CC BY
37
© Коллектив авторов., 2006
УДК 615.322:574.458] .015.4:612.111.1
ВЛИЯНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ДОННИКА ЖЕЛТОГО НА МЕМБРАНЫ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ПЕРЕКИСНОМ ОКИСЛЕНИИ
И. А. Сычев, Г. В. Порядин, В. М. Смирнов, Т. Ю. Колосова
Российский государственный медицинский университет, Москва, Рязанский областной институт развития образования,
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
Полисахариды (водорастворимый полисахаридный комплекс, пектин, гемицеллюлозы А и Б) выделяли из цветущих растений донника желтого последовательной экстракцией. При добавлении их к суспензии мембран эритроцитов здорового донора и введении в организм других животных защищают липиды мембран от разрушения в условиях инициации процесса перекисного окисления липидов.
В основе целого ряда патологических состояний лежат изменения свойств клеточных мембран, вызываемые как факторами внешней среды, так и внутренними функциональными расстройствами [3, 4, 13, 15]. Нарушения в функционировании биомембран обычно связано с развитием патологических процессов. Механизм возникновения и развития таких наиболее распространенных патологий как злокачественный рост, гипертония, атеросклероз, неврозы, гепатит, связаны с нарушением структурных свойств мембранных липидов и белков [5-10, 16, 18].
Перекисное окисление липидов является одним из наиболее распространенных механизмов деструкции биомембран. Однако процессы переписного окисления липидов (ПОЛ) протекают и в нормальной клетке, приводя к образованию предшественников простагландинов, тромбок-санов, простациклина, лейкотриенов, липоксинов. Оно контролируется целым рядом ферментов: НАДФ(Н)-зависимыми микросомальными окси-
геназами, липооксигеназами, оксида-зами, миелопероксидазами [15].
Полисахариды донника желтого представляют собой биополимеры разветвленного строения, содержащие большое количество гидроксог-рупп этерифицированных остатками молекул спиртов и органических кислот, карбоксильных групп как свободных, так и этерифицированных остатками спиртов и фенолов. Эти особенности молекул полисахаридов позволяют им активно реагировать со свободными радикалами, пероксид-ными молекулами, что прекращает цепные реакции перекисного окисления [3, 4]. Согласно современным представлениям полисахариды растительного происхождения способны активировать клетки крови и иммунной системы, повышая их физиологическую активность, что, в свою очередь, способствует стимуляции защитных механизмов клеток крови. Полисахариды способны активировать фагоцитарные реакции, увеличивать количество и повышать активность ферментных систем клеток.
Материалы и методы
Полисахариды выделяли и очищали как описано в работе [9]. Полученные вещества растворяли в физиологическом растворе, получая 10 % рабочий раствор для введения в организм животных. Для работы с донорской кровью использовали растворы препаратов с концентрациями 1 • 10-4; 1 • 10-6; 1 • 10"
8. В эксперименте использовали здоровых крыс самцов породы Вистар массой от 150 до 200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария, и кровь здорового донора. Подопытным животным вводили полисахариды в дозе 0,1 г/кг ВРПК в течение 8 суток, пектин - в течение 10 суток. Контрольным крысам вводили в те же сроки физиологический раствор.
У животных, получавших ВРПК, кровь брали на 2, 3, 5, 8 сутки, у животных, получавших пектин - на 1, 3, 5, 8, 10 сутки.
В крови животных определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, моноцитов, лимфоцитов. Перекисную резистентность исследовали по методу Й. Тодорова в образцах крови подопытных и контрольных крыс и в образцах донорской крови [13, 14].
Мазки крови окрашивали смесью метилового зеленого и пиронина с целью выявления РНК в клетках, которая окрашивается при этом в различные оттенки красного (от пурпурного до красно-фиолетового). Мазки крови окрашивали смесью а-нафтола и пиронина для выявления ферментов оксидаз в клетках, которые окрашиваются при этом в различные оттенки синего цвета [5-8].
Антиоксидантную активность полисахаридов изучали на эритроцитах крови здорового донора. В суспензию эритроцитов добавляли препарат полисахаридов в концентрациях 1 • 10-4; 1 • 106; 1 • 10-8, а в контроль физиологический
раствор. Полученные смеси облучали бактерицидной лампой в течение 30 минут, затем осаждали белки, отделяя их центрифугированием и на спектрофотометре определяли оптическую плотность опытных проб по отношению к контролю. Антиоксидантную активность рассчитывали по формуле
опт. пл. опыта г і -зі
А. О. А. = 100 ------------• 100% 113]
опт. пл. контроля
Результаты и их обсуждения
Под действием ВРПК на вторые, а под влиянием пектина на первые сутки эксперимента наблюдается максимальное увеличение количества моноцитов в крови подопытных крыс соответственно в 2,2 и 2,6 раза по сравнению с контролем. С этого же момента нарастает число лимфоцитов в крови экспериментальных крыс и под действием ВРПК на пятые сутки введения превосходит контроль на 21,5 %, а под влиянием пектина на третьи сутки опты - выше контрольных значений на 11,6 %. К восьмым-десятым суткам опыта количество моноцитов и лимфоцитов снижается до уровня контроля.
Введение полисахаридов снижает количество сегментоядерных лейкоцитов. Под влиянием ВРПК количество их ниже контроля на 38,6 %, а под действием пектина численность лейкоцитов в крови подопытных крыс уменьшается на 41,7 % по сравнению с контролем на третий день опыта. Количество сегментоядерных лейкоцитов полностью нормализуется на восьмые-десятые сутки введения полисахаридов.
Оба препарата вызывают появление в крови подопытных животных юных форм лимфоцитов на третьи сутки опыта; на восьмые-десятые сутки опыта кровь животных таких клеток уже не содержала. Полученные данные показаны на рисунках 1, 2.
100%
80
60
40
20
0
гРі гРі [*1
* г* □ м
■ с
£■ Пл
,-г г~Г Г-Т с=
М- моноциты
С- сегментоядерные лейкоциты Л- лимфоциты К- контроль
2, 3, 5, 8- сутки эксперимента
Рис. 1. Изменение клеточного состава крови крыс под действием препарата ВРПК в дозе 0,1 г/кг массы тела.
□ А , .
—Iі [= *1 ТІ Ь гГ . сШ. 1 1*1-ГЇ . [=
к 1 з 5 7 ю
М- моноциты
С- сегментоядерные лейкоциты Л- лимфоциты
К- количества клеток крови в контроль
1, 3, 5, 7, 10- сутки эксперимента
Рис. 2. Изменение клеточного состава крови крыс под влиянием препарата Пектин в дозе 0,1 г/кг массы тела.
Окраска мазков крови метиловым зеленым и пиронином выявила максимальное увеличение содержания РНК в моноцитах и лейкоцитах подопытных крыс.
ВРПК и пектин активируют ферментные системы клеток крови крыс и увеличивают их количество. Полисахариды могут непосредственно активировать ферментные системы клеток крови при взаимодействии с мембранами клеток или при попадании внутрь клеток. Возможно, что повышение функциональной активно-
сти клеток происходит под действием веществ-стимуляторов, выделяемых моноцитами и лимфоцитами, активированными полисахаридами [1, 12, 15, 18] ВРПК и пектин при введении их в организм подопытных животных. Повышение количества РНК в клетках крови свидетельствует об активации синтеза молекул ферментов и молекул-регуляторов под воздействием ВРПК и пектина на первые-вторые сутки опыта, которое затем снижалось до уровня нормы на восьмой-десятый день введения
полисахаридов. В лимфоцитах крови подопытных животных на третьи сутки введения полисахаридов количество РНК максимально, под влиянием ВРПК в 2,3 раза, под действием пектина в 2,1 раза превышает контроль. На восьмые-десятые сутки опыта количество РНК в клетках крови полностью нормализуется.
Количество ферментов миелоперок-сидаз и оксидаз, выявленное окрашиванием мазков крови а-нафтолом и пиро-нином, максимально на третьи сутки введения полисахаридов, особенно в моноцитах и, в несколько меньшей степени, в сегментоядерных лейкоцитах и лимфоцитах. К восьмым-десятым суткам опыта количество миелопероксидаз и оксидаз нормализуется.
Перекисная резистентность образцов крови крыс, получавших ВРПК и пектин, максимально возрастает на третьи сутки введения полисахаридов. При введении ВРПК количество гемолизированных клеток снижается до 18,8 %, а при действии пектина до 24,6 % от уровня гемолиза клеток в контрольных образцах, который
условно принят за 100 %. На пятые-восьмые сутки введения полисахаридов процент гемолизированных клеток повышается до 35,6 % и 57,2 % при введении ВРПК и до 32,8 % и 44,5 % при введении пектина. На десятые сутки введения пектина процент гемолизированных клеток в образцах крови составляет 68,7 % от уровня контроля. Полученные данные представлены в таблице 1.
Добавление полисахаридов в дозах 1-10-4; 1-10-6; 1-10"8 к суспензии мембран эритроцитов здорового донора и к образцам донорской крови показало, что в наибольшей степени от процесса ПОЛ мембраны клеток защищали ВРПК и пектин в дозах 1-10-4 и 1 -10-6. При этом ВРПК по своему защитному действию превосходит контроль (куда добавляли физиологический раствор) в 4,4 раза, а пектин в 3,8 раза.
Препараты гемицеллюлозы А и Б не столь эффективно защищают мембраны клеток от процесса ПОЛ, превосходя контрольные значения всего на 30 % и на 25 % соответственно.
Процент гемолизи- рованных клеток Контроль ВРПК, сутки введения
2 3 5 8
100 % 46,6±0,3% 18,8±0,5% 35,6±0,3% 57,2±0,3%
Пектин, сутки введения
1 3 5 8 10
100 % 58,5±0,2% 24,6±0,2% 32,8±0,3% 44,5±0,4% 68,7±0,5%
100.00% 90.00% -I-80.00%--70.00% -|-60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%
ИЙ
!К
Контроль ВРПС Пектин ГА ГБ
□Доза-1Е-8 ШДоза - 1Е-6 ПДоза - 1Е-4
Рис. 3. Процент гемолиза эритроцитов под действием полисахаридов при пере-кисном окислении in vitro.
Добавление полисахаридов различных групп (и различного происхождения) донника желтого (Melilotus off.) к крови здорового донора в трех концентрациях показало, что все препараты обладают выраженным анти-оксидантным действием, которое зависит от концентрации (дозы) препаратов. Наиболее сильное антиокси-дантное воздействие на мембраны эритроцитов оказывали полисахариды в концентрации 1*10-4. Особенно эффективен был препарат Водораство-
римого полисахаридного комплекса (ВРПК), превосходивший контроль в 5,2 раза и пектин в 3,1 раза. Более слабый эффект проявляли препараты гемицеллюлоз А (Г.А) и Б (Г.Б) - в 2,2;
2,1 раза соответственно. Впрочем, из рис. 4 видно, что ВРПК проявлял свое действие и в более низких концентрациях, превосходя существенно контроль, взятый за 100 %, и другие препараты полисахаридов, что отражает рис. 4. Данные во всех случаях были достоверными (р < 0,01).
700
600
500
400
300
200
100
0
Доза - 1E-8
Доза - 1Е-6 Доза - 1Е-4
■ Контроль ШВРПК □ Пектин ИГА ИГБ
P^. 4. Антиоксидантное действие полисахаридов Донника желтого.
Выводы
1. Введение в организм млекопи-таущего полисахаридов Донника желтого увеличивает количество лимфоцитов в крови под действием ВРПК на 21,5 %, а под действием пектина на 11,6 %, приводит к появлению в крови юных форм лимфоцитов.
2. ВРПК и пектин увеличивают количество моноцитов на первые-вторые сутки опыта соответственно в
2,2 и в 2,6 раза.
3. Препараты повышают количество РНК в 2,3 раза под действием ВРПК и в 2,1 раза под действием пектина, и оксидаз, клеток крови и им-
мунной системы в 2,3 раза превышает контроль под действием ВРПК и под действием Пектина в 2 раза, активируют процессы фагоцитоза.
4. Препарат ВРПК в 5 раз снижает процент гемолизированных клеток, проявляя наибольшее защитное действие на мембраны клеток от процесса перекисного окисления липидов на третий день введения. Препарат пектин повышает перекисную резистентность клеток крови и снижает процент гемолизированных клеток на третьи сутки введения в 4 раза.
5. Защитное действие обоих полисахаридов на мембраны клеток от процесса ПОЛ несколько ослабевает к
восьмым-десятым суткам опыта, но превосходит контроль заметно снижая процент гемолизированных клеток в крови подопытных крыс.
6. Полисахариды обладают выраженным антиоксидантным действием на эритроциты здорового донора, наибольшую активность при этом проявляют ВРПК и пектин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдрашитова Н. Ф., Фархумдинов Р. Р., Загидуллин Ш. З., Камилов Ф. Х. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1998. Т. 125, № 3, с. 297-300.
2. Айрапетянц М. Г., Гусева Н. В. Вестник АМН СССР, 1988, № 1, с. 49-55.
3. Болдырев А. А., Котелевцев С. В., Ла-нио М., Алеварес К., Перес П. Введение в биомембранологию. - М.: Изд-во МГУ, 1990, 208 с.
4. Владимиров Ю. А. Биофизика, 1987. Т. 32, № 5, с. 830-844.
5. Донцов В. И., Сычев И. А., Колосова Т. Ю. Социально-гигиенический мониторинг здоровья населения: Материалы межрегиональной научно-практической конференции. - Рязань: РГМУ, 2000, с. 204-207.
6. Зинчук В. В., Борисюк М. В., Корней-чик В. Н. Бюллетень современной биологии и медицины, 1997, № 9, с. 283286.
7. Лилли Р. Гистологическая техника и
практическая гистохимия. М.: Мир,
1969, с. 685: илл - 94.
8. Рык А. А., Мусселиус С. Г., Давыдов Б.В. Токсикологический вестник, 1996, № 6, с. 5-12.
9. Те же. Токсикологический вестник, 1996, № 4, с. 19-24.
10. Савельева Т. В., Арутюнян А. В. Педиатрия, 1996, № 1, с. 13-16.
11. Сазонова Т. Г., Гусева Н. В., Лисицина Т. А., Архипенко Ю. В., Дурнев А. Д. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, № 4, с. 381-384.
12. Смирнов В. М., Сычев И. А., Колосова Т. Ю. Российский медико-
биологический вестник им. акад. И. П. Павлова, 2002, № 3-4, Рязань: РГМУ, с. 71-76.
13. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. М. Медицина, 1975.
14. Таранова Н. П., Нилова Н. С., Полежаева Л. Н., Ширяева Н. В., Кулагин Д. А., Лопатина Н. Г. Физиологический журнал, 1994, т. 80, № 3, с. 43-49.
15. Тодоров Й. Клинические и лабораторные исследования в педиатрии. София, 1963, с. 322.
16. Трофимов В. А., Власов А. П. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1997, № 9, с. 283-286.
17. Хышиктуев Б. С., Хышиктуева Н. А., Иванов В. Н. Клиническая лабораторная диагностика, 1996, № 3, с. 13-15.
18. Швецова М. М., Барботько А. А., Лукь-янчиков Г. Ф., Охотников Р. И., Лукьянов В. Д. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1998, Т. 125, № 2, с. 197-200.
THE INFLUENCE OF POLYSACCHARIDES OF YELLOW MELITOT ON BLOOD CELLULAR MEMBRANES ON LIPID OXIDATION
I.A. Sychev, G.V. Porjadin, V.M. Smirnov, T.J. Kolosova
Polysaccharides (water soluble polysaccharide complex, pectin, hemicelluloses A and B) were isolated from yellow melitot by sequential extraction. Polysaccharides added in the suspension of erythrocytes of the healthy donor and introduced in the body of other animals were shown to protect membrane lipids from destruction under the condition of initiation of the lipid oxidation process.
