CC BY
33
-> - Аграрный вестник Урала № 11 (117), 2013 г. - ■ Щ^ф
_Ветеринария
УДК 619
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВ НА СВОЙСТВА
STR. EQUISUBSP. ZOOEPIDEMICUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЛОШАДЕЙ
Э. М. МЕШЕВ,
кандидат ветеринарных наук, доцент, старший преподаватель, старший научный сотрудник, Кабардино-Балкарский государственный аграрный университет имени В. М. Кокова, Кабардино-Балкарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии
(360000, г. Нальчик, пр. Ленина, д. 1в; e-mail: kbgsha@rambler.ru; 360024, г. Нальчик, ул. Мечникова, д. 130а; тел.: 8 (8662) 77-33-94),
Х. К. АМШОКОВ,
заведующий, старший научный сотрудник, Кабардино-Балкарский опорный пункт Всероссийского научно-исследовательского института коневодства,
Кабардино-Балкарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии
(360004, г. Нальчик, ул. Кирова, д. 224; e-mail: kbniish2007@yandex.ru; 360024, г. Нальчик, ул. Мечникова, д. 130а; тел.: 8 (8662) 77-33-94)
Ключевые слова: вид стрептококка Str. equi subsp. zooepidemicus, поражение респираторного тракта, сополимеры диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом и диалилгуанидинацетата, бактерицидное действие.
Стрептококки, выделенные от лошадей, теряли способность к росту на питательных средах, в связи с нарушением целостности клеточной стенки после контакта с сополимером диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом, а в случае с диалилгуанидинацетатом сохраняли способность к росту, но изменяли некоторые свойства. Полученные данные позволяют считать, что сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом обладает биоцидностью для Str. equi subsp. zooepidemicus. Отчетливо проявляется нарушение целостности клеточной стенки, обусловленное химическим взаимодействием с компонентами клеточной стенки, приводящее к увеличению порозности и их разрыву. Проведенные ранее исследования, касающиеся взаимодействия полимеров с эритроцитами и бактериальными клетками, показали, что некоторые полимеры быстро связываются с клеточной стенкой и цитоплазма-тической мембраной, а затем уже проникают в цитоплазму и ядерное вещество клетки. Увеличивается проницаемость клеточной мембраны как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ. Катионный полиэлектролит диалилгуанинацетат также оказывает влияние на культуральные, биохимические и патогенно-вирулентные свойства Str. equi subsp. zooepidemicus, выделенных от лошадей, нарушая его ферментативную систему и структуру клеточной стенки. Однако оно не приводит к гибели стрептококковых клеток, как в случае с сополимером диалилдиметилам-монийхлорида с диалилгуанидинацетатом. Str. equi subsp. zooepidemicus довольно часто изолируется от лошадей с признаками респираторных инфекций. Сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом обладает бактерицидным действием связаным с нарушением целостности клеточной стенки Str. equi subsp. zooepidemicus, приводящее к изменению ее формы, а также нарушению проницаемости и разрыву. Диалилгуанинацетат оказывает влияние на культуральные, биохимические и патогенно-вирулентные свойства Str. equi subsp. zooepidemicus, однако при этом не вызывает их гибели.
EFFECTS ON THE PROPERTIES OF POLYMERS
STR. EQUI SUBSP. ZOOEPIDEMICUS, ISOLATED FROM HORSES
E. M. MESHEV,
candidate of veterinary science, associate professor, senior lecturer, senior research fellow, Kabardino-Balkaria state agrarian university of V. M. Kokov, Kabardino-Balkar scientific research Institute of Agriculture agricultural sciences
(360000, Nalchik, Lenina pr., 1b; е-mail: kbgsha@rambler.ru; 360024, Nalchik, Mechnikov st., 130a; phone: 8 (8662) 77-33-94)
H. K. AMSHOKOV,
head of department, senior research fellow, Kabardino-Balkaria stronghold of All-Russian scientific research Institute of horse breeding, Kabardino-Balkar scientific research Institute of Agriculture agricultural sciences
(360004, Nalchik, Kirov st., 224; e-mail: kbniish2007@yandex.ru; 360024, Nalchik, Mechnikov st., 130a; phone: 8 (8662) 77-33-94)
Keywords: Streptococcus species Str. equi subsp. zooepidemicus, respiratory failure, copolymers with dialildimetilam-monychloride dialilguanidinatsetatom dialilguanidinatsetata and bactericidal.
A streptococci isolated from horses lost their ability to grow on nutrient media, in connection with the violation of the integrity of the cell wall after contact with the copolymer dialildimetilammonychloride with dialilguanidinatsetatom, and in the case of dialilguanidinatsetatom retained the ability to grow, but changed some of the properties. The data obtained suggest that the copolymer with dialilguanidinatsetatom with biocidal for Str. equi subsp. zooepidemicus. Clearly shows loss of integrity of the cell wall due to chemical interaction with components of the cell wall, resulting in increased porosity and rupture. Earlier studies on the interaction of the polymers with erythrocytes and bacterial cells, have shown that some polymers rapidly bound to the cell wall and cytoplasmatic membrane, and then penetrate into the cytoplasm of cells and nuclear matter. Increases cell membrane permeability for low-molecular and high-molecular substances. The cationic polyelectrolyte dialilguaninatsetat also has an impact on culture, biochemical and pathogenic virulence Str. equi subsp. zooepidemicus, isolated from horses, breaking its enzyme system and the structure of the cell wall. However, it leads to loss of streptococcal cells as in the case of a copolymer dialilguanidinatsetatom. Str. equi subsp. zooepidemicus often isolated from horses with signs of respiratory infections. Copolymer dialilguanidinatsetatom has a bactericidal action associated to the violation of the integrity of the cell wall Str. equi subsp. zooepidemicus, which leads to a change in its form, as well as violation of the permeability and tear. Dialilguaninatsetat impact on culture, biochemical and pathogenic virulence Str. equi subsp. zooepidemicus, but it does not cause their death.
Положительная рецензия представлена А. М. Биттировым, доктором биологических наук, заведующим кафедрой ветеринарной медицины Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета имени В. М. Кокова.
► - Аграрный вестник Урала № 11 (117), 2013 г. - > Ц^ф
Ветеринария
Стрептококки весьма широко распространены в природе и вызывают ряд сложных патологических состояний у человека и животных. Вызываемые стрептококками патологические состояния можно отнести к так называемым факторным инфекциям [2], для которых характерно длительное пребывание возбудителя, как в организме, так и в популяции хозяев. Такое пребывание возбудителя в популяции обусловливает отбор антибиотикоустойчивых рас микроорганизмов, формирующийся на протяжении жизни многих поколений хозяев [3]. Существующие методы профилактики и лечения патологических состояний, обусловленных этими микроорганизмами, существенно затруднены в связи с биологическими свойствами стрептококков, снижения эффективности используемых препаратов, а также характером их взаимоотношений с организмом хозяев.
Для решения этих задач перспективным представляется использование полимеров, которые в силу своей химической природы, открывают перспективу создания биоцидных препаратов, оказывающих комбинированное воздействие на бактериальную клетку. Нерастворимость в воде ограничивает возможность использования некоторых веществ в качестве биоцид-ных средств. При использовании же в качестве носителей водорастворимых полимеров этот недостаток в значительной степени устраняется. При этом утрачивается вредное воздействие на клетки и ткани био-цидного вещества, при полном сохранении его антимикробной активности [1, 4].
Нами были проведены опыты по изучению влияния сополимера диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом (70 : 30) и диалилгуани-нацетата на клеточную стенку стрептококков, выделенных от лошадей с признаками поражения респираторного тракта. Выделенные культуры стрептококков вызывали на кровяном агаре (5 % эритроцитов барана) выраженный ß-гемолиз, не росли при 10 и 45 °C, в бульоне с 6,5 % хлорида натрия и в бульоне с 40 % желчи, не выдерживали нагревания при 60 °С в течение 30 минут, не расщепляли гиппурат натрия, не ферментировали маннит и инулин. При внутрибрю-шинном заражении стрептококки вызывали гибель белых мышей и в реакции латексагглютинации были отнесены к серологической группе С-стрептококков. На МПБ с 1 % глюкозы для культур был характерен пристеночный рост с образованием хлопьевидного осадка. В соответствии с Facklam [5] на основании дезаминирования аргинина, гидролиза крахмала, образования кислоты из сорбита, а в некоторых случаях и из трегалозы были идентифицированы как Str. equi subsp. zooepidemicus. Диалилгуанинацетат и сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуани-динацетатом вносили в бульонную культуру стрептококка. В дальнейшем проводили пересев из опытных пробирок в стерильный бульон с целью выяснения изменений культуральных свойств стрептококков. Отмытые трехкратно стерильным физиологическим раствором клетки стрептококков из опытных пробирок фиксировали на подложку из слюды. Визуализацию поверхности бактериальных клеток осуществляли в полуконтактном и контактном режимах на атомно-си-ловом микроскопе Solver Pro-47 в лаборатории нано-зондовых исследований Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета. В качестве
зонда был использован кантилевер NGS-10 с острием из нитрида кремния, механическая жесткость кантилеверов составляла 0,06 и 0,12 н/м. Величина силы взаимодействия между острием и исследуемой поверхностью составляла 10-9 Н.
Результаты исследований.
Всего в опытах по выделению стрептококков было исследовано 72 пробы носовых смывов от лошадей кабардинской породы различного возраста с признаками респираторных инфекций. В 54 (75,0 %) пробах были обнаружены стрептококки, из которых 37 (0,69 %) были идентифицированы как Str. equi subsp. zooepidemicus. На основании этих результатов можно считать, что данный вид стрептококка является одним из наиболее важных патогенов респираторного тракта лошадей. Исходя из этого, в дальнейшем нами были проведены опыты по изучению влияния полимеров именно на стрептококках этого вида.
Через 24 часа инкубирования в среде с сополимером диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуани-динацетатом были проведены пересевы стрептококков в стерильный бульон и на МПА с 5 % эритроцитов барана для выяснения его биоцидности. При этом во всех случаях отмечалось отсутствие роста в МПБ и на кровяном агаре в течение 72 часов. Визуализация клеточной стенки методом атомно-силовой микроскопии позволила установить нарушения целостности клеточной стенки. Характерным для стрептококков, пребывавших в контакте с сополимером, было отсутствие длинных или коротких цепочек. Микробные клетки, как правило, располагались парами или одиночно. Конфигурация кокков была изменена и имела форму овоидов. Кокки были несколько увеличены в сравнении с исходными культурами. Нами отмечено, что после контакта с сополимером диа-лилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинаце-татом, клетки стрептококков практически не окрашивались по Граму.
В опытах с диалилгуанинацетатом пересеянные из опытных пробирок культуры стрептококков через 24 часа после контакта с полимером сохраняли определенную способность к диффузному росту. Однако, выросшие культуры не обладали свойствами исходных штаммов. Так, они не были патогенными для белых мышей при внутрибрюшинном заражении высокими дозами. Кроме того, выросшие культуры не вызывали гемолиза эритроцитов на кровяном агаре. Окрашивание по Граму при этом также было затруднено. Многократные пересевы культур не приводили к восстановлению исходных свойств стрептококков. Тем не менее, мы и сейчас не исключаем восстановления некоторых из них в последующие сроки. Известно, что диалилгуанинацетат относится к катион-ным полиэлектролитам, ключевым моментом в механизме действия которых на биологические мембраны является электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными фосфолипидами и белками, локализованными в ней. Следствием этого является нейтрализация заряда мембраны и клетки в целом, а также изменение соотношения гидрофобных и электростатических взаимодействий, стабилизирующих мембрану [4].
Полученные нами данные позволяют считать, что сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диа-лилгуанидинацетатом обладает биоцидностью для
-> - Аграрный вестник Урала № 11 (117), 2013 г. -«ССС^1
Ветеринария
Str. equi subsp. zooepidemicus. При этом отчетливо проявляется нарушение целостности клеточной стенки, обусловленное химическим взаимодействием с компонентами клеточной стенки, приводящее к увеличению порозности и их разрыву. Проведенные ранее [4] исследования, касающиеся взаимодействия полимеров с эритроцитами и бактериальными клетками, показали, что некоторые полимеры быстро связываются с клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной, а затем уже проникают в цитоплазму и ядерное вещество клетки. При этом увеличивается проницаемость клеточной мембраны как для низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ [6].
Катионный полиэлектролит диалилгуанинацетат также оказывает влияние на культуральные, биохимические и патогенно-вирулентные свойства Str. equi subsp. zooepidemicus, выделенных от лошадей, нарушая его ферментативную систему и структуру
клеточной стенки. Однако оно не приводит к гибели стрептококковых клеток, как в случае с сополимером диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуаниди-нацетатом. На основании проведенных исследований нами сделаны следующие выводы:
1. Str. equi subsp. zooepidemicus довольно часто изолируется от лошадей с признаками респираторных инфекций;
2. Сополимер диалилдиметиламмонийхлорида с диалилгуанидинацетатом обладает бактерицидным действием связаным с нарушением целостности клеточной стенки Str. equi subsp. zooepidemicus, приводящее к изменению ее формы, а также нарушению проницаемости и разрыву;
3. Диалилгуанинацетат оказывает влияние на культуральные, биохимические и патогенно-вирулентные свойства Str. equi subsp. zooepidemicus, однако при этом не вызывает их гибели.
Литература
1. Афиногенов Г. Е., Панарин Е. Антимикробные полимеры. СПб. : Гиппократ, 1993.
2. Джупина С. И. Эпизоотический процесс и его контроль при факторных инфекционных болезнях. М. : Изд-во РУДН, 2000.
3. Покровский В. И., Брико Н. И., Ряпис Л. А. Стрептококки и стрептококкозы. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2006. 544 с.
4. Хаширова С. Ю. Новые биоцидные гуанидинсодержащие полимеры : дисс. ... канд. хим. наук. М., 2002.
5. Facklam R. What happened to the Streptococci : overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol. 15. № 4.
6. Panarin E. F. 26 Microsymposium on Macromolecules Polymers in medicine and Biology. Prague, 1984. P. 87.
References
1. Afinogenov G. E., Panarin E. Antimicrobial polymers. St. Petersburg : Hippocrates, 1993.
2. Dzhupina S. I. Epizootic process and its control by the factor of infectious diseases. M. : Publishing House of the Peoples' Friendship University, 2000.
3. Pokrovsky V. I., Briko N. I., Ryapis L. A. Streptococci and streptokokkoza. M. : GEOTAR Media, 2006. 544 p.
4. Khashirova S. Y. New biocidal guanidine-containing polymers : diss. ... candidate. chem. science. M., 2002.
5. Facklam R. What happened to the Streptococci : overview of taxonomic and nomenclature changes. Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol. 15. № 4.
6. Panarin E. F. 26 Microsymposium on Macromolecules Polymers in medicine and Biology. Prague, 1984. P. 87.
