CC BY
60
УДК 57.085.23
ОЦЕНКА ЭФФЕКТА ПРОАНГИОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ И МИГРАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ЛИНИИ EA.Hy926
Александр Петрович ЛЫКОВ1,2, Ольга Владимировна ПОВЕЩЕНКО1,2, Наталья Анатольевна БОНДАРЕНКО1,2, Александр Федорович ПОВЕЩЕНКО1,2, Ирина Иннокентьевна КИМ1,2, Татьяна Владимировна МИЛЛЕР1, Евгений Анатольевич ПОКУШАЛОВ2, Александр Борисович РОМАНОВ2, Владимир Иосифович КОНЕНКОВ1,2
1 ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2 ФГБУ Новосибирский НИИ патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России
630055, г. Новосибирск, ул. Речкуновская, 15
В работе исследовано влияние ростовых факторов и цитокинов на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии ЕА.Ну926. Показано, что эритропоэтин и кондиционная среда от монону-клеарных клеток периферической крови, обогащенных клетками костного мозга путем мобилизации введением G-CSF от пациентов с ИБС, увеличивают пролиферацию клеток ЕА.Ну926. Миграционная активность клеток ЕА.Ну926 повышается под влиянием фактора роста эндотелия сосудов, фактора некроза опухоли-а, эритропо-этина. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования цитокинов и факторов, продуцируемых мононуклеарами, мобилизованными из костного мозга введением G-CSF, для стимуляции неоан-гиогенеза.
Ключевые слова: пролиферация, миграция, эндотелиальные клетки, ростовые факторы.
Репарация повреждений стенок сосудов и непосредственно формирование новых сосудов в постнатальном периоде осуществляются за счет развития коллатеральных сосудов (артериогенез), развития новых капилляров путем миграции и пролиферации предсуществующих дифференцированных эндотелиальных клеток (ангиогенез) и путем васкулогенеза эндотелиальными прогени-торными клетками [5]. Также показано, что резидентные прогениторные клетки через продукцию биоактивных веществ стимулируют миграцию в
зону повреждения зрелых эндотелиальных и эн-дотелиальных прогениторных клеток из других зон, программируя их дифференцировку в зрелые клетки и способствуя тем самым репарации повреждений [8, 10]. Неоангиогенез протекает поэтапно: разрыв базальной мембраны сосудов и матрикса эндотелиоцитов, миграция эндотели-альных и эндотелиальных прогениторных клеток в направлении ангиогенных стимулов (хемотаксис), пролиферация и формирование трехмерных тубулоподобных структур (новых кровеносных
Лыков А.П. - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики, e-mail: lykovalex@freemail.ru
Повещенко О.В. - к.м.н., зав. лабораторией лимфотропной терапии и лимфодиагностики, e-mail: poveschenkoov@yandex.ru
Бондаренко Н.А. - аспирант лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики, e-mail: bond802888@yandex.ru
Повещенко А.Ф. - д.м.н., зав. лабораторией физиологии протективной системы, e-mail: poveshchenkoa200@mail.ru
Ким И.И. - научный сотрудник лаборатории лимфотропной терапии и лимфодиагностики, e-mail: kii5@yandex.ru
Миллер Т.В. - аспирант лаборатории физиологии протективной системы, e-mail: tmw87@mail.ru Покушалов Е.А. - д.м.н., зам. директора, e-mail: cpsc@nricp.ru
Романов А.Б. - к.м.н., врач-хирург центра хирургической аритмологии, e-mail: aromanov1981@rambler.ru Коненков В.И. - д.м.н., проф., академик РАМН, директор, e-mail: lymphology@soramn.ru
сосудов). В последние годы в клиническую практику внедряются высокотехнологичные подходы реваскуляризации органов и тканей, основанных на применении проангиогенных факторов роста и клеточной терапии для лечения различных дегенеративных, в том числе сердечно-сосудистых, заболеваний. Одним из возможных способов действия клеток-предшественников является па-ракринный механизм, обусловленный секрецией биологически активных веществ. Известно, что репарация поврежденных сосудов и неоваску-ляризация поврежденных тканей и органов находятся под влиянием как стимулирующих, так и ингибирующих гуморальных факторов, в том числе цитокинов и ростовых факторов. Существенное значение в ангиогенезе отводится функциональной активности эндотелиальных клеток, в том числе их пролиферативному и миграционному потенциалу, который зависит от влияния цитокинов и ростовых факторов [1, 6, 8, 10, 13]. Поэтому, исходя из вышеизложенного, целью исследования стало изучение влияния ростовых факторов и цитокинов на пролиферацию и миграцию клеток EA.Hy926.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клетки эндотелиальной линии EA.Hy926 культивировали в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (FCS; Биолот, Россия), 160 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Россия), 2 ммоль L-глутамина (ICN, США) в СО2-инку-баторе при 37 оС и 5 % СО2 до образования конфлюэнтного монослоя. Пересев осуществляли 1 раз в 3-4 дня. Пролиферацию клеток EA.Hy926 оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромида (МТТ) [6, 14], а также по изменению клеточного импеданса в режиме реального времени на анализаторе xCELLigence (Roche Applied Science, Германия) [7, 11]. Интенсивность пролиферативного потенциала изучали в присутствии эритропоэтина (Epo) (Рекормон, Германия; 33 МЕ/мл) и 30 % кондиционной среды (КС), а также в серии экспериментов с предварительной обработкой EA.Hy926 митомицином С (40 мкг/мл, США) [12].
Источником КС служили мононуклеарные клетки периферической крови (МНК) от 5 пациентов с ИБС. МНК получали путем обогащения на градиенте плотности фиколл/верографин афе-резного продукта после мобилизации стволовых/ прогениторных клеток из костного мозга в периферическое русло введением G-CSF (Грасальва,
Израиль; 3,3-5,0 мкг/кг в сутки, в течение 5 дней). МНК инкубировали в течение 72 ч, собирали КС, разливали по аликвотам и хранили при -70 оС до использования.
Миграционную способность клеток ЕА.Ну926 изучали в камере Бойдена (BD, США) с учетом количества мигрировавших через микропоры клеток через 24 ч и по изменению клеточного импеданса в двухуровневых камерах в спонтанном тесте и при добавлении в нижнюю камеру Еро, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Вю\шоп, США; 10 нг/мл), фактора некроза опухоли-а (ТОТ-а) (Sigma-Aldrich, США; 5нг/мл) при низком содержании FCS (1 %) в культураль-ной среде.
Изменение клеточного импеданса на микроэлектродах, обусловленного прикреплением и распластыванием клеток, выражалось как клеточный индекс, который автоматически вычислялся программой как (Ял - ЯЬ)/^ где ЯЬ - исходное значение импеданса в лунке, содержащей только ростовую для клеток среду, Яп - значение импеданса в лунке в любое время (0, содержащей помимо ростовой среды и тестируемые клетки.
Меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним квартилями; достоверность различий рассчитывали по ^-критерию Манна-Уитни и принимали при значениях р < 0,05. Связь между различными признаками определяли с помощью корреляционного анализа величиной коэффициента корреляции Спирмена (г).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из таблицы, интенсивность пролиферации ЕА.Ну926 зависела от наличия в питательной среде сыворотки и ростовых факторов. Дефицит FCS в культуральной среде приводил к статистически значимому подавлению пролиферации клеток ЕА.Ну926 в сравнении с аналогичным показателем в присутствии сыворотки и ростовых факторов на различные сроки инкубации. Добавление Еро к клеткам ЕА.Ну926 при обеднении культуральной среды FCS приводило к увеличению пролиферации клеток через 24 ч наблюдения (р = 0,006) и к некоторому снижению в более длительные сроки культивирования, в то время как пролиферативная активность клеток, росших при низкой концентрации сыворотки и добавлении в питательную среду 30 % КС, оставалась на всем протяжении эксперимента статистически значимо большей (р = 0,006) и существенно не менялась. Между уровнем пролиферации клеток ЕА.Ну926 в присутствии 10 % FCS и в присутствии 1 % FCS и дополнительных стимулов
Таблица
Показатель пролиферативной активности клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 в МТТ-тесте (в условных единицах оптической плотности), Ме (Lq-Hq)
Группа 24 ч (I) 24 ч (II) 72 ч (III)
Без БС8 (1) 0,19 (0,19-0,21) р1-2 = 0,003 р; 2 = 0,006 р,-4 = 0,006 0,17 (0,15-0,20) р1 2 = 0,014 р--3 = 0,01 р1-4 = 0,021 0,18 (0,14-0,19) р1 2 = 0,021 р1 3 = 0,011 р1-4 = 0,021
10 % БС8 (2) 0,43 (0,43-0,49) 0,49 (0,48-0,50) р2 3 = 0,006 р2-4 = 0,027 0,50 (0,49-0,51) р23 = 0,011 р2-4 = 0,021
1 % БС8 + Еро (3) 0,45 (0,44-0,51) р1-п = 0,004 р-ш = 0,004 0,37 (0,37-0,38) р3-4 = 0,01 0,37 (0,36-0,38) р3-4 = 0,011
1 % БСЯ + КС (4) 0,49 (0,44-0,54) 0,52 (0,51-0,55) 0,54 (0,53-0,55)
(Еро или КС) через 24 ч инкубации не выявлено статистически значимых различий. Необходимо также отметить тот факт, что интенсивности пролиферации клеток ЕА.Ну926 при добавлении в питательную среду Еро и ростовых факторов, содержащихся в КС, существенно не различались на 24 ч наблюдения, а в отдаленные сроки проли-феративный ответ на стимуляцию Еро был статистически значимо ниже, чем исходный (р = 0,004) и чем при стимуляции КС (р < 0,02).
Известно, что Еро оказывает протективный эффект и на клетки негемопоэтического ряда, обусловленный стимуляцией через экспрессиру-емые на поверхности клеток рецепторы к нему или же через активацию в них генов Еро и синтезом Еро в клетках, тем самым осуществляя ауто- и паракринную регуляцию функциональной активности этих тканей [2]. Кроме этого Еро посредством воздействия на эндотелиальные клетки стимулирует процессы неоваскуляризации ишемизированных тканей [3] и снижает влияние окислительного стресса на ткани [15]. Активирующий пролиферативный потенциал клеток эффект КС обусловлен наличием в ней ряда биоактивных веществ. Так, нами ранее было показано, что в КС от МНК, мобилизованных из костного мозга введением G-CSF от пациентов с ИБС, отмечена продукция широкого ряда цитокинов с преобладанием провоспалительных, в частности ТОТ-а и 1КК-у. МНК продуцировали также ^-1р, ^-6, G-CSF и Еро, другие цитокины и ростовые факторы с проангиогенными свойствами [3, 4].
Интенсивность пролиферации клеток ЕА.Ну926 по данным исследования клеточного импеданса зависит от количества клеток в лунке и наличия в питательной среде ростовых факторов, содержащихся в FCS (рис. 1, а). Так, концентрация клеток (5-10) х 104 в лунке является оптимальной для исследования пролиферативного
потенциала, а при увеличении количества клеток до 20 х 104 на лунку отмечено снижение пролиферации клеток ЕА.Ну926. Вероятнее всего, это связано с более быстрым прилипанием клеток к датчикам и тем самым невозможностью оставшихся излишних клеток в лунке к адгезии на датчики. Также при увеличении количества клеток в лунке быстрее расходуются питательные вещества, необходимые для поддержания их роста и, возможно, в силу этого клетки погибают и открепляются от датчиков. Существенное значение для пролиферации клеток имеет наличие в питательной среде анализируемых ростовых факторов. В условии дефицита ростовых факторов, содержащихся в FCS, показано снижение пролиферативной активности клеток ЕА.Ну926. Как видно из рис. 1, б, в, даже при дефиците сыворотки в питательной среде добавление к культуре Еро и 30 % КС приводило к статистически значимому увеличению пролиферативного потенциала по сравнению с отрицательным контролем, а именно ростом клеток при 1 % FCS в питательной среде (р < 0,01). Более того, показано наличие сопряженности между параметрами пролиферации клеток ЕА.Ну926 с 10 % FCS и аналогичными показателями для клеток, инкубировавшихся с 1 % сыворотки и добавлением Еро (г = -0,83;р < 0,01) или же КС (г = 0,96; р < 0,01), что не противоречит литературным данным [2, 3, 15].
В экспериментах с предварительной обработкой клеток ЕА.Ну926 митомицином С установлено снижение интенсивности пролиферативного потенциала (клеточный индекс 0,27), в то время как не предобработанные митомицином С клетки показывали большие значения клеточного импеданса (клеточный индекс 5,75), что указывает на сохранность функциональной активности клеток, не подвергшихся подавлению в них процессов метаболизма (данные не представлены) [12].
в
Рис. 1. Зависимость пролиферации клеток эндотелиальной линии EA.Hy926 от наличия ростовых факторов в питательной среде. Линия - 5 х 104 клеток на лунку с 1 % FCS. а - ромб - 5 х 104 клеток на лунку с 10 % FCS, квадрат - 10 х 104 клеток на лунку с 10 % FCS, треугольник - 20 х 104 клеток на лунку с 10 % FCS; б - ромб - 5 х 104 клеток на лунку с 1 % FCS и Epo (30 МЕ/мл); в - ромб - 5 х 104 клеток на лунку с 1 % FCS и 30 % КС от МНК, мобилизованных из костного мозга пациентов с ИБС введением Г-КСФ
При исследовании миграции клеток ЕА.Ну926 в камере Бойдена показано, что через микропоры в направлении градиента ростовых факторов мигрирует небольшое количество клеток (данные не приводятся). Результаты изучения миграционного потенциала клеток ЕА.Ну926 по данным клеточного импеданса в режиме реального времени дают большую информацию об их миграции. Как
видно из рис. 2, а, интенсивность миграции клеток ЕА.Ну926 существенно не менялась в зависимости от их количества в питательной среде, и только к концу эксперимента отмечалась тенденция нарастания миграционного потенциала при большей концентрации сыворотки в среде (10 %). Одним из объяснений такого феномена может быть наличие в сыворотке большого коли-
Рис. 2. Эффект ростовых факторов на миграционный потенциал клеток эндотелиальной линии EA.Hy926. Линия - 1 % FCS; ромбами обозначены: а - 10 % FCS, б - 1 % FCS и VEGF (10 нг/мл), в - 1 % FCS и TNF-a (5 нг/мл), г - 1 % FCS и Epo (33 МЕ/мл)
чества биологически активных веществ (например, TGF-P, ^-10), способных не только активировать, но и ингибировать клеточные функции (пролиферация и миграция).
На рис. 2, б-г показано, что добавление к питательной среде с минимальным содержанием сыворотки VEGF, ТОТ-а приводило к статистически значимому увеличению миграционной активности клеток ЕА.Ну926. Известно о способности ТОТ-а стимулировать функционирование
эндотелиоцитов сосудистой стенки [1, 3, 6] и активировать экспрессию молекул адгезии [9]. VEGF выступает в качестве не только фактора роста сосудистого эндотелия, но и мощного стимулятора миграции эндотелиальных клеток, способствуя формированию сосудистых структур эндотелиальными клетками [1, 6, 8]. Эффект Еро на клетки ЕА.Ну926 был снижен по сравнению с эффектом VEGF и ТОТ-а, что, скорее всего, связано с аутокринным характером регуляции
цитокином функциональной активности клеток, относящихся к негемопоэтическому ряду [2, 3], с одной стороны, и, возможно, с недостаточной экспозицией клеток с данным фактором для проявления его стимулирующего эффекта, с другой стороны.
Результаты исследования влияния на пролиферацию клеток ЕА.Ну926 ростовых факторов по данным клеточного импеданса не противоречат данным исследований пролиферации традиционным методом, однако дают более наглядное представление о процессах, происходящих в лунке в режиме реального времени. Кроме того, клеточный индекс, который является показателем электрического потенциала и отражает статус клеток, их пролиферативную и миграционную активность, может отслеживаться с первых минут и в течение всего периода исследования.
Заслуживающими внимания и новыми можно считать данные о влиянии на пролиферацию и миграцию клеток эндотелиальной линии ЕА.Ну926 растворимых факторов, содержащихся в КС от МНК, обогащенных стволовыми/проге-ниторными костно-мозговыми клетками. Причем действие КС сопоставимо с влиянием таких известных факторов пролиферации и миграции эн-дотелиальных клеток, как VEGF, ТОТ-а и Еро.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Суммируя полученные данные, можно заключить, что пролиферация и миграция эндоте-лиальных клеток человека перевиваемой линии ЕА.Ну926 возрастает под влиянием как цитоки-нов VEGF, ТОТ-а и Еро, так и ростовых факторов супернатанта, полученного при культивировании МНК, обогащенных стволовыми клетками костного мозга. Использование в качестве клеточного трансплантата МНК после мобилизации G-CSF может приводить к стимуляции ангиогенеза путем паракринного действия секретируемых ростовых факторов и цитокинов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Амчиславский Е.И., Соколов Д.И., Сель-ков С.А., Фрейдлин И.С. Пролиферативная активность эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну926 и ее модуляция // Цитология. 2005. (5). 389-399.
2. Захаров Ю.М. Цитопротекторные функции эритропоэтина // Клинич. нефрол. 2009. (1). 16-21.
3. Коненков В.И., Повещенко О.В., Ким И.И. и др. Влияние G-CSF на проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у
больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. (3). 71-76.
4. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещенко О.В. и др. Характеристика фенотипа мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. (1). 9-14.
5. Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Физиологические и цитологические основы клеточной регуляции ангиогенеза // Успехи физиол. наук. 2012. (3). 48-61.
6. Старикова Э.А., Амчиславский Е.И., Соколов Д.И. и др. Изменение поверхностного фенотипа эндотелиальных клеток под влиянием провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов // Мед. иммунол. 2003. (1-2). 39-48.
7. Atienza J.M., Yu N., Wang X. et al. Label-free and real-time cell-based kinase assay for screening selective and potent receptor tyrosine kinase inhibitors using microelectronic sensor array // J. Biomol. Screen. 2006. (11). 634-643.
8. Bendorf R., Boger R.H., Ergun S. et al. Angiotensin II type receptor inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration and in vitro tube formation of human endothelial cells // Circ. Res. 2003. (93). 438-447.
9. Drabarek B., Dymkowska D., Szczepanowska J. et al. TNFa affects energy metabolism and stimulates biogenesis of mitochondria in EA.hy926 endothelial cells // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2012. (44). 13901397.
10. Gao H., Zhang J., Liu T. et al. Rapamycin prevents endothelial cell migration by inhibiting the endothelial-to-mesenchymal transition and matrix metalloproteinase-2 and -9: An in vitro study // Mol. Vis. 2011. (17). 3406-3414.
11. Keogh R.J. New technology for investigating trophoblast function // Placenta. 2010. (31). 347-350.
12. Kin K., Kasahara T., Ithon Y. et al. Cellular cooperation in lymphocyte activation // Clin. Exp. Immunol. 1979. (36). 292-298.
13. Lai Y., Liu X.H., Zhang Y. et al. Interleukin-8 induces the endothelial cell migration through the Rac 1/RhoA-p38MAPK pathway // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2012. (16). 630-638.
14. Lafontaine L., Chaudhry P., Lafleur M.J. et al. Transforming growth factor beta regulates proliferation and invasion of rat placental cell lines // Biol. Reprod. 2011. (84). 553-559.
15. Stein A., Knodler M., Makowski M. et al. Local erythropoietin and endothelial progenitor cells improve regional cardiac function in acute myocardial infarction // BMC Cardiovasc. Disord. 2010. (10). 43-52.
ESTIMATION OF THE EFFECT OF PROANGIOGENIC FACTORS ON THE PROLIFERATIVE AND MIGRATION ACTIVITIES OF THE ENDOTHELIAL CELL OF LINE EA.Hy926
Aleksander Petrovich LYKOVU, Olga Vladimirovna POVESHCHENKO12, Natalia Anatolievna BONDARENKO1,2, Aleksander Fedorovich POVESHCHENKO1,2, Irina Innokentievna KIM1,2, Tatyana Vladimirovna MILLER1, Eugenie Anatolevich POKUSHALOV2, Aleksander Borisovich ROMANOV2, Vladimir Iosiphovich KONENKOV1,2
1 Institute of Clinical and Experimental Lymphology of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
2 E.N. Meshalkin Novisibirsk Institute of Circulation Pathology of Minzdrav of Russia 630055, Novosibirsk, Rechkunovskaya str., 15
The influence of growth factors and cytokines on the proliferation and migration of human endothelial cells (EC) of line EA.Hy926 was studied. It has been shown, that erythropoietin (Epo) and conditioned medium (CM) of peripheral blood mononuclear cells (MNCs) enriched with bone marrow cells by mobilizing due to the introduction of G-CSF from patients with chronic heart failure, increased cell proliferation of EA.Hy926. The EA.Hy926 cell migration activity increased under the influence of vascular endothelial growth factor (VEGF), tumor necrosis factor-a (TNF-a), and erythropoietin (Epo). The findings testify to the motivation for the use of cytokines and factors produced by MNCs mobilized from the bone marrow by the introduction of G-CSF to stimulate neoangiogenesis.
Key words: proliferation, migration, endothelial cells, growth factors.
Lykov A.P. - candidate of medical sciences, leading researcher laboratory of limphotropic therapy and limpodiagnostic, e-mail: lykovalex@freemail.ru
Poveshchenko O.V. - candidate of medical sciences, head of the laboratory of limphotropic therapy and limpodiagnostic, e-mail: poveschenkoov@yandex.ru
Bondarenko N.A. - postgraduate student laboratory of limphotropic therapy and limpodiagnostic, e-mail: bond802888@yandex.ru
Poveshchenko A.F. - doctor of medical sciences, head of the laboratory ofphysiology of the protective system, e-mail: poveshchenkoa200@mail.ru
Kim I.I. - researcher laboratory of limphotropic therapy and limpodiagnostic, e-mail: kii5@yandex.ru Miller T. V. - postgraduate student laboratory ofphysiology ofprotective system, e-mail: tmw87@mail.ru Pokushalov E.A. - doctor of medical sciences, vice-director, e-mail: cpsc@nricp.ru Romanov A.B. - candidate of medical sciences, surgeon of the centre of surgically arrythmology, e-mail: aromanov1981@rambler.ru
Konenkov V.I. - doctor of medical sciences, academician of RAMS, director, e-mail: lymphology@soramn.ru
