Научная статья на тему 'Повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании'

Повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
302
56
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ / TISSUE ENGINEERING / АДГЕЗИЯ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК / CELLS ADHESION AND PROLIFERATION / ДИНАМИЧЕСКОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ / DYNAMIC CULTIVATION / БИОДЕГРАДИРУЮЩИЕ МАТЕРИАЛЫ / BIODEGRADABLE MATERIALS / ПОВЕРХНОСТНЫЕ СВОЙСТВА МАТЕРИАЛОВ / MATERIAL SURFACE PROPERTIES / БИОДЕГРАДИРУЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ / КЛЕТОЧНАЯ ПРОЛИФЕРАЦИЯ / CELL PROLIFERATION / КЛЕТОЧНАЯ АДГЕЗИЯ / CELL ADHESION / ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ / EPITHELIAL CELLS / СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ / STROMAL CELLS

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Люндуп А. В., Демченко А. Г., Тенчурин Т. Х., Крашенинников М. Е., Клабуков И. Д.

Адгезия и пролиферация эукариотических клеток отличается крайне высокой чувствительностью к внешним условиям культивирования, составу культуральной среды, поверхностным свойствам материалов и другим параметрам. Целью настоящей работы было повышение эффективности заселения разработанных биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками. Проведено исследование ряда перспективных для тканевой инженерии полимеров: поликапролактона, диацетата целлюлозы, сополимеры L-полилактида с полигликолидом и сополимера L-полилактида c поликапролактоном. Методом электроформования получены матриксы пористостью от 79 до 95% и средним диаметром волокон от 0,44 до 14,5 мкм. Предложен способ заселения трехмерных конструкций с использованием вращения закрытой культуральной ячейки с неадгезивными стенками. Выбраны матриксы из нетоксичных полимеров с оптимальной пролиферацией культур фибробластоподобных 3T3/NIH и эпителиальных клеток MCF-7 для дальнейших исследований по созданию матриксов-носителей тканеинженерных конструкций с многослойным клеточным компонентом.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Люндуп А. В., Демченко А. Г., Тенчурин Т. Х., Крашенинников М. Е., Клабуков И. Д.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Improving the seeding effectiveness of stromal and epithelial cell cultures in biodegradable matrixes by dynamic cultivation

Adhesion and proliferation of eucariotic cells are charac-terizated by high sensibility to the cultivation conditions, cell mediums, material surface properties, et al. The aim of this study was to improve seeding of stromal and epithelial cells on biodegradable matrices. We tested several polymers perspective for regenerative medicine: polycaprolacton, cellulose diacetate, PLGA, PLA/polycaprolacton. Electrospinning forming membranes had different porousity and fiber sizes. We developed a new method for 3D-matrix seeding with the use of rotation of scaffolds with cells. Based on optimal proliferation activity of the 3T3/NIH and MCF-7 cells we have chosen the scaffold compositions for multilayered cells seeding.

Текст научной работы на тему «Повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании»

повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании

А.В. Люндуп 1, А.Г. Демченко 1, Т.Х. Тенчурин 2, М.Е. Крашенинников 1, И.Д. Клабуков 1,

А.Д. Шепелев 2, В.Г. Мамагулашвили2, Р.В. Оганесян 1, А.С. Орехов 2, С.Н. Чвалун 2, Т.Г. Дюжева 1

1 Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины, Москва, Россия

2Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия

Improving the seeding effectiveness of stromal and epithelial cell cultures in biodegradable matrixes by dynamic cultivation

A.V. Lyundup1, A.G. Demchenko 1, T.H. Tenchurin 2, M.E. Krasheninnikov1,1.D. Klabukov1, A.D. Shepelev 2, V.G. Mamagulashvili2, R.V. Oganesyan 1, A.S. Orehov 2, S.N. Chvalun 2, T.G. Dyuzheva 1 11.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Institute for Regenerative Medicine, Moscow, Russia

2 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia

Адгезия и пролиферация эукариотических клеток отличается крайне высокой чувствительностью к внешним условиям культивирования, составу культуральной среды, поверхностным свойствам материалов и другим параметрам. Целью настоящей работы было повышение эффективности заселения разработанных биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками.

Проведено исследование ряда перспективных для тканевой инженерии полимеров: поликапролактона, диацетата целлюлозы, сополимеры L-полилактида с полигликолидом и сополимера L-полилактида c поликапролактоном. Методом электроформования получены матриксы пористостью от 79 до 95% и средним диаметром волокон от 0,44 до 14,5 мкм. Предложен способ заселения трехмерных конструкций с использованием вращения закрытой культураль-ной ячейки с неадгезивными стенками. Выбраны матриксы из нетоксичных полимеров с оптимальной пролиферацией культур фибробластоподобных 3T3/NIH и эпителиальных клеток MCF-7 для дальнейших исследований по созданию матриксов-носителей тканеинженерных конструкций с многослойным клеточным компонентом.

Ключевые слова: тканевая инженерия, адгезия и пролиферация клеток, динамическое культивирование, биодеградирующие материалы, поверхностные свойства материалов.

введение

Использование тканеинженерных конструкций в экспериментальных и клинических исследованиях является более успешным при реализации принципа биомиметичности: создании многослойных структур и имитации естественной микросреды [1]. Для создания полых трубчатых органов (по классификации Э. Аталы — второй уровень сложности для конструирования [2]) применяют 3й-конструкции, состоящие из внутреннего эпителиального слоя, среднего — глад-комышечного и наружного — соединительнотканной волокнистой оболочки. При создании многослойной конструкции общего желчного протока (ОЖП) будет достаточно использовать только эпителиальные и стромальные клетки, так как гладкомышечные встречаются, в основном, только в верхней части ОЖП и около сфинктера Одди [3]. Известно, что для оптимальной пролиферации эпителиальных и стромальных клеток необходимо подбирать наилучшие параметры поверхностей матрикса-носителя [4]. Важным фактором достижения положительного эффекта является способ культивирования, направленный на повышение эффективности заселения матрикса клетками.

e-mail: [email protected]

Adhesion and proliferation of eucariotic cells are charac-terizated by high sensibility to the cultivation conditions, cell mediums, material surface properties, et al. The aim of this study was to improve seeding of stromal and epithelial cells on biodegradable matrices. We tested several polymers perspective for regenerative medicine: polycaprolacton, cellulose diacetate, PLGA, PLA/polycaprolacton. Electrospin-ning forming membranes had different porousity and fiber sizes. We developed a new method for 3D-matrix seeding with the use of rotation of scaffolds with cells. Based on optimal proliferation activity of the 3T3/NIH and MCF-7 cells we have chosen the scaffold compositions for multilayered cells seeding.

Keywords: tissue engineering, cells adhesion and proliferation, dynamic cultivation, biodegradable materials, material surface properties.

Существующие методы культивирования разделяют на статичные (пассивные, гравитационные), при которых происходит осаждение клеток под воздействием силы тяжести, и динамические, основанные на ускоренной доставке клеток при действии разницы давлений, центробежных, электростатических, магнитных сил и их комбинаций [5]. При наиболее распространенном статичном методе концентрированную клеточную суспензию наносят с помощью пипетки непосредственно в просвет или на наружную поверхность заселяемого матрикса. Дальнейшее осаждение клеток происходит под действием силы тяжести. Эффективность заселения клеток для данной методики составляет 10—25%, что является показателем низкой эффективности использования клеточной культуры [6]. При статичном культивировании проникновение клеток вглубь заселяемого материала возможно только за счет их миграции после адгезии, при этом распределение клеток может быть весьма неравномерным [7]. Известно, что глубина проникновения клеток внутрь матрикса напрямую зависит от пористости материала [8].

Динамическое культивирование включает методы, использующие гидростатические силы (механическое перемешивание среды, ротационное, перфу-зионное культивирование при центрифугировании), давление (вакуумное культивирование) и их комбинации [9, 10].

Для скрининга — первичного тестирования биоматериалов, необходимо применять стандартные линейные культуры клеток, влияние на которые оценивается по уровню их повреждения, пролиферации, состоянию клеточных структур, специфическим аспектам клеточного метаболизма [11].

Целью данной работы являлось повышение эффективности заселения разработанных биодегради-руемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками.

Материал и методы

Материалы матриксов и способы их получения

Для изготовления плоских образцов пористых матриксов были использованы следующие полимеры: 1) ацетат целлюлозы (АЦ) содержащий 39,7% ацетильных групп, 50 кДа, (Sigma Aldrich); 2) поли-капролактон (ПКЛ), 80 кДа, (Sigma Aldrich); 3) сополимер й,1_-лактида с гликолидом 75:25 (ПДЛГА), 76—115 кДа, (Sigma Aldrich); 4) сополимер й,1_-лактида с гликолидом состава 70:30 (НБИКС-центр Курчатовского института), 104 кДа (ПДЛГА+); 5) сополимер L-лактида с в-капролактоном (ПЛК) состава 70:30, (Corbion Purac).

Экспериментальные образцы изготавливали методом электороформования на лабораторной однокапил-лярной установке. После изготовления, перед исследованием их структуры все образцы вакуумировались при разрежении 1 мбар в течение 1 сут. Полученные матриксы были стерилизованы гамма-излучением в дозе 15 кГр в контейнерах «Клинипак». Структура приготовленных микроволокнистых матриксов была исследована методом сканирующей электронной микроскопии (Helios 600i, FEI, США). Геометрические размеры волокон определяли при анализе полученных изображений с помощью программы Scope Photo. Средний диаметр волокна рассчитывался по результатам измерения 70—100 волокон.

Культуры клеток

Для скринингового тестирования матриксных свойств использовали следующие клеточные линии: MCF-7 — эпителиальная линия опухолевых клеток протока молочной железы человека, одна из наиболее часто используемых в исследованиях линий клеток с характеристиками дифференцированного эпителия; 3T3/NIH — стандартная линия спонтанно иммортализованных фибробластов, полученная из эмбриональных тканей мыши.

Статичное и динамическое культивирование

Клетки MCF-7 и 3T3 культивировали в CO2-инкубаторе в течение 7 суток в стандартных условиях при температуре 37°C, 5% CO2 и увлажненной атмосфере. Полная питательная среда состояла из DMEM/F12 (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco). Матриксы были исследованы при двух типах культивирования: статичное культивирование в стандартной посуде и динамическое культивирование при медленном осевом вращении цилин-

дрической пробирки. Подсчет клеток осуществляли в счетчике TC-10 (Bio-Rad). Стандартные размеры образцов матриксов получали путем вырубки ручным пробойником (Micron) круглых мембран диаметром 0,3 см2. Клетки засевали в концентрации 14x103 кл/см2 для 3Т3, 24x103 кл/см2 для MCF-7 на образцы матриксов в виде круглых мембран диаметром 0,3 см2. Статичное культивирование осуществляли в 96-луночном планшете с объёмом 200 мкл питательной среды в каждой лунке. При проведении динамического культивирования (при вращении) в криопробирки объемом 1,6 мл с неадгезивной поверхностью помещали по 3 образца матрикса и засевали клетки в той же концентрации (абсолютное число клеток было, соответственно, в 3 раза выше). Объём культуральной среды был, соответственно, также увеличен в 3 раза (600 мкл). Вращение осуществляли с помощью программируемого ротатора RM-1 (Elmi), помещенного в СО2-инкубатор (Thermo Fisher Scientific), со следующими параметрами: тип вращения — равномерный; направление относительно оси симметрии — вдоль оси симметрии пробирки; скорость вращения — 3 об/мин.

Определение пористости волокнистых матриксов

и размера пор

Определение пористости проводили на образцах размером 4x4 см. Толщину материалов определяли с помощью толщиномера марки ТР-25-100Б. Вес образцов измерялся на аналитических весах Sartorius CPA324S-0CE с точностью 0,1 мг. Расчет пористости образцов производили из отношения между объемом, занимаемым волокнами и объемом всего материала в процентах. Размер пор образцов определяли методом точки пузырька.

Оценка пролиферации клеток на матриксах

Пролиферацию клеток на 7 сутки культивирования исследовали путем проведения МТТ-теста. Для точной оценки количества клеток, прикрепившихся к матриксу, содержимое каждой лунки аккуратно переносили в соответствующую лунку нового 96-лу-ночного планшета, вносили 200 мкл питательной среды, исключая, таким образом, из измерения клетки, прикрепившиеся к пластику. В каждую лунку добавляли по 50 мкл МТТ-реагента и инкубировали в течение 4 ч. при 37°С, что приводило к образованию нерастворимых в воде фиолетовых кристаллов. Далее среду удаляли, вносили по 200 мкл ДМСО для растворения кристаллов, и полученный окрашенный раствор в объёме 100 мкл переносили в 96-лу-ночный планшет. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 540 мм. Отрицательным контролем служили лунки без клеток, наполненные полной питательной средой.

Из каждой криопробирки удаляли питательную среду, для удаления живых не прикрепившихся клеток вносили по 600 мкл свежей среды и по 150 мкл раствора МТТ (1 мг/мл). Инкубировали в течение 4 ч. при 37°С, на дно криопробирок и материал образцов выпадали фиолетовые нерастворимые в воде кристаллы формазана. Центрифугировали криопробирки 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость аккуратно удаляли отсасыванием, вносили 600 мкл ДМСО (Sigma) для растворения кристаллов и получали окрашенный раствор, который переносили в 96-луночный планшет по 100 мкл/лунку

от каждой пробы. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 540 мм. Отрицательным контролем служили лунки без клеток, наполненные полной питательной средой.

результаты

Характеристикаматриксов

В ходе исследования были изготовлены пять матриксов из ПКЛ, один — из АЦ, 2 — из ПДЛГА, 2 - из ПДЛГА+, 2 - из ПЛК; всего - 12 образцов (рис. 1, табл. 1.). У образцов № 3-ПКЛ, № 11, 12-ПЛК были выявлены дефекты волокнистой структуры, поэтому определение среднего диаметра волокон проводили только на неповрежденных участках. Матриксы № 1, 5, 6-ПКЛ; № 4, 10-ПДЛГА; № 7-АЦ; № 8, 9-ПДЛГА+ обладали исключительно

волоконной структурой, тогда как № 3-ПКЛ и № 11, 12-ПЛК содержали овальные структуры, локализованные на волокнах и представлявшие собой недо-вытянутые участки (утолщения) волокон. Образец № 2-ПКЛ имел вид сложной композиции, состоящей из ленточных волокон большой ширины и тонких волокон с приблизительно круглым сечением. Поверхность волокон матриксов № 8, 9-ПДЛГА имела пористое строение. Образцы № 1, 5, 6-ПКЛ характеризовались бимодальностью, т.е. в их структуре присутствовали волокна разного диаметра, что особенно заметно в матриксе № 6-ПКЛ.

Пролиферация клеток на матриксах

Полученные матриксы были ко-инкубированы с различными видами линий клеток и оценены с помощью МТТ-теста при статичном и динамическом культивировании (рис. 2, табл.2).

Рис. 1. Матриксы, полученные электроформованием: № 1-3, 5, 6 - ПКЛ; № 7 - АЦ; № 8, 9 - ПДЛГА+; № 4, 10 - ПДЛГА; № 11, 12 - ПЛК. Сканирующая электронная микроскопия

Таблица 1. Свойства волокнистых матриксов, полученных электроформованием

№ образца Полимер Средний диаметр волокна ^±0), мкм Размер пор (max), мкм Пористость, % Толщина материала, мкм Удельная площадь поверхности, м2/г

1 ПКЛ 14,5+6,5 80 90 770 0,23

2 ПКЛ 12,1±7,1 38,7 79 250 0,28

3 ПКЛ 0,44+0,24* 9,3 85 180 -

4 ПДЛГА 5,3±1,3 38 81 400 0,59

5 ПКЛ 3,6±2,2 36 83 530 0,86

6 ПКЛ 1,3±1,5 33 90 860 2,53

7 АЦ 6±2,4 38,7 95 700 0,51

8 ПДЛГА+ 2,7±1,1 7,3 84 230 1,15

9 ПДЛГА+ 3,5±1,2 10,2 84 480 0,91

10 ПДЛГА 4,2±1,6 16,6 81 220 0,75

11 ПЛК 0,48±0,38* - 83,2 210 -

12 ПЛК 1,8±1,2* - 83,6 430 -

* — средний диаметр волокон между недовытянутыми грушевидными участками.

Рис. 2.

Количество клеток (х103) линий 3Т3 и МСР-7 на 7 сут. при культивировании в статичном и динамическом режимах, рассчитанное по значениям оптической плотности при МТТ-тесте

Таблица 2. Оптическая плотность при МТТ-тесте на 7 сут. культивирования клеток линий 3Т3 и MCF-7 на полученных матриксах

Матриксы Оптическая плотность

№ образца Полимер 3Т3, статичное 3Т3, динамическое MCF-7, статичное MCF-7 динамическое

культивирование культивирование культивирование культивирование

1 ПКЛ 0,429 0,586 0,537 1,212

2 ПКЛ 0,471 0,536 1,071 1,501

3 ПКЛ 0,364 0,541 0,69 1,14

4 ПДЛГА 0,277 0,742 0,423 1,112

5 ПКЛ 0,262 0,559 0,267 0,569

6 ПКЛ 0,269 0,494 0,508 0,742

7 АЦ 0,669 0,346 1,437 0,66

8 ПДЛГА+ 0,318 0,444 0,265 0,664

9 ПДЛГА+ 0,215 0,401 0,278 0,518

10 ПДЛГА 0,212 0,761 0,243 0,928

11 ПЛК 0,448 0,974 0,465 2,319

12 ПЛК 0,538 0,805 0,753 1,514

Статичное культивирование. Наибольший уровень пролиферации клеток линии 3Т3 наблюдался на образцах № 1-ПКЛ, № 2-ПКЛ, № 7-АЦ, № 11-ПЛК, № 12-ПЛК, а клеток МСР-7 - на матриксах № 2-ПКЛ, № 3-ПКЛ, № 7-АЦ, № 12-ПЛК. Образцы на основе материала ПДЛГА и ПДЛГА+ показали более низкие результаты роста клеточных культур 3Т3 и МСР-7. На основании полученных данных, можно сделать вывод, что при статичном культивировании наибольшей пролиферативной активностью обладали клетки, заселенные на материалы ПКЛ, ПЛК и АЦ.

Динамическое культивирование. Наибольшая скорость пролиферации клеток 3Т3 наблюдалась на матриксах из пДлГА (№ 4, 10), а также ПЛК (№ 11, 12), наименьшее количество клеток — на матриксе из АЦ № 7. Наибольший прирост эпителиальных клеток МСР-7 при культивировании с вращением был выявлен на образцах № 2-ПКЛ и № 11, 12-ПЛК. На основании исследования можно сделать вывод, что наибольшая адгезивная и пролиферативная активность клеток 3Т3 определялась на матриксах из ПКЛ, ПДЛГА и ПЛК; а для клеток МСР-7 на образцах из ПКЛ и ПЛК.

Заселение клетками в зависимости от диаметра

волоконматриксов

На матриксах из ПКЛ для клеток МСР-7 при статичном культивировании наблюдали восходящую динамику пролиферации клеток, отличающуюся на 100% при переходе от диапазона волокон 0 0,3— 2,7 мкм к 5—21 мкм. Значения первого диапазона (среднее значение оптической плотности 125) соответствовали 104 клеток, а второго (среднее значение оптической плотности 220) — 20х103 клеток. Аналогичная динамика наблюдалась для 3Т3, при которой пролиферация клеток в диапазоне волокон большего диаметра была выше на 100—150% (45х103 клеток по сравнению с 15х103 клеток).

При культивировании в условиях вращения данная зависимость сохранялась: так, на матриксах из ПКЛ для клеток МСР-7 наблюдали восходящую динамику пролиферации, отличающуюся на 1 50% при переходе от диапазона волокон 0 0,3—2,7 мкм к 5—21 мкм. Значения первого диапазона (среднее значение оптической плотности 220) соответствовали 20х103 клеток, а второго (среднее значение оптической плотности 320) — 50х103 клеток. Разница в пролиферации 3Т3 на исследуемых матриксах при различных диаметрах волокон отсутствовала, но уровень пролиферации был значительно выше, по сравнению со статичным культивированием (50— 60х103 кл. для каждого образца).

При статичном культивировании МСР-7 и 3Т3 не было выявлено разницы в пролиферации клеток на матриксах из полилактогликолидов, обладавших диаметром волокон в пределах 1,6—6,0 мкм.

обсуждение

Методом электроформования были получены 12 типов матриксов из разных полимеров или сополимеров, которые представляли собой плоские каркасы-мембраны из волокнистого нетканого материала с пористостью от 79 до 95% и средним диаметром волокон от 0,44 до 14,5 мкм. Данные параметры матриксов были выбраны по результатам исследований механической прочности, которая соответствовала прочности нативных желчных протоков (неопубликованные данные).

Матриксы были исследованы с использованием двух принципиально разных линий клеток: эпителиальных МСР-7 и фибробластоподобных 3Т3/1\11Н — путем проведения МТТ-теста. Матриксы не обладали цитотоксическим эффектом.

Для заселения матриксов применяли два способа культивирования — стандартное статичное и динамическое культивирование с вращением по разработанному нами режиму. Заселение матриксов было более эффективным при вращении для всех образцов, кроме образца № 7-АЦ, который при статичном культивировании демонстрировал наиболее высокие значения пролиферации клеток, а при вращении — низкие. Это может быть связано с низкими адгезионными свойствами поверхности данного матрикса, в результате чего часть клеток не удерживалась на его поверхности при вращении.

Таким образом, режим динамического культивирования также может быть использован при тестировании адгезионных свойств материалов и позволит выбирать оптимальные для дальнейшего заселения клетками в ротируемых и проточных биореакторах.

В ряде работ было показано, что размер пор и степень пористости матрикса влияют на эффективность его заселения клетками [14, 15]. Большинством исследователей оптимальным размером пор носителя считается диапазон от 50 до 150 мкм. Размер пор определяет не только эффективность заселения материала клетками, но также влияет на их морфо-функциональную активность [14]. Чем крупнее поры носителя, тем проще, быстрее и равномернее можно произвести заселение его клетками [15]. Показано, что миграция клеток линейно зависит (до определенного уровня) от размера пор [16]. Кроме того, крупные поры способствуют лучшей адгезии клеток к поверхности носителя и в дальнейшем лучшей жизнеспособности клеток после трансплантации конструкции [17]. В нашей работе были исследованы матриксы с меньшим размером пор, что было необходимо для соответствия прочности матрикса на-тивному желчному протоку. Все образцы матриксов были одинаково высокопористыми (табл. 1), что не позволило оценить влияние данного параметра на их адгезионные свойства.

В отношении диаметра волокон в матриксах из поликапролактона, в котором можно было четко выделить 2 диапазона размеров, было отмечено, что при переходе от диапазона диаметра волокон 0 0,3—2,7 мкм к 5—21 мкм — клетки (как при статичном, так и при динамическом культивировании) про-лиферировали значительно лучше, что может быть связано с «эффективной» площадью для их адгезии. Данный результат не противоречит имеющимся литературным данным, в которых на эндотелиальных клетках было показано, что оптимальным диапазоном диаметра электроформованных волокон из АЦ — 0 1—5 мкм. Диапазон выбран, исходя из максимальных размеров диаметра волокон в трех исследованиях (10—200 нм, 0,2—1 мкм, 1—5 мкм) [18].

заключение

В данной работе проведено исследование ряда перспективных для тканевой инженерии биодегра-дирующих полимеров: ПКЛ, АЦ, ПДЛГА, ПДЛГА+, из которых электроформованием были изготовлены образцы матриксов в виде мембран с различной

пористостью и размерами волокон. При скринин-говом исследовании с использованием линий 3Т3/ NIH и MCF-7 было подтверждено отсутствие цито-токсичности матриксов и выбраны наиболее подходящие для заселения фибробластоподобными и эпителиальными клетками: для первых — из ПЛК, для вторых № 2-ПКЛ и № 12-ПЛК. При статичном культивировании MCF-7 и 3Т3 не было выявлено разницы в пролиферации клеток на матриксах из по-лилактогликолидов, обладавших диаметром волокон в пределах 1,6—6,0 мкм. Полученные результаты

будут применены для дальнейших исследований по созданию многослойного тканеинженерного эквивалента желчного протока.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение о субсидии № 14.604.21.0133, уникальный идентификатор RFMEFI60414X0133).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Atala A., Danilevskiy M., Lyundup A. et al. The potential role of tissue-engineered urethral substitution: clinical and preclinical studies. J. Tissue Eng. Regen. Med., Dec. 2015. doi: 10.1002/term.2112. [Epub ahead of print].

2. Atala A. Regenerative medicine strategies. J. Pediatr. Surg. 2012; 47(1): 17-28.

3. Дюжева Т.Г., Люндуп А.В., Клабуков И.Д. и др. Перспективы создания тканеинженерного желчного протока. Гены и клетки 2016; XI(1): 43-7.

4. Battiston K.G., Cheung J.W.C., Jain D. et al. Biomaterials in co-culture systems: towards optimizing tissue integration and cell signaling within scaffolds. Biomaterials 2014; 35(15): 4465-76.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Hsu S., Tsai I., Lin D. et al. The effect of dynamic culture conditions on endothelial cell seeding and retention on small diameter polyurethane vascular grafts. Med. Eng. Phys. 2005; 27(3): 267-72.

6. Villalona G.A., Udelsman B., Duncan D.R. et al. Cell-seeding techniques in vascular tissue engineering. Tissue Eng. Part B. Rev. 2010; 16(3): 341-50.

7. Roh J.D., Brennan M.P., Lopez-Soler R.I. et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. J. Pediatr. Surg. 2007; 42(1): 198-202.

8. Ravi S., Qu Z., Chaikof E.L. Polymeric materials for tissue engineering of arterial substitutes. Vascular 2009: 17(Suppl 1): S45-54.

9. Pörtner R., Nagel-Heyer S., Goepfert C. et al. Bioreactor design for tissue engineering. J. Biosci. Bioeng. 2005; 100(3): 235-45.

10. Qiao J., Lew C.M.J., Karthikeyan A. et al. Production of PEX protein from QM7 cells cultured in polymer scaffolds in a Taylor— Couette bioreactor. Biochem. Eng. J. 2014; 88: 179-87.

11. ГОСТ 10993-5-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro.

12. Loh Q.L., Choong C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Eng. Part B Rev. 2013; 19(6): 485-502.

13. Zeltinger J., Sherwood J. K., Graham D.A. et al. Effect of pore size and void fraction on cellular adhesion, proliferation, and matrix deposition. Tissue Eng. 2001; 7(5): 557-72.

14. Murphy C.M., O'Brien F.J. Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminoglycan scaffolds. Cell Adh. Migr. 2010; 4(3): 377-81.

15. Ma H., Hu J., Ma P.X. Polymer scaffolds for small-diameter vascular tissue engineering. Adv. Funct. Mater. 2010; 20(17): 2833-41.

16. Wolf K., Te Lindert M., Krause M. et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 2013; 201(7): 1069-84.

17. Насрединов А.С., Лаврешин А.В. Тканевая инженерия кровеносных сосудов: способы совмещения клеток и носителя. Гены клетки 2014; IX(1): 23-34.

18. Rubenstein D., Han D., Goldgraben S. et al. Bioassay chamber for angiogenesis with perfused explanted arteries and electrospun scaffolding. Microcirculation 2007; 14(7): 723-37.

Поступила: 18.07.2016

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.