CC BY
44
© Сычев И.А., 2004
УДК 615.322:547.458].015.4
ВЛИЯНИЕ ПОЛИСАХАРИДА ВРПК ДОННИКА ЖЕЛТОГО НА НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЖИВОТНЫХ
И.А. Сычев
Институт Развития Образования, г. Рязань,
Российский Государственный Медицинский Университет, г. Москва
Полисахарид донника желтого ВРПК (Водорастворимый полисахаридный комплекс), являясь неспецифическим антигеном увеличивает уровень макроглобулинов в плазме крови, стимулирует лимфопоэз и фагоцитоз, повышает активность ферментов фагоцитов. Под действием ВРПК изменяется масса и клеточный состав лимфоидных органов.
Состояние организма и направленность протекающих в нем процессов контролируется взаимодействием трех систем: иммунной, нервной и гормональной [7, 8, 9, 10]. В связи с общим ухудшением экологической ситуации поиск различного рода биологически активных соединений природного происхождения, стимулирующих функции иммунной системы, задача весьма актуальная. Такими веществами являются, в частности, полисахариды растительного происхождения, которые не оказывают каких-либо побочных эффектов, не токсичны и апирогенны и благоприятно воздействуют на некоторые функции иммунной системы [1, 2, 3, 7]. Известно, что полисахариды, выделенные из растений донника желтого, обладают противовоспалительным и ан-тиоксидантным действием, усиливают процессы фагоцитоза in vitro, защищают клетки крови от разрушения, активируют их ферментные системы, стимулируют процессы кроветворения, увеличивают число антителообразующих клеток в лимфоидных органах [7, 10].
В этой связи интересно более подробно изучить действие биологически активных полисахаридных комплексов ВРПК (водорастворимый полисахарид-
ный комплекс), полученных из растений донника желтого (Melilotus off), на некоторые функции иммунной системы здоровых животных.
Материалы и методы
Полисахарид ВРПК экстрагировали из высушенных растений донника жёлтого горячей водой в течение 1,5 часов на кипящей водяной бане два раза. Полученные экстракты объединяли, упаривали и полисахарид осаждали избытком 96% этанола. Полученное вещество очищали переосаждением, смесью этанола и эфира, этанолом как указано в работе [10]. Полученный полисахарид растворяли в физиологическом растворе, получая 10% рабочий раствор. Для работы использовали здоровых крыс самцов породы Вистар массой от 150 до 250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Препарат давали животным один раз в сутки через рот в дозе 0,1 г/кг в течение 8 суток. Контрольные животные получали физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и экспериментальные.
У животных, получавших ВРПК на 2, 3, 5, 8 сутки для исследования брали: кровь, лимфоидные органы и костный мозг.
В крови животных определяли: 1) количество лимфоцитов, моноцитов, лейкоцитов, 2) соотношения Т- и В-лим-фоцитов методом прямого и непрямого розеткообразования, 3) активность фагоцитоза по методу Гамбургера и Райта, 4) соотношения а2-, Р-, у-глобулинов в плазме крови хроматографическим методом.
Исследовали изменения структуры селезенки, тимуса и костного мозга на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином.
Мазки крови и препараты органов окрашивали смесью метилового зеленого и пиронина с целью выявления РНК в клетках, которая окрашивается при этом в различные оттенки красного (от пурпурного до красно-фиолетового). Мазки крови и препараты органов окрашивали смесью а- нафтола и пиронина для выявле-
ния ферментов оксидаз в клетках. При этом структуры, содержащие оксидазы, окрашиваются в различные оттенки синего цвета [4, 5, 6].
Результаты и их обсуждение
Под действием ВРПК на вторые сутки эксперимента наблюдается максимальное увеличение моноцитов в крови подопытных крыс в 3 раза по сравнению с контролем. С этого же момента нарастает число лимфоцитов в крови экспериментальных животных, и под действием ВРПК на пятые сутки введения препарата оно максимально превосходит контроль (на 21,5%). В последующее время количество моноцитов и лимфоцитов несколько снижается и к восьмым-десятым суткам достигает уровня показателей контрольных крыс (рис. 1).
М- % моноцитов.
С - % сегментоядерных лейкоцитов.
Л - % лимфоцитов.
К - % количества клеток крови в контроле.
2, 3, 5, 8 - сутки эксперимента.
Рис. 1. Изменение клеточного состава крови крыс под действием препарата ВРПК в дозе 0,1 г/кг массы тела.
Введение полисахарида снижает численность сегментоядерных лейкоцитов. Под действием препарата ВРПК этот показатель минимален на пятые сутки опыта и ниже контрольных значений на 38,57%. Численность сегментоядерных лейкоцитов крови восстанавливается до уровня контроля соответственно на восьмые сутки введения ВРПК.
Препарат вызывает появление в крови юных форм лимфоцитов на третьи сутки опыта. Количество этих клеток максимально на пятые сутки введения ВРПК, и такие клетки все еще обнаруживаются на восьмые сутки опыта.
На десятые сутки кровь экспериментальных животных не содержала юных форм лимфоцитов.
Окраска мазков крови метиловым зеленым и пиронином выявила максимальное содержание РНК в 2,1 раза под действием ВРПК в моноцитах подопытных крыс на первые-вторые сутки опыта, которое затем снижалось до уровня нормы на восьмые-десятые сутки. В лимфоцитах крови животных, получавших полисахарид, количество РНК становится максимальным на третьи сутки опыта, превышая контрольные значения в 2,3 раза, и начиная с пятого дня эксперимента снижается до нормы на восьмые сутки.
Количество ферментов оксидаз в клетках крови подопытных крыс, выявленное окрашиванием мазков крови а-нафтолом и пиронином становится максимальным на третьи сутки введения препарата особенно в моноцитах и превосходит контрольные значения на 42%, в несколько меньшей степени в сегментоядерных лейкоцитах, и в лимфоцитах, превосходя контрольные показатели соответственно на 40,5% и 38,6%. На пятые сутки количество ок-сидаз снижается и к восьмым суткам
опыта возвращается к уровню контрольных значений.
Выделение лимфоцитов из крови животных, их разделение на фракции методом прямого и непрямого розетко-образования с эритроцитами барана на холоду показало, что введение обоих препаратов способствует увеличению количества В-лимфоцитов в крови подопытных животных. Препарат ВРПК на третьи сутки введения увеличивает их число на 12,5%.
Общее количество Т-лимфоцитов в крови крыс, получавших полисахарид, увеличивается по сравнению с количеством клеток у контрольных животных на третьи сутки введения на 12,1% после введения ВРПК. И медленно снижается, но все еще на несколько процентов превосходит контрольные показатели на восьмые сутки опыта. Численность Т-хелперов возрастает максимально на третьи сутки и превышает контрольные значения в случае введения ВРПК на 14,2%. Затем происходит постепенное снижение количества Т-хелперов до уровня контроля на восьмые сутки эксперимента. Максимальное уменьшение числа Т-супрессоров под действием ВРПК отмечено на третьи сутки опыта с 11% до 5%. Восстановление числа Т-супрессоров происходит в случае введения полисахарида на восьмые сутки опыта.
Процент фагоцитоза клеток крови под влиянием полисахарида достигает максимума на третьи сутки эксперимента. Введение ВРПК увеличивает количество фагоцитирующих клеток в сравнении с контролем на 12%. Затем уменьшается численность микрофагов (сегментоядерных клеток) в крови подопытных животных и потому снижается процент фагоцитоза и макрофагов, становясь ниже контроля на 14% на пятый день опыта. На восьмые сутки введения
препарата этот показатель крови подопытных крыс восстанавливается до уровня контрольных значений.
Фагоцитарное число также максимально на третьи-пятые сутки введения полисахарида и в 2 раза превосходит соответствующий показатель в крови контрольных крыс, что связано с активацией ферментных систем лейкоцитов
соответствующей максимальной интенсивности проявления окраски выявляющей оксидазы в мазках крови. Активность оксидазных ферментов на третьи сутки опыта под действием ВРПК в 2,3 раза превышает контроль на пятые сутки эксперимента. Полученные данные представлены в табл. 1.
Таблица 1
Изменение некоторых иммунологических показателей крови здоровых животных под действием ВРПК
Препарат и его доза % Т-розетко-образующих % Т-хелперов % Т-супрес- соров % В-лимфоцитов % фагоцитоза Фагоци- тарное число
Контроль 55,10± 0,11 44,12±0,31 11,2±0,3 26,2±0,2 60,66± 0,31 4,1±0,3
ВРПК 2 дозы 64,67± 0,37 55,26±0,37 5,49±0,42 33,42±0,46 72,25± 0,34 8,81± 0,23
ВРПК 3 дозы 66,87± 0,23 57,62± 0,12 9,25± 0,34 34,89± 0,11 73,64± 0,43 9,11± 0,37
ВРПК 5 доз 62,51± 0,54 52,49± 0,24 7,64±0,24 25,14± 0,27 56,14± 0,41 8,35± 0,12
ВРПК 8 доз 62,37± 0,27 50,24± 0,33 12,13± 0,14 30,11± 0,45 62,27± 0,14 6,19± 0,11
Р<0,01.
В плазме крови увеличивается количество а2-макроглобулинов под действием ВРПК на вторые сутки эксперимента на 55,6% по сравнению с контролем. Затем уровень этих регуляторных белков восстанавливается до уровня контроля.
На вторые сутки опыта полисахарид ВРПК снижает в плазме крови фракцию Р-макроглобулина на 13,27% по сравнению с контролем. Эти показатели достигают контрольного уровня на восьмые сутки под действием препарата ВРПК.
Уровень у-глобулиновой фракции под действием полисахарида увеличивается и достигает наибольшего значе-
ния под влиянием ВРПК на пятые сутки, превосходя контроль на 52,79%. Под влиянием ВРПК уровень у-гло-булинов на восьмые сутки снижается, но всё ещё превосходит контроль на 29,73%. Полная динамика этих процессов показана в табл. 2.
Изменения количества клеток и регуляторных белков в крови экспериментальных животных отражают изменения клеточности и структуры костного мозга, тимуса и селезенки.
Клеточность костного мозга нарастает у животных, получающих полисахарид, начиная с первого дня эксперимента, в 1,6 раза под действием ВРПК. Это выражается в увеличении
количества эритроцитов, лимфоцитов, моноцитов в периферической крови. В селезенке и костном мозге крыс увеличивается количество мегакариоци-тов. Динамика выработки и выхода в кровь различных клеток не одинакова,
но в общем клеточность костного мозга, тимуса и селезенки достигает максимума на пятые сутки опыта, несколько снижаясь на восьмой день эксперимента.
Таблица 2
Динамика изменений некоторых белковых фракций сыворотки крови крыс под действием препарата ВРПК
Препарат и его доза мг/% а2-макроглобулина мг/% Р-макроглобулина мг/% у-глобулина
Контроль 2 дозы ВРПК 3 дозы ВРПК 5 доз ВРПК 8 доз ВРПК 12,65±0,18 19,65±0,41 12,86±0,36 12,75±0,53 12,15±0,22 17,87±0,34 15,51±0,24 18,42±0,12 18,17±0,31 19,97±0,42 9,15±0,23 11,65±0,42 12,53±0,14 13.98±0,52 11,87±0,23
Р<0,01.
Окраска срезов селезенки метиловым зеленым и пиронином показала наибольшее количество РНК на первые-вторые сутки опыта под действием полисахарида в макрофагах, на третьи, пятые сутки в макрофагах и лимфоцитах (лимфобластах). На восьмые сутки опыта интенсивность окраски снижается, но она все-таки более заметна, чем в контроле (под влиянием ВРПК).
В структуре селезенки подопытных крыс увеличивается число вторичных фолликулов, появляются первичные фолликулы. На третьи сутки опыта обнаруживается, что во вторичных фолликулах мантийный слой, центры размножения очень плотно заполнены клетками. Очень сильно возрастает количество клеток в Т-зависимой зоне белой пульпы, особенно на границе между Т- и В-зонами. На третьи сутки и, особенно на пятые сутки опыта, появляется много “розеток”, состоящих из центрального макрофага и лимфоцитов, его окружающих, увеличивается число плазма-
тических клеток. На восьмые сутки введения полисахарида клеточность селезенки несколько уменьшается, снижается количество вторичных фолликулов, “розеток”, плазматических
клеток. Но все эти показатели выражены в большей степени, чем у контрольных животных.
В структуре костного мозга уже на первые сутки опыта увеличивается общая клеточность. Она становится максимальной на пятые-восьмые сутки опыта, когда количество эритробла-стических островков костного мозга в 1,5-2 раза превосходит количество эритробластических островков в костном мозге контрольных крыс. Количество клеток лимфоидного ряда на третьи-пятые сутки возрастает максимально ив 1,5-2 раза выше, чем в контроле. Количество лейкоцитов минимально на третьи-пятые сутки опыта в костном мозге подопытных животных. Но уже на восьмые сутки опыта под действием ВРПК эти изменения приближаются к контрольным.
Выводы
1. Введение в организм млекопитающего полисахаридов Донника желтого (ВРПК - неспецифического, достаточно слабого антигена) вызывает Т-зависимый иммунный ответ.
2. Полисахарид ВРПК стимулирует процесс лимфопоэза, увеличивая клеточность костного мозга и лимфоидных органов в 1,6 раза.
3. Препарат ВРПК повышает количество РНК в 2,3 раза, активирует ок-сидазы в клетках крови и иммунной системы, в 2,3 раза превышая контроль, стимулирует процесс фагоцитоза.
4. Под действием ВРПК увеличивается количество у-глобулина на 40%, а2-макроглобулинов на 52% и Р-макроглобулинов на 15%, содержащих в своем составе лимфокины и другие факторы активации клеток иммунной системы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Донцов В.И., Кобелева Г.Ю., Сычев И.А. // Медико-биологические вопросы нормального и патологического старения: Сб. тез. Всерос. конф. - М., 1993. -С.111.
2. Донцов В.И., Подколзин А.А., Сычев И. А. // Медико-биологические вопросы
нормального и патологического старения: Сб. тез. Всерос. конф. - М., 1993. -С.112.
3. Донцов В.И., Сычев И.А., Колосова Т.Ю. // Социально-гигиенический мониторинг здоровья населения: материалы науч.-практ. конф. - Рязань, 2000. -С. 204-207.
4. Комаров Ф.И. Биохимические исследования в клинике / Ф. И. Комаров, Б. Ф. Коровкин, В.В. Меньшиков. - М.: Медицина, 1984. - 407с.
5. Лилли Р. Гистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли. -М.: Мир, 1969. - 685с.
6. Иммунология: практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод, В.К. Позур, М.Е. Вихоть. -К.: Высшая шк. Изд-во при Киевском ун-те, 1989. - 304с.
7. Подколзин А.А., Донцов В.И., Сычев И.А. и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1996. - №6. - С.661-663.
8. Сапин М.Р. Иммунная система человека / М.Р. Сапин, Л.Е. Этинген. - М.: Медицина, 1996. - 304с.
9. Смирнов В.М., Сычев И.А., Колосова Т.Ю. // Биохимия на рубеже XXI века: Межрегион. сб. науч. тр. - Рязань, 2000. - С.505-509.
10. Сычев И. А. Биохимическая активность полисахаридов Донника желтого: Авто-реф. дис. ... канд. биол. наук / И.А. Сычев. - М., 1995.
THE INFLUENCE OF POLYSACHARIDES MELILOTUS OFF ON SOME RELATION IMMUNITY SYSTEM OF HEALTHY ANIMALS
Y.A. Sytchev
Polysacharides increuse the level of globulins in blood plasma, change the correlation between different classes of lymphocytes, stimulate phagocytosis and fermentative activity of cells in immune system. The action of polysacharides changes mass and cell-composition lymphatic organs.
