CC BY
581
Для корреспонденции
Сидорова Юлия Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2168-2659
Сидорова Ю.С., Петров Н.А., Шипелин В.А., Зорин С.Н., Кочеткова А.А., Мазо В.К.
Влияние полифенолов листьев черники на степень тревожности, пространственное обучение и память у мышей линии db/db
The impact of bilberry leaves' polyphenols on the anxiety level, spatial learning and memory of db/db mice
Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Shipelin V.A., Zorin S.N., Kochetkova A.A., Mazo V.K.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва, Россия Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow, Russia
В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях показана высокая эффективность растительных полифенольных соединений в восстановлении возрастных нарушений памяти и обучаемости. Путем сорбции водного раствора экстракта листьев черники на гречневой муке, позволившей сконцентрировать полифенолы и повысить их стабильность при хранении, получен функциональный пищевой ингредиент (ФПИ).
Цель работы - оценка влияния разработанного ФПИ, содержащего полифенолы листьев черники, на степень тревожности, двигательную активность, память и способность к обучению у мышей линии ¿Ь/йЬ с генетически обусловленным сахарным диабетом 2 типа.
Материал и методы. Эксперимент был проведен с использованием 10 мышей-самцов гетерозигот линии ¿Ь/йЬ и 10 мышей-самцов гомозигот линии ¿Ь/+ в качестве группы сравнения в возрасте 7 нед. Животные были разделены на 3 группы по массе тела, уровню глюкозы, показателю инсулинорезистент-ности и по результатам теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ): контрольная группа К1 - животные линии ¿Ь/+, контрольная группа К2 и опытная группа Г3 - тучные мыши линии ¿Ь/йЬ. В рацион животных группы К2 вносили гречневую муку в количестве 2,5 г/100 г; в рацион животных группы Г3 вносили ФПИ в количестве 2,5 г/100 г (что соответствовало содержанию полифенолов 59,2±1,4 мг-экв галловой кислоты на 100 г корма). В тесте ПКЛ изучали степень выраженности эмоциональной реакции страха, тревоги и общую двигательную активность. Оценку поведения, памяти животных проводили, используя тест «Условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ). В крови животных определяли уровень гликированного гемоглобина, в плазме крови - уровни инсулина и лептина, в цитозольной фракции печени - общую антиоксидантную активность.
Для цитирования: Сидорова Ю.С., Петров Н А., Шипелин В.А., Зорин С.Н., Кочеткова А.А., Мазо В.К. Влияние полифенолов листьев черники на степень тревожности, пространственное обучение и память у мышей линии db/db // Вопр. питания. 2019. Т. 88, № 3. С. 53-62. doi: 10.24411/0042-8833-2019-10029.
Статья поступила в редакцию 10.12.2018. Принята в печать 20.05.2019.
For citation: Sidorova Yu.S., Petrov N.A., Shipelin V.A., Zorin S.N., Kochetkova A.A., Mazo V.K. The impact of bilberry leaves' polyphenols on the anxiety level, spatial learning and memory of db/db mice. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2019; 88 (3): 53-62. doi: 10.24411/0042-8833-201910029. (in Russian)
Received 10.12.2018. Accepted 20.05.2019.
Результаты и обсуждение. Полученные данные биохимических исследований и тестирования инсулинорезистентности свидетельствовали об отсутствии нормализующего влияния разработанного ФПИ. Однако включение в состав рациона ФПИ с полифенольными соединениями приводило к благоприятным изменениям физиологических показателей. Было показано достоверное снижение тревожности у животных группы Г3, получавших ФПИ, по сравнению с животными обеих групп контроля. Во время тестирования краткосрочной памяти в тесте УРПИ в группе Г3 отсутствовали животные, входившие в темный отсек (0%), что говорит о повышенной обучаемости и высокой степени закрепления памятного следа у этих животных по сравнению с группами К1 (50%) и К2 (80%).
Заключение. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности полифенолов листьев черники, сорбированных на гречневой муке, при коррекции нарушений центральной нервной системы у мышей нокаутной линии db/db с генетически обусловленным сахарным диабетом 2 типа, что указывает на возможные перспективы включения ФПИ в состав специализированных пищевых продуктов, предназначенных для питания пациентов с сахарным диабетом 2 типа.
Ключевые слова: сахарный диабет 2 типа, полифенолы, листья черники, мыши, тревожность, память, обучаемость
Numerous experimental and clinical studies have shown high efficiency of plant polyphenolic compounds in restoring age-related memory and learning disorders. In the present study a functional food ingredient (FFI) was obtained by sorption of an aqueous solution of bilberry leaves extract on buckwheat flour, which allowed to concentrate polyphenols and increase their storage stability.
The aim of this study was to evaluate the impact of a developed FFI, enriched with bilberry leaves' polyphenols, on the anxiety level, locomotor activity, memory and spatial learning of db/db mice with genetical type 2 diabetes.
Material and methods. The experiment was conducted using 10 heterozygote male db/db mice and 10 homozygote male db/+ mice as the comparison control group (7 weeks of age). According to body weight, blood glucose level, the results of insulin resistance test and elevated plus-maze (EPM) test, animals were randomized into three groups: control group C1 - db/+ animals, control group C2 and experimental group G3 - obese db/db mice. Buckwheat flour was included into the diet of C2 group in a dose 22.5 g/100 g; FFI was included into the diet of G3 group in a dose 2.5 g/100 g (that was equal to 59.2 ± 1.4 mg-eq gallic acid per 100 g of the diet). The anxiety level and general locomotor activity were evaluated in the EPM test. The evaluation of behavior, memory and spatial learning was performed using passive avoidance test (PAT). Glycated hemoglobin level was determined in blood, insulin and leptin levels were determined in blood plasma, general antioxidant activity was determined in liver cytosolic fraction. Results and discussion. The obtained data on biochemical parameters and insulin resistance tests showed the absence of normalizing effects of developed FFI. However, the inclusion of polyphenol-containing FFI into the diet led to beneficial changes in physiological parameters. Animals of G3 group, provided with FFI, were significantly less anxious compared to both control groups. During PAT testing of short-term memory, no animals in G3 group entered to the dark compartment (0%), what demonstrated increased learning ability and well-established memory of these animals in comparison with C1 (50%) and C2 groups (80%).
Conclusion. The results prove the effectiveness of bilberry leaves' polyphenols, sorbed on the brown buckwheat flour, in the correction of central nervous system disorders in db/ db mice with genetically altered type 2 diabetes, what points at possible prospect of FFI inclusion in therapeutic products for patients with type 2 diabetes mellitus . Keywords: type 2 diabetes, polyphenols, bilberry leaves, mice, anxiety, memory, spatial learning
Одним из серьезных сопутствующих осложнений при сахарном диабете 2 типа (СД2) являются нейропо-веденческие нарушения [1], приводящие к когнитивным расстройствам и проявляющиеся в ухудшении способности к обучению, памяти и скорости восприятия [2, 3]. Моделирование СД2 в эксперименте открывает перспективы для оценки влияния нарушений углеводного и жирового обмена на способность к обучению, поведение и память генетических линий лабораторных живот-
ных [4]. Нарушения в обучении и памяти продемонстрированы на линии мышей db/db, которая широко используется в качестве экспериментальной модели СД2. Мыши этой линии имеют 2 мутантные копии гена рецептора лептина, что приводит к постепенному развитию гипергликемии и ожирения с последующей гиперин-сулинемией, схожей с таковой при СД2 у человека [5].
Растительные полифенолы обладают выраженными антиоксидантными свойствами, с чем в значительной
степени связывают их потенциальное антидиабетические действие [6]. Высокая эффективность растительных полифенольных соединений в восстановлении возрастных нарушений памяти и обучаемости показана как в клинических, так и в доклинических исследованиях [7-10]. Однако низкая биодоступность полифенолов часто не позволяет достигать ожидаемых благоприятных результатов [11], поэтому ее повышение является важным фактором, способствующим увеличению эффективности их использования в профилактическом питании и диетотерапии. Одним из перспективных технологических подходов, позволяющих концентрировать полифенолы в составе функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ) и повышать их стабильность при хранении, является сорбция на белковых матриксах [12]. Путем сорбции водного раствора сухого экстракта листьев черники на гречневой муке нами был получен ФПИ, или так называемая пищевая матрица [13].
Листья и ягоды черники, содержащие широкий спектр полифенолов, традиционно используются в народной медицине для уменьшения симптомов СД2 [14]. Снижение тревожности у стрессированных крыс-самцов линии вргадие-Оа\«!еу на фоне приема экстракта ягод черники показано в работе [15], при этом не выявлено влияния экстракта на двигательную активность. В нашем предыдущем исследовании на мышах-самцах линии С57В1_/6с с индуцированным высокожировым и высокоуглеводным (ВЖВУ) рационом СД2 [16] были показаны гипогликемические эффекты и снижение массы тела у животных, потреблявших разработанный ФПИ в составе рациона. Однако у животных, потреблявших ВЖВУ-рацион, не выявлено отклонений памяти, двигательной активности и тревожности по сравнению с контрольными мышами, получавшими стандартную диету.
Целью данного исследования являлась оценка включения разработанного ФПИ в рацион мышей линии с1Ь/ с1Ь в комплексе физиологических тестов, позволяющих оценить степень тревожности, двигательную активность, память и способность к обучению.
Материал и методы
Объекты исследования. Экстракт листьев черники сухой (ООО «Хармс», РФ) (влажность - 6,1%, зола -16,8%) с общим содержанием флавоноидов - 13,67± 0,11 мг/г, гидроксикоричных кислот - 11,68±0,22 мг/г, про-антоцианидинов - 15,5±0,2 мг/г, полифенолов - 43,6± 1,1 мг/г [17].
Опытный образец гречневой муки был получен измельчением с использованием ножевой мельницы <Юппс1о1тпх GM200» (Ре1эсИ, Германия) при 8000 об/мин в течение 10 мин промышленной партии пищевой муки (ООО «Хлебзернопродукт», РФ). Массовая доля белка в образце составила 9,7%, углеводов - 70,0%, золы -1,6%, влаги - 5,5%. Содержание полифенолов в муке составило 1,8±0,2 мг-экв галловой кислоты/г.
Таблица 1. Результаты предварительного теста «Приподнятый крестообразный лабиринт»
Показатель Группа животных
К1 К2 Г3
Время в открытом рукаве, с 128±10 110±21 114±5
Время в закрытом рукаве, с 132±8 148±22 132±5
Количество переходов 47±3 17±3* 21±4*
Общая дистанция, см 2095±100 928±108* 1063±180*
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое отличие (р<0,01) от показателя контрольной группы К1.
Комплекс полифенолов экстракта листьев черники, сорбированных на гречневой муке (далее пищевая матрица). Пищевую матрицу получали путем инкубации 2% водного раствора ЭЛЧ (рН 3,6) с измельченной гречневой мукой в соотношении 50:1 при 25 °С в течение 45 мин с последующей лиофилизацией. Содержание полифенолов в пищевой матрице составило 23,7±0,5 мг-экв галловой кислоты/г [13].
Лабораторные животные. Эксперимент был проведен с использованием 10 мышей-самцов гетерози-гот линии BKS.Cg-Dock7m Leprdb/++ (далее BKS db/db) и 10 мышей-самцов гомозигот линии BKS.Cg-Dock7m/+ Lepr (далее BKS) в качестве контроля (возраст животных 7 нед). Животные были получены из питомника лабораторных животных ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр "Институт цитологии и генетики" Сибирского отделения РАН». Согласно ветеринарному заключению животные имели SPF-статус, не подвергались каким-никаким воздействиям и не были использованы ни в каких экспериментах. У гетерозигот мышей контрольной группы наблюдались нормальные масса тела, уровень глюкозы в крови и инсулина в плазме крови. Животных содержали по 1 мыши в клетке в контролируемых условиях окружающей среды (температура 22-26 °C, относительная влажность 60±5%, 12-часовой цикл освещения). Длительность эксперимента составила 37 сут.
Таблица 2. Состав полусинтетических рационов
№ Компонент Содержание на 100 г корма, г
К1 К2 Г3
1 Казеин 25,0 25,0 25,0
2 Жировая композиция подсолнечное масло 5,0 5,0 5,0
лярд 5,0 5,0 5,0
3 Крахмал 58,0 55,5 55,5
4 Гречневая мука - 2,5 -
5 Пищевая матрица - - 2,5
6 Минеральная смесь [18] 4,0 4,0 4,0
7 Смесь жирорастворимых витаминов, мл [18] 1,0 1,0 1,0
8 Смесь водорастворимых витаминов [18] 0,1 0,1 0,1
Калорийность, ккал 376±2 377±3 377±2
К1
К2
Группа животных
Г3
К1
К2
Группа животных
Г3
Рис. 1. Среднее потребление животными корма (А) и воды (Б)
* - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1; # - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К2.
Исходная масса тела контрольных животных линии BKS составила 27,5±0,3 г, линии BKS db/db - 36,0±1,8 г, различия между группами статистически значимы (p<0,05).
До начала проведения эксперимента у животных оценивали уровень глюкозы в крови (животных деприви-ровали голодом 4 ч), проводили тест на инсулинорези-стентность (ИР) натощак, степень тревожности мышей оценивали в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (далее - ПКЛ, см. «Физиологические методы»).
Для определения глюкозы у животных отбирали кровь из хвостовой вены, концентрацию глюкозы определяли с помощью портативного электрохимического глюкометра «OneTouch Select» (LifeScan Inc., США). При проведении теста на ИР животным вводили инсулин
45,0
40,0
35,0
530,0 р
о
25,0
K-K Г3
....... — F * 4
у _ *
14 21 28 Сутки эксперимента
35
Рис. 2. Динамика массы тела животных
* - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1.
внутрибрюшинно в дозе 0,25 Ед на 1 кг массы тела. Концентрацию глюкозы в крови измеряли до введения инсулина (0-я точка) и через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости уровня глюкозы от времени после введения инсулина и определяли значение площади под кривой (ППК, ммоль/лх180 мин).
Животные были разделены на 3 группы: контрольная группа К1 - мыши линии BKS (п=10), животные линии BKS db/db были рандомизированно разделены по массе тела, уровню глюкозы в крови, показателю ППК и по результатам ПКЛ (табл. 1) на 2 группы: контрольная группа К2 - тучные мыши линии BKS db/db (n=5) и опытная группа Г3 (п=5).
Концентрация глюкозы и значение ППК достоверно не различались между группами диабетических животных и были статистически значимо выше соответствующих показателей животных контрольной группы К1.
Согласно результатам предварительного теста ПКЛ (см. табл. 1) не выявлено различий по времени пребывания в рукавах лабиринта, что говорит об отсутствии различий в уровне тревожности всех животных. Стоит отметить, что диабетические животные линии BKS db/db проявляли достоверно меньший уровень исследовательской активности по сравнению с интакт-ными животными линии BKS. Животные меньше перемещались по лабиринту, что подтверждается статистически значимо сниженной пройденной дистанцией и меньшим количеством переходов между зонами лабиринта.
На протяжении всего эксперимента животные получали стандартный изокалорийный изоазотистый рацион (376±2 ккал, 22,5% белка). В рацион животных контрольной группы К2 вносили гречневую муку, в рацион животных крыс опытной группы Г3 - ФПИ (табл. 2) в количестве, обеспечивающем содержание полифенолов 59,2±1,4 мг-экв галловой кислоты на 100 г корма.
Таблица 3. Динамика уровня глюкозы крови животных
Группа животных Уровень глюкозы, ммоль/л Относительное изменение (37-е сутки), %
0-е сутки 3-и сутки 10-е сутки 31-е сутки 37-е сутки
К1 11,3±0,3 10,0±0,5 9,6±0,4 10,7±0,5 6,6±0,5# -41,7±4,3
К2 27,9±3,4* 26,0±3,0* 29,3±2,9* 30,1 ±2,5* 27,6±2,7* 4,5±13,3*
Г3 25,7±3,2* 21,0±3,6* 20,9±3,2* 29,9±1,4* 24,6±2,1* 2,4±14,1*
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1; # - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя на начало (0-е сутки) эксперимента.
Животные всех групп на протяжении всего эксперимента получали питьевую очищенную воду ad libitum. 3 раза в неделю контролировали потребление корма, еженедельно контролировали потребление воды, раз в неделю животных взвешивали. На 31-е сутки эксперимента проводили тест на ИР.
Работу с животными выполняли в соответствии с руководством [19] и Правилами надлежащей лабораторной практики (приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н).
Физиологические методы. В тесте ПКЛ изучали поведение животных в условиях переменной стрессо-генности, т.е. при свободном выборе комфортных условий, что позволяет оценить их уровень тревожности. Время пребывания мыши в лабиринте составляло 5 мин. Во время тестирования фиксировали время пребывания в закрытых (ЗР) и открытых рукавах (ОР) и общую исследовательскую активность (число переходов между зонами лабиринта и общую пройденную дистанцию). Рассчитывали показатель отношения времени, проведенного в ЗР, к времени, проведенному в ОР (ЗР/ОР). Тест ПКЛ проводили на 0-е и 27-е сутки эксперимента.
Оценку поведения и памяти животных проводили, используя тест «Условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ). При обучении мышь однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Регистрировали латентный период (ЛП) пребывания в светлом отсеке камеры. Как только мышь переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,2 мА не более 8 с). Через 24 ч после обучения у животных проверяли сохранность памятного следа. Если животное не заходило в темную камеру, это расценивалось как воспроизведение навыка пассивного избегания, если латентный период сокращался - как амнезию навыка. Обучение проводили на 16-е сутки эксперимента, проверку обучения - на 17-е сутки.
Биохимические методы. На 37-е сутки животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом. Для определения антиоксидантной активности у животных после декапитации извлекали печень, промывали в охлажденном 1,15% растворе KCl, просушивали при помощи фильтровальной бумаги, измельчали продавливанием через перфорированную металлическую пластинку с диаметром отверстий 0,8 мм и гомогенизировали навеску в 0,05 М Трис-HCl буфере рН 7,4 на 1,15% KCl в соотношении 1:4 (масса : объем). Печень гомогенизировали в стеклян-
ном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоно-вым пестиком в течение 90 с при 1200 об/мин. Гомоге-наты центрифугировали при 10 000g в течение 15 мин. Полученный супернатант отбирали и подвергали повторному центрифугированию при 10 000g в течение 60 мин, после чего отделяли надосадочную жидкость (цитозольную фракцию). Все работы проводили при температуре +4 °С, выделенный материал хранили при -20 °С.
В цельной крови определяли содержание гликиро-ванного гемоглобина с использованием коммерческого набора «Гликогемотест» (ЭЛТА, Россия). Метод основан на принципе аффинного разделения гликированной и негликированной фракции гемоглобина гемолизата крови на сорбенте с привитой 4-аминометилфенилбо-роновой кислотой [20]. Собранную после декапитации животного кровь с ЭДТА в качестве антикоагулянта центрифугировали в течение 15 мин при 500g, отбирали плазму крови, которую хранили при -20 °С не более 2 нед. В плазме крови методом твердофазного имму-ноферментного анализа («сэндвич»-метод) определяли содержание инсулина и лептина с использованием коммерческих наборов (BioVendor, Чехия).
Определение общей антиоксидантной активности в цитозольной фракции печени проводили спектрофото-метрическим методом [21].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20 (IBM, США), используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни, критерий Стьюдента, а также U-критерий Фишера для оценки обучаемости животных в тесте УРПИ. Вычисляли среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены как M±m. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.
Таблица 4. Изменения площади под кривой в тесте на инсулинорези-стентность
Группа животных ППК, ммоль/лх180 мин Относительное изменение (31-е сутки), %
0-е сутки 31-е сутки
К1 928±87 1002±75 20,6±18,0
К2 2613±304* 2799±128* 13,4±13,9
Г3 2269±245* 2379±303* 12,2±19,3
* - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1.
Таблица 5. Биохимические показатели животных
Показатель Группа животных
К1 К2 Г3
Гликированный гемоглобин, % 5,4±0,3 12,3±0,4* 11,1±0,6*
Инсулин, нг/мл 0,28±0,04 0,73±0,29* 1,06±0,37*
Лептин, нг/мл 312±51 2642±527* 3568±323*
Антиоксидантная активность, мкмоль 401 ±13 472±20* 568±61*
Примечание. * - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1.
Результаты и обсуждение
Общее состояние животных группы К1 по внешнему виду и качеству шерстного покрова при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным. Однако животные данной группы отличались повышенной активностью и агрессивностью. Диабетические животные групп К2 и Г3 были значительно больше по размеру и менее подвижны, чем интактные животные, для этих животных была характерна жирная и лоснящаяся шерсть. По окончании эксперимента относительная масса печени диабетических животных была статистически значимо выше по сравнению с таковой в контрольной группе К1 (3,5±0,1%) и составила: для группы К2 - 5,5±0,3%; для группы Г3 - 5,1±0,1%.
Среднее потребление животными корма и воды представлено на рис. 1.
о 5,0
4,0
о_
со
3,0 2,0 1,0 0,0
■i"
Тест 1 □ Тест 2 □
К1
К2
Группы животных
Г3
Рис. 3. Отношение времени, проведенного в закрытом рукаве (ЗР), ко времени, проведенному в открытом рукаве (ОР) лабиринта, в 1-м и 2-м тестах «Приподнятый крестообразный лабиринт»
* - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1; # - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К2; ▲ - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя при 1-м тестировании.
На протяжении всего эксперимента животные группы К1 потребляли статистически значимо меньше корма по сравнению с диабетическими животными группы К2 и Г3. Среднее потребление корма животными группы Г3 было достоверно выше по сравнению с таковым у мышей контрольной диабетической группы К2. Также животные группы К2 и опытной группы Г3 потребляли статистически значимо больше воды по сравнению с животными контрольной группы К1.
На протяжении всего эксперимента средняя масса тела диабетических животных обеих групп была достоверно выше по сравнению с животными группы К1 (30,7±0,5 г) (рис. 2). По окончании эксперимента достоверных отличий по массе между диабетическими животными группы К2 (36,3±2,6) и Г3 (40,9±1,0) г не выявлено.
В табл. 3 представлены данные по изменению уровня глюкозы в крови на протяжении эксперимента. На 37-е сутки достоверное снижение концентрации глюкозы относительно исходного уровня отмечено только для мышей группы К1.
В табл. 4 представлены результаты тестов на ИР.
Согласно результатам обоих тестов на ИР, значение ППК для диабетических животных было статистически значимо выше по сравнению с животными контрольной группы К1. При третьем тестировании на 31-е сутки кормления экспериментальными рационами не было выявлено достоверных изменений ППК для животных всех групп по сравнению с первым тестом.
В табл. 5 представлены результаты определения некоторых биохимических показателей по окончании эксперимента.
Как видно из данных, представленных в табл. 5, содержание гликированного гемоглобина, инсулина и леп-тина для диабетических мышей контрольной группы К2 и опытной группы Г3 было статистически значимо выше по сравнению с показателями животных контрольной группы К1. Между группами диабетических животных достоверных различий не выявлено. Показатель анти-оксидантной активности для диабетических животных был также статистически значимо выше по сравнению с интактными животными группы К1.
Таким образом, полученные данные биохимических исследований и тестирования на ИР свидетельствовали об отсутствии благоприятного нормализующего влияния разработанного ФПИ, обогащенного полифенолами, экстрагированными из листьев черники, на нарушения углеводного обмена у диабетических мышей-самцов ге-терозигот линии BKS db/db. Этот результат, по-видимому, объясняется глубокими генетически обусловленными нарушениями углеводного и жирового обмена, которые уже имели место у диабетических мышей этой линии на начало проведения эксперимента с кормлением и продолжали усугубляться.
Однако, несмотря на значительные метаболические нарушения, включение в состав рациона ФПИ с высоким содержанием полифенольных соединений приводило к благоприятным изменениям физиологических пока-
*
К1 К2
Группы животных
Г3
60,0-
50,0-
40,0-
30,0-
20,0-
ü 10,0-
0,0
Тест 1 □ Тест 2 □
К1 К2 Г3
Группы животных
А
Б
*
*
Рис. 4. Двигательная активность в 1-м и 2-м тестах «Приподнятый крестообразный лабиринт»: пройденная дистанция (А) и количество переходов между зонами (Б)
* - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1; ▲ - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя при 1-м тестировании.
зателей. Далее на рис. 3 и 4 представлены результаты тестирования тревожности и общей исследовательской активности в тесте ПКЛ.
Через 27 сут в повторном тесте ПКЛ было показано статистически значимое снижение показателя ОР/ЗР для животных группы Г3 как относительно контрольной группы К1, так и по отношению к диабетическим животным группы К2. Причем данный показатель для животных контрольной диабетической группы К2 был достоверно выше по сравнению с контрольной группой К1. Полученный результат говорит о снижении тревожности у животных группы Г3, получавших ФПИ, содержащий полифенолы листьев черники.
Наши данные согласуются с результатами, полученными в работе [22], в которой в тесте ПКЛ было показано, что мыши линии db/db в возрасте 8-10 нед были достоверно более тревожными по сравнению с контрольными тощими животными линии db/+. При этом авторы экспериментального исследования [15] выявили снижение тревожности стрессированных крыс-самцов линии Sprague-Dawley на фоне 2-недельного приема экстракта ягод черники в дозе 200 мг полифенолов на 1 кг массы тела, однако на двигательную активность потребление экстракта влияния не оказывало, что также согласуется с нашими данными, представленными ниже
(рис. 4). В работе [23] на крысах-самцах линии Вистар с сахарным диабетом, индуцированным введением стрептозотоцина, установлено статистически значимое снижение тревожности у животных, получавших антоци-аны в дозе 200 мг на 1 кг массы тела в течение 7 дней, по сравнению с контрольными животными, в то же время не показано никаких изменений уровня глюкозы.
На рис. 4 показаны результаты оценки двигательной исследовательской активности в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт».
В 1-м тесте диабетические животные линии ВКБ db/db проявляли достоверно меньший уровень исследовательской активности по сравнению с животными контрольной группы К1: мыши меньше перемещались по лабиринту, что подтверждается статистически значимо меньшими пройденной дистанцией и количеством переходов между зонами лабиринта.
Во 2-м тесте мыши всех 3 групп достоверно меньше перемещались по лабиринту по сравнению с 1-м тестом. Вместе с тем сохранились значимые различия с показателями животных группы К1 у мышей обеих диабетических групп как по пройденной дистанции, так и количествам переходов.
В работе [24] у мышей линии db/db выявлены нарушения пространственной памяти в тесте «Водный
Таблица 6. Результаты тестирования условного рефлекса пассивного избегания
Группа животных Время пребывания, с
1-е тестирование (выработка УРПИ) 2-е тестирование (через 24 ч), краткосрочная память
время входа, с время входа, с число вошедших животных, абс. (%)
К1 40,7±5,3 145,1 ±14,6 5 (50)
К2 50,3±8,3 168,8±11,2 4 (80)
Г3 65,8±7,9 180,0±0,0* 0 (0)*, #
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К1 согласно и-критерию Фишера; # - статистически значимые отличия (р<0,05) от показателя контрольной группы К2 согласно и-критерию Фишера.
лабиринт Морриса», полученный результат авторы связывают с дефицитом рецепторов лептина в гип-покампе. Результаты, полученные в более поздней работе [25], также продемонстрировали нарушения пространственного обучения и памяти у животных линии db/db. Как известно, пищевые продукты, богатые флавоноидами, способствуют восстановлению возрастных нарушения памяти и обучаемости. Так, в многочисленных клинических и доклинических исследованиях было выявлено положительное влияние на память и обучаемость экстрактов чая (Camellia sinensis), гинкго билоба (Ginkgo Biloba), какао (Theobroma cacao) и в том числе черники (Vaccinium spp.) [26-29].
В связи с этим особый интерес представляло изучение влияния низких доз полифенолов листьев черники, сконцентрированных на пищевой матрице, на память и когнитивные функции в тесте УРПИ на генетической линии мышей db/db (табл. 6).
Во время 1-го тестирования - выработки УРПИ, животные всех групп входили в темный отсек камеры (100% выработка рефлекса). Во время тестирования краткосрочной памяти в группе Г3 отсутствовали животные, входившие в темный отсек, что говорит о повышенной обучаемости и высокой степени закрепления памятного следа у этих животных.
Сведения об авторах
Заключение
Центральная нервная система - один из ключевых органов-мишеней при сопутствующих осложнениях СД2 [30]. Нейроповеденческие нарушения проявляются как на диабетических моделях in vivo [1], так и в клинической практике у пациентов с СД2, повышая у них примерно в 2 раза вероятность глубокой депрессии по сравнению с пациентами, не страдающими диабетом [31], и повышая риск смертности. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования полифенолов листьев черники, сорбированных на гречневой муке, при коррекции нарушений центральной нервной системы у мышей нокаутной линии db/db с генетически обусловленным СД2, что в определенной степени указывает на перспективы дальнейших клинических исследований целесообразности включения ФПИ в состав специализированных пищевых продуктов, предназначенных для питания пациентов с СД2.
Финансирование. Исследование выполнено при финансировании Российского научного фонда (проект № 14-36-00041).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Россия): Сидорова Юлия Сергеевна (Sidorova Yuliya S.) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-2168-2659
Петров Никита Александрович (Petrov Nikita A.) - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9755-6002
Шипелин Владимир Александрович (Shipelin Vladimir A.) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-0015-8735
Зорин Сергей Николаевич (Zorin Sergey N.) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2689-6098
Кочеткова Алла Алексеевна (Kochetkova Alla A.) - доктор технических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9821-192X
Мазо Владимир Кимович (Mazo Vladimir K.) - доктор биологических наук, профессор, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3237-7967
Литература
1. Sharma A.N., Elased K.M., Garrett T.L., Lucot J.B. Neurobehav- 2. de la Torre J.C. Pathophysiology of neuronal energy crisis in ioral deficits in db/db diabetic mice // Physiol. Behav. 2010. Vol. 101, Alzheimer's disease // Neurodegener. Dis. 2008. Vol. 5, N 3—4.
N 3. P. 381-388. doi: 10.1016/j.physbeh.2010.07.002 P. 126-132. doi: 10.1159/000113681
3. Zhao W.Q., Townsend M. Insulin resistance and amyloidogenesis as common molecular foundation for type 2 diabetes and Alzheimer's disease // Biochim. Biophys. Acta. 2009. Vol. 1792, N 5. P. 482496. doi: 10.1016/j.bbadis.2008.10.014
4. Dinel A.-L., André C., Aubert A., Ferreira G., Layé S., Castanon N. Cognitive and emotional alterations are related to hippocampal inflammation in a mouse model of metabolic syndrome // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 9. Article ID e24325. doi: 10.1371/journal. pone.0024325
5. Brust K.B., Corbell K.A., Al-Nakkash L., Babu J.R., Broderick T.L. Expression of gluconeogenic enzymes and 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in liver of diabetic mice after acute exercise // Diabetes Metab. Syndr. Obes. Targets Ther. 2014. Vol. 7. P. 495-504
6. Растительные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов антидиабетического действия / под ред B.A. Тутельяна, T.A. Киселевой, A.A. Кочет-ковой. М. : Библио-Глобус, 2016: 422 с.
7. Lamport D.J., Dye L., Wightman J.D., Lawton C.L. The effects of flavonoid and other polyphenol consumption on cognitive performance: a systematic research review of human experimental and epidemiological studies // Nutr. Aging. 2012. Vol. 1. P. 5-25. doi: 10.3233/NUA-2012-0002
8. Rendeiro C.,Vauzour D., Rattray M., Waffo-Téguo P., Mérillon J.M., Butler L.T. et al. Dietary levels of pure flavonoids improve spatial memory performance and increase hippocampal brain-derived neurotrophic factor // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 5. Article ID e63535. doi: 10.1371/journal.pone.0063535
9. Caro D.C., Rivera D.E., Ocampo Y., Franco L.A., Salas R.D. Pharmacological evaluation of mentha spicata L. and plantago major L., medicinal plants used to treat anxiety and insomnia in Colombian Caribbean coast // Evid. Based Complement. Altern. Med. 2018. Vol. 2018. Article ID 5921514. doi: 10.1155/2018/5921514
10. Ben-Azu B., Nwoke E.E., Aderibigbe A.O., Omogbiya I.A., Ajayi A.M., Olonode E.T. et al. Possible neuroprotective mechanisms of action involved in the neurobehavioral property of naringin in mice // Biomed. Pharmacother. 2018. Vol. 109. P. 536-546. doi: 10.1016/j.biopha.2018.10.055
11. Lewandowska U., Szewczyk K., Hrabec E., Janecka A., Gorlach S. Overview of metabolism and bioavailability enhancement of polyphenols // J. Agric. Food Chem. 2013. Vol. 61, N 50. P. 12 183-12 199. doi: 10.1021/jf404439b
12. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B. et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activity of a grape polyphenol-soybean flour complex // J. Agric. Food Chem. 2012. Vol. 60, N 36. P. 8860-8865. doi: 10.1021/ jf300232h.
13. Petrov N.A., SidorovaYu.S.,SarkisyanV.A., FrolovaYu.V.,Zorin S.N., Kochetkova A.A. et al. Complex of polyphenols sorbed on buckwheat flour as a functional food ingredient // Foods Raw Materials. 2018. Vol. 6, N 2. P. 334-341
14. Ehlenfeldt M.K., Prior R.L. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry // J. Agric. Food Chem. 2001. Vol. 49, N 5. P. 2222-2227. doi: 10.1021/jf0013656
15. Debom G., Gazal M., Soares M.S.P. et al. Preventive effects of blueberry extract on behavioral and biochemical dysfunctions in rats submitted to a model of manic behavior induced by ketamine // Brain Res. Bull. 2016. Vol. 127. P. 260-269. doi: 10.1016/ j.brainresbull.2016.10.008
16. Сидорова Ю.С., Шипелин В.A., Петров H.A., Фролова Ю.В., Кочеткова A.A., Мазо В.К. Экспериментальная оценка in vivo
гипогликемических свойств функционального пищевого ингредиента — полифенольной пищевой матрицы // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 5-13.
17. Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи / под ред. В.А. Тутельяна, К.И. Эллера. М. : Династия, 2010. 160 с.
18. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Саркисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценка обогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.
19. Guide for the care and use of laboratory animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington : The National Academies Press, 2011. 248 p.
20. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vaccinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats // Nutrition. 2017. Vol. 41. P. 107-112.
21. Pohanka M. et al. Ferric reducing antioxidant power and square wave voltammetry for assay of low molecular weight antioxidants in blood plasma: performance and comparison of methods // Sensors.
2009. Vol. 9, N 11. P. 9094-9103.
22. Dinel A.-L., André C., Aubert A., Ferreira G., Layé S., Castanon N. Cognitive and emotional alterations are related to hippocampal inflammation in a mouse model of metabolic syndrome // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 9. Article ID e24325. doi: 10.1371/journal. pone.0024325
23. Gutierres J.M., Carvalho F.B., Schetinger M.R., Marisco P., Agostinho P., Rodrigues M. et al. Anthocyanins restore behavioral and biochemical changes caused by streptozotocin-induced sporadic dementia of Alzheimer's type // Life Sci. 2014. Vol. 96, N 1-2. P. 7-17. doi: 10.1016/j.lfs.2013.11.014
24. Li X.L., Aou S., Oomura Y., Hori N., Fukunaga K., Hori T. Impairment of long-term potentiation and spatial memory in leptin receptor-deflcient rodents // Neuroscience. 2002. Vol. 113, N 3. P. 607-615.
25. Oomura Y., Aou S., Fukunaga K. Prandial increase of leptin in the brain activates spatial learning and memory // Pathophysiology.
2010. Vol. 17, N 2. P. 119-127. doi: 10.1016/j.pathophys.2009.04.004
26. Tan L., Yang H. P., Pang W., Lu H., Hu Y. D., Li J. et al. Cyanidin-3-O-galactoside and blueberry extracts supplementation improves spatial memory and regulates hippocampal ERK expression in senescence-accelerated mice // Biomed. Environ. Sci. 2014. Vol. 27, N 3. P. 186-196. doi: 10.3967/bes2014.007
27. Carey A.N., Poulose S.M., Shukitt-Hale B. The beneficial effects of tree nuts on the aging brain // Nutr. Aging. 2012. Vol. 1. P. 55-67.
28. Fragua V., Lepoudère A., Leray V., Baron C., Araujo J.A., Nguyen P. et al. Effects of dietary supplementation with a mixed blueberry and grape extract on working memory in aged beagle dogs // J. Nutr. Sci. 2017. Vol. 6. P. e35. doi: 10.1017/jns.2017.33
29. Oliveira D.R., Sanada P.F., Saragossa Filho A.C., Innocenti L.R., Oler G. et al. Neuromodulatory property of standardized extract Ginkgo biloba L. (EGb 761) on memory: behavioral and molecular evidence // Brain Res. 2009. Vol. 1269. P. 68-89.
30. Laron Z. Insulin and the brain // Arch. Physiol. Biochem. 2009. Vol. 115, N 2. P. 112-116. doi: 10.1080/13813450902949012.
31. Anderson R.J., Freedland K.E., Clouse R.E., Lustman P.J. The prevalence of comorbid depression in adults with diabetes: a meta-analysis // Diabetes Care. 2001. Vol. 24, N 6. P. 1069-1078.
References
Sharma A.N., Elased K.M., Garrett T.L., Lucot J.B. Neurobehavioral deficits in db/db diabetic mice. Physiol Behav. 2010; 101 (3): 381-8. doi: 10.1016/j.physbeh.2010.07.002
de la Torre J.C. Pathophysiology of neuronal energy crisis in Alzheimer's disease. Neurodegener Dis. 2008; 5 (3-4): 126-32. doi: 10.1159/000113681
1.
3. Zhao W.Q., Townsend M. Insulin resistance and amyloidogenesis as common molecular foundation for type 2 diabetes and Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta. 2009; 1792 (5): 482-96. doi: 10.1016/j.bbadis.2008.10.014
4. Dinel A.-L., André C., Aubert A., Ferreira G., Layé S., Castanon N. Cognitive and emotional alterations are related to hippocampal inflammation in a mouse model of metabolic syndrome. PLoS One. 2011; 6 (9): e24325. doi: 10.1371/journal.pone.0024325
5. Brust K.B., Corbell K.A., Al-Nakkash L., Babu J.R., Broderick T.L. Expression of gluconeogenic enzymes and 11p-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in liver of diabetic mice after acute exercise. Diabetes Metab Syndr Obes Targets Ther. 2014; 7: 495-504.
6. Plant sources of phytonutrients for specialized food products with antidiabetic action. Edited by V.A. Tutelyan, T.A. Kiseleva, A.A. Kochetkova. Moscow: Biblio-Globus, 2016: 422 p. (in Russian)
7. Lamport D.J., Dye L., Wightman J.D., Lawton C.L. The effects of flavonoid and other polyphenol consumption on cognitive performance: a systematic research review of human experimental and epidemiological studies. Nutr Aging. 2012; 1: 5-25. doi: 10.3233/ NUA-2012-0002
8. Rendeiro C., Vauzour D., Rattray M., Waffo-Téguo P., Mérillon J.M., Butler L.T., et al. Dietary levels of pure flavonoids improve spatial memory performance and increase hippocampal brain-derived neurotrophic factor. PLoS One. 2013; 8 (5): e63535. doi: 10.1371/ journal.pone.0063535
9. Caro D.C., Rivera D.E., Ocampo Y., Franco L.A., Salas R.D. Pharmacological evaluation of mentha spicata L. and plantago major L., medicinal plants used to treat anxiety and insomnia in Colombian Caribbean coast. Evid Based Complement Altern Med. 2018; 2018: 5921514. doi: 10.1155/2018/5921514
10. Ben-Azu B., Nwoke E.E.,AderibigbeA.O., OmogbiyaI.A.,AjayiA.M., Olonode E.T., et al. Possible neuroprotective mechanisms of action involved in the neurobehavioral property of naringin in mice. Biomed Pharmacother. 2018; 109: 536-46. doi: 10.1016/ j.biopha.2018.10.055
11. Lewandowska U., Szewczyk K., Hrabec E., Janecka A., Gorlach S. Overview of metabolism and bioavailability enhancement of polyphenols. J Agric Food Chem. 2013; 61 (50): 12 183-99. doi: 10.1021/ jf404439b
12. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B., et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activity of a grape polyphenol-soybean flour complex. J Agric Food Chem. 2012; 60 (36): 8860-5. doi: 10.1021/jf300232h
13. Petrov N.A., SidorovaYu.S.,SarkisyanV.A., FrolovaYu.V.,Zorin S.N., Kochetkova A.A., et al. Complex of polyphenols sorbed on buckwheat flour as a functional food ingredient. Foods Raw Materials. 2018; 6 (2): 334-41.
14. Ehlenfeldt M.K., Prior R.L. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry. J Agric Food Chem. 2001; 49 (5): 2222-7. doi: 10.1021/jf0013656
15. Debom G., Gazal M., Soares M.S.P., et al. Preventive effects of blueberry extract on behavioral and biochemical dysfunctions in rats submitted to a model of manic behavior induced by ket-amine. Brain Res Bull. 2016; 127: 260-9. doi: 10.1016/j.brainres-bull.2016.10.008
16. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Frolova Yu.V., Kochetkova A.A., Mazo V.K. The experimental evaluation in vivo of hypo-glycemic properties of functional food ingredient - polyphenolic
food matrix. Voprosy pitaniia [Problems of nutrition]. 2018; 87 (4): 5-13 (in Russian)
17. The methods for analysis of biologically active food substances. Edited by Tutelyan V.A., Eller K.I. Moscow: Dinastiya, 2010: 160 p. (in Russian)
18. Sidorova Yu.S., Zorin S.N., Petrov N.A., Makarenko M.A., Sarki-syan V.A., Mazo V.K., et al. Physiological and biochemical evaluation of rats diet enrichment with docosahexaenoic acid and astaxanthin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (5): 46-55. (in Russian)
19. Guide for the care and use of laboratory animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. 8th ed. Washington: The National Academies Press, 2011: 248 p.
20. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vac-cinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats. Nutrition. 2017; 41: 107-12.
21. Pohanka M., et al. Ferric reducing antioxidant power and square wave voltammetry for assay of low molecular weight antioxidants in blood plasma: performance and comparison of methods. Sensors. 2009; 9 (11): 9094-103.
22. Dinel A.-L., André C., Aubert A., Ferreira G., Layé S., Castanon N. Cognitive and emotional alterations are related to hippocampal inflammation in a mouse model of metabolic syndrome. PLoS One. 2011; 6 (9): e24325. doi: 10.1371/journal.pone.0024325
23. Gutierres J.M., Carvalho F.B., Schetinger M.R., Marisco P., Agostinho P., Rodrigues M., et al. Anthocyanins restore behavioral and biochemical changes caused by streptozotocin-induced sporadic dementia of Alzheimer's type. Life Sci. 2014; 96 (1-2): 7-17. doi: 10.1016/j.lfs.2013.11.014
24. Li X.L., Aou S., Oomura Y., Hori N., Fukunaga K., Hori T. Impairment of long-term potentiation and spatial memory in leptin receptor-deficient rodents. Neuroscience. 2002; 113 (3): 607-15.
25. Oomura Y., Aou S., Fukunaga K. Prandial increase of leptin in the brain activates spatial learning and memory. Pathophysiology. 2010; 17 (2): 119-27. doi: 10.1016/j.pathophys.2009.04.004
26. Tan L., Yang H. P., Pang W., Lu H., Hu Y. D., Li J., et al. Cyanidin-3-O-galactoside and blueberry extracts supplementation improves spatial memory and regulates hippocampal ERK expression in senescence-accelerated mice. Biomed Environ Sci. 2014; 27 (3): 186-96. doi: 10.3967/bes2014.007
27. Carey A.N., Poulose S.M., Shukitt-Hale B. The beneficial effects of tree nuts on the aging brain. Nutr Aging. 2012; 1: 55-67.
28. FraguaV., Lepoudère A., Leray V., Baron C., Araujo J.A., Nguyen P., et al. Effects of dietary supplementation with a mixed blueberry and grape extract on working memory in aged beagle dogs. J Nutr Sci. 2017; 6: e35. doi: 10.1017/jns.2017.33
29. Oliveira D.R., Sanada P.F., Saragossa Filho A.C., Innocenti L.R., Oler G., et al. Neuromodulatory property of standardized extract Ginkgo biloba L. (EGb 761) on memory: behavioral and molecular evidence. Brain Res. 2009; 1269: 68-89.
30. Laron Z. Insulin and the brain. Arch Physiol Biochem. 2009; 115 (2): 112-6. doi: 10.1080/13813450902949012
31. Anderson R.J., Freedland K.E., Clouse R.E., Lustman P.J. The prevalence of comorbid depression in adults with diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 2001; 24 (6): 1069-78.
