, активируя систему митохондри-ального транспорта дикарбоновых кислот цикла Кребса через глицерофосфатный «челночный» механизм, а янтарная кислота повышает трансмембранный потенциал, стимулируя транспорт рибофлавина через мембраны. Тем самым компоненты препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, могут поддерживать энергообразование в митохондриях и восстанавливать биоэнергетический потенциал клетки, способствуя ее выживанию [1]. Вместе с тем следует отметить, что ингибирую-щий характер действия препарата в разведениях от 1:4 до 1:1024 на пролиферативную активность ЭК линии ЕА.Ну926 может быть вызван влиянием на синтез и экспрессию аутокринных факторов роста этих клеток. Поэтому в дальнейшем представляется актуальным изучить возмож-
ные механизмы реализации влияния препарата на пролиферативную активность клеток линии EA.Hy926 за счет влияния на секрецию ЭК факторов роста.
Ингибирование миграционной активности наряду с ингибированием пролиферативной активности способствует нарушению функционального состояния эндотелиальных клеток. В проведенном нами исследовании было показано, что препарат, содержащий янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, стимулирует миграционную активность ЭК линии EA.Hy926 в условиях сниженного содержания ростовых факторов. Усиление миграционной активности ЭК в присутствии препарата может способствовать поддержанию функционального состояния эндотелиальных клеток сосудистого русла в условиях in vivo. Важную роль в патогенезе гестоза играет нарушение процессов формирования и роста сосудов. Поскольку миграция и пролиферация ЭК являются одними из этапов ангиогенеза, то нарушение этих процессов приводит к нарушению формирования и роста сосудов. Стимулирующий эффект препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, в отношении пролиферативной и миграционной активности эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 может способствовать стимуляции процессов ангиогенеза, а также восстановлению эндотелиальной выстилки сосудов материнской кровеносной системы.
В состав препарата входит никотинамид, который связывается с коферментами НАД и НАДФ, переносящими водород, участвующими в метаболизме жиров, белков, аминокислот, пуринов, тканевом дыхании, гликогенолизе, процессах биосинтеза. Ранее отмечено, что продукты фермента оксидазы, содержащей восстановленный НАДФ, участвуют в стимуляции пролиферации и миграции клеток кровеносных сосудов на уровне внутриклеточных путей передачи сигнала [16, 24]. Также отмечено, что заметную роль в стимуляции миграции и пролиферации клеток стенки кровеносного сосуда играют изоформы НАДФ — Noxl and Nox2 [17, 14]. Учитывая, что гестоз беременных сопровождается повышенной продукцией активных форм кислорода, еще раз следует отметить наличие в составе препарата рибофлавина. Этот витамин значительно снижает продукцию активных форм кислорода и провоспалительных медиаторов, подавляет Т-клеточную инфильтрацию стенки сосудов и образование аутоантител [20]. Поэтому препарат обладает потенциалом повышения жизнеспособности эндотелиальных клеток в условиях системной эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, препарат, содержащий янтарную кислоту, инозин, никотинамид и рибофлавин, обладает стимулирующим эффектом в отношении пролиферации и миграции эндоте-лиальных клеток линии EA.Hy926. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения клинических испытаний препарата, содержащего янтарную кислоту, инозин, ни-котинамид и рибофлавин, при лечении гестоза. Следует отметить, что в присутствии препарата в разведениях от 1:4 до 1:1024, приготовленных на культуральной среде с пониженным содержанием эмбриональнеой телячьей сыворотки (2,5 %), было отмечено снижение пролифератив-ной активности ЭК. Поэтому недостаточное содержание ростовых факторов в сыворотке крови беременных женщин с гестозом может способствовать ингибирующему действию препарата на пролиферативную активность ЭК. В связи с этим рекомендуется проводить клинические испытания препарата для лечения таких осложнений беременности, как гестоз и хроническая плацентарная недостаточность, в диапазоне разведений препарата от 1:4096 до 1:8192.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ ГК №02.740.11.0711 и грантами Президента РФ №НШ-3594.1010.7 и МД-150.2011.7.
Литература
1. Афанасьев В. В., Лукьянова И. Ю. Особенности применения цитофлавина в современной клинической практике. — СПб.: Тактик Студио,2010. — 80с.
2. Ветров В. В. Гестоз и эфферентная терапия. — СПб.: СПбМАПО, 2000. — 104 с.
3. Качалина Т. С., Лебедева Н. В., Ильина Л. Н. Новые подходы к лечению гестоза с применением Перфторана и Цитофлавина // Общая реаниматология. — 2007. — № 3(1). — С.63-68
4. Крукиер И. И. Продукция NO и окислительная деструкция белков в плаценте при физиологической беременности и плацентарной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2003. — №10.— C.418-420.
5. КрукиерИ.И. Процессы радикалообразования в плаценте при плацентарной недостаточности // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2004.— №4. — С.6-8.
6. Эндотелиальная дисфункция при гестозе. Патогенез, генетическая предрасположенность, диагностика и профилактика: методические рекомендации / Мозговая Е. В. [и др.]; ред. Э. К. Айламазян. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2003. — 32 с.
7. Activation of endothelial cells in preeclampsia: increased neutrophil-endothelial adhesion correlates with up-regulation of adhesion molecule P-selectin in human umbilical vein endothelial cells isolated from preeclampsia / Wang Y. [et al.] // J. Soc. Gyneco.l Investig. — 1998. — Vol.5. — P. 237-243.
8. Antioxidants inhibit nuclear export of telomerase reverse transcriptase and delay replicative senescence of endothelial cells / Haendeler J. [et al.] // Circ. Res. — 2004. — Vol. 94. — P.768-775.
9. Autologous culture-modified mononuclear cells confer vascular protection after endothelial injury / Gulati R. [et al.] // Circulation. — 2003. — Vol. 108. — P.1520-1526.
10. Davignon J., GanzP. Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis // Circulation. — 2004. — Vol. 109, N 23, suppl. 1. — P. III27—32.
11. Furchgott R. F., Zawadzki J. V. The obligatory role of the endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. — 1980. — Vol.288. — P. 373-376.
12. Griendling K. K., FitzGerald G. A. Oxidative stress and cardiovascular injury. Pt. I. Basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS // Circulation. — 2003. — Vol.108. — P.1912-1916.
13. Huttner I. G., Gabbiani G. Vascular endothelium in hypertension // Hypertension / ed. Genest J. — New York: McGraw-Hill, 1983. — P.473-488.
14. Jiang F., Dusting G. J. Natural phenolic compounds as cardio-vasculartherapeutics: potential role of their antiinflammatory effects // Curr. Vasc. Pharmacol. — 2003. — Vol.1. — P.135-156.
15. Lerman A. Restenosis: another "dysfunction" of the endothelium // Circulation. — 2005. — Vol.111. — P. 8-10.
16. Mitogenic signaling mediated byoxidants in Ras-transformed fibroblasts / Irani K. [et al.] // Science. — 1997. — Vol. 275. — P.649-652.
17. Perivascular gene transfer of NADPH oxidase inhibitor sup-pressesangioplasty-induced neointimal proliferation of rat carotid artery / Dourron H. M. [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. — 2005. — Vol. 288. — P. H946-953.
18. Preeclampsia and antioxidant nutrients: decreased plasma levels of reduced ascorbic acid, alpha-tocopherol, and beta-carotene in women with preeclampsia / Mikhail M. S. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. —1994. —Vol.171. — P.150-157.
19. PollockD. M. Endothelin, angiotensin and oxidative stress in hypertension // Hypertension. — 2005. — Vol. 45. — P. 477480.
20. Riboflavin-mediated reduction of oxidant injury, rejection, and vasculopathy after cardiac allotransplantation / Iwanaga K.[et al.] // Transplantation. — 2007 / — Vol. 83. — P.747-753.
21. Smarason A. K., Sargent I. L., Redman C. W. Endothelial cell proliferation is suppressed by plasma but not serum from women with preeclampsia // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1996. — Vol.174, №2. — P. 787-793.
22. The biology of cancer: metabolic programming fuels cell growth / DeBerardinis R. J. [et al.] // Cell Metab. — 2008. — Vol.7, №1. — P.11-20.
23. TouyzR.M. Reactive oxygen species, vascular oxidative stress and redox signaling in hypertension. What is the clinical significance? // Hypertension. — 2004. — Vol. 44. — P. 248-252.
24. Vascular oxidantstress early after balloon injury: evidence for increased NAD(P)H oxido-reductaseactivity / Souza H. P. [et al.] // Free Radic. Biol. Med. — 2000. — Vol.28. — P. 1232-1242.
Статья представлена И. М. Кветным, ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург
INFLUENCE OF THE PREPARATION CONTAINING SICCINIC ACID, INOSINE, NICOTINAMIDE AND RIBOFLAVIN TO ENDOTHELIAL CELLS PROLIFERATIVE AND MIGRATION ACTIVITY
Lvova T. Yu., Stepanova O. I., Furaeva K. N., Sokolov D. I., Selkov S. A..
■ Summary: The range of drugs used in obstetrics with the purpose of correction of endothelial dysfunction,
limited. Therefore, the aim of this study was to investigate the influence of the preparation containing siccinic acid, inosine, nicotinamide and riboflavin on proliferative and migration activity of endothelial cell line EA.Hy926. It is established, that a preparation containing siccinic acid, inosine, nicotinamide and riboflavin stimulated proliferative and migration activity of cell line EA.Hy926 and can be recommended for clinical trials. The work was supported by the Ministry of education and science of Russian Federation GK №02.740.11.0711 and grant of President of Russian Federation №NSH-3594.1010.7 and MD-150.2011.7.
■ Key words: preeclampsia; endothelial cells; cytoflavin.
■ Адреса авторов для переписки-
Львова Татьяна Юрьевна — научный сотрудник НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, аспирантка СПб ГТИ (ТУ). 199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3, лаборатория иммунологии. E-mail: lvov-spb@mail.ru.
Степанова Ольга Игоревна — научный сотрудник НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН,199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3, лаборатория иммунологии. E-mail: alzass@mail.ru.
Фураева Ксения Николаевна — студентка СПбГУ, 199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3, лаборатория иммунологии. E-mail: Furaeva-Kseniya@mail.ru.
Соколов Дмитрий Игоревич — д. б. н., ведущий научный сотрудник. лаборатории иммунологии НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, 199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3, лаборатория иммунологии. E-mail: corbie@hotmail.ru.
Сельков Сергей Алексеевич — д. м. н., проф., директор лаборатории иммунологии НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН, 199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3, лаборатория иммунологии. E-mail: selkovsa@mail.ru.
Lvova Tatyana Urevna — scientist, The D. O. Ott Research Institute of
Obstetrics and Gynecology,
Russian Academy of Medical Sciences,
laboratory of immunology. 199034, St-Peterburg, Mendeleevskaya line, 3. E-mail: lvov-spb@mail.ru.
Stepanova Olga Igorevna — scientist, The D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, laboratory of immunology. 199034, St-Peterburg, Mendeleevskaya line, 3. E-mail: alzass@mail.ru.
Furaeva Kseniya Nikolaevna — The D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, laboratory of immunology. E-mail: Furaeva-Kseniya@mail.ru.
Sokolov Dmitry Igorevich — Doctor of biological sciences, leading researcher, The D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, laboratory of immunology. 199034, St-Peterburg, Mendeleevskaya line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru.
Selkov Sergey Alekseevich — Doctor of medical sciences, head of the laboratory of immunology, The D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, laboratory of immunology. 199034, St-Peterburg, Mendeleevskaya line, 3. E-mail: selkovsa@mail.ru.
