CC BY
672
Для корреспонденции
Сидорова Юлия Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: sidorovaulia28@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2168-2659
Сидорова Ю.С., Шипелин В.А., Петров Н.А., Фролова Ю.В., Кочеткова А.А., Мазо В.К.
Экспериментальная оценка in vivo гипогликемических свойств функционального пищевого ингредиента -полифенольной пищевой матрицы
The experimental evaluation in vivo of hypoglycemic properties of functional food ingredient - polyphenolic food matrix
Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Frolova Yu.V., Kochetkova A.A., Mazo V.K.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow
Целью данного исследования было изучение гипогликемического действия функционального пищевого ингредиента (ФПИ) - полифенольной пищевой матрицы в 3-месячном эксперименте in vivo с использованием ожиревших мышей-самцов линии C57BL/6. Пищевую матрицу получали путем инкубации 2% раствора экстракта листьев черники (рН 3,6) с навеской гречневой муки в соотношении 1:50 в течение 45 мин при 25 оС. Содержание фенольных соединений в экспериментальной партии ФПИ составило 26,6±0,5мг-экв галловой кислоты в 1 г муки коричневой гречки. Эксперимент проведен на 46 мышах-самцах линии C57BL/6с. До проведения эксперимента у животных определяли концентрацию глюкозы в крови, проводили пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) натощак, в котором вычисляли показатель площади под кривой (ППК). Животные были рандомизированно разделены (по массе тела, уровню глюкозы и ППК) на 4 группы: контрольную группу К1 (n=10, мыши получали стандартный полусинтетический рацион), контрольную группу К2 (n=10) и 2 опытные группы Г3 и Г4 (n=13). Признаки сахарного диабета 2 типа у животных групп К2, Г3 и Г4 моделировали с применением изоазотистого высокожирового высокоуглеводного рациона (ВЖВУ-рацион, 30% жира, 20% сахарозы). В рацион животных групп Г3 и Г4 вносили ФПИ в количестве соответственно 2,5 и 5 г/100 г рациона. Повторный ПГТТ проводили на 40-е и 82-е сутки. На 15,54 и на 91-е сутки проводили тест на инсулинорезистентность. Вследствие потребления ВЖВУ-рациона у животных группы К2 к 11-й неделе развилось ожирение, характеризуемое статистически значимым увеличением прироста массы тела (37,1±4,9%) по сравнению с животными группы К1 (23,4±2,2%). Введение в рацион животных ФПИ заметно снижало у них прибавку массы тела по сравнению с животными группы К2. К 8-й неделе эксперимента выявлено статистически значимое увеличение концентрации глюкозы в крови животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион
Для цитирования: Сидорова Ю.С., Шипелин В.А., Петров Н А., Фролова Ю.В., Кочеткова А.А., Мазо В.К. Экспериментальная оценка in vivo гипогликемических свойств функционального пищевого ингредиента - полифенольной пищевой матрицы // Вопр. питания. 2018. Т. 87, № 4. С. 5-13. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10036. Статья поступила в редакцию 29.11.2017. Принята в печать 13.07.2018.
For citation: Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Frolova Yu.V., Kochetkova A.A., Mazo V.K. The experimental evaluation in vivo of hypoglycemic properties of functional food ingredient - polyphenolic food matrix. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2018; 87 (4): 5-13. doi: 10.24411/0042-8833-2018-10036. (in Russian) Received 29.11.2017. Accepted for publication 13.07.2018.
(К2 - 8,2±0,3 ммоль/л, Г3 - 8,1±0,3 ммоль/л и Г4 - 8,5±0,3 ммоль/л), по сравнению с мышами группы К1 (7,1 ±0,3 ммоль/л). На 91-е сутки эксперимента эта разница оставалась значимой только для группы К2 (9,3±0,6 ммоль/л против 7,7±0,3ммоль/л для группы К1), что свидетельствует о благоприятном гипогли-кемическом действии ФПИ в обеих дозировках (для группы Г3 8,5±0,2 ммоль/л и для группы Г4 8,4±0,3 ммоль/л). К 8-й неделе эксперимента у животных контрольной группы К2 выявлено нарушение толерантности к глюкозе, что является одним из проявлений сахарного диабета 2 типа. Профилактическое введение в рацион животных группы Г3 ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона тормозило развитие симптомов данного заболевания. Профилактическое введение в рацион животных группы Г4 высокой дозы ФПИ (5,0 г/100 г рациона) в определенной степени препятствовало увеличению инсулинорезистентности. Введение в рацион ФПИ не оказывало влияния на когнитивные функции животных, на кратко - и долгосрочную память.
Ключевые слова: полифенолы, экстракт листьев черники, пищевая матрица, мыши, гипергликемия, ожирение, инсулинорезистентность, глюкозотолерантность
The aim of this study was the evaluation of hypoglycemic action of functional food ingredient (FFI) - a polyphenol food matrix in 3-month in vivo experiment with the use of fat male mice C57BL/6. The food matrix was produced by means of incubation of bilberry leaves extract (2% solution, pH 3.6) with buckwheat flour in ratio 1:50 during 45 min at 25 oC. The polyphenol content in experimental batch of matrix was 26.6+0.5 mg-equivalent of gallic acid per 1 g of flour. The experiment was conducted with the use of 46 male mice C57Bl/6c. Blood glucose level was estimated before starting the feeding experiment. An oral fasting glucose tolerance test (GTT) was also conducted, the area under the curve (AUC) was calculated. The animals were randomly divided into 4 groups (according to the body weight, glucose level and AUC): control group K1, fed with standard semisynthetic diet, control group K2 (n=10) and experimental groups G3 and G4 (n= 13). The symptoms of type 2 diabetes in groups K2, G3 and G4 were modeled with the use of high-fat high-carbohydrate diet (HFHC diet, 30% fat, 20% sucrose). FFI was included into the diet of animals of experimental groups G3 and G4 in doses 2.5 and 5 g per 100 g of ration, respectively. The GTT test was repeated on the 40th and 82nd days of experiment. On the 15th, 54th and 91st days the insulin resistance test (IRT) was conducted. The consumption of HFHC diet by K2 group animals resulted in development of obesity in these animals to the week 11, which was characterized by increase in the body weight gain (37.1+4.9%) in comparison with control group K1 animals (23.4+2.2%). The introduction of FFI into animal's diet decreased significantly body weight gain of these animals in comparison with K2 group. On the week 8, the significant increase in blood glucose level of animals fed with HFHC diet was found (K2 - 8.2+0.3, G3 - 8.1+0.3, G4 - 8.5+0.3 mmol/L), in comparison with control group K1 (7.1+0.3 mmol/L). On the 91st day of experiment this difference remained significant only for group K2 (9.3+0.6 against K1 group - 7.7+0.3 mmol/L), what shows the beneficial hypoglycemic action of the FFI in both doses (for G3 group - 8.5+0.2, for G4 - 8.4+0.3 mmol/L). On the week 8 the disorder in glucose tolerance was found in animals of group K2, what is one of type 2 diabetes symptoms. The introduction of FFI in a dose 2.5 g/100 g into group G3 diet inhibited the development of these disease symptoms. The introduction of FFI in a higher dose (5 g/100 g of a diet) to a certain extent inhibited the development of insulin resistance. There was no effect of FFI, introduced into animal's diet, on cognitive functions and short-term and long-term memory. Keywords: polyphenols, bilberry leaves extract, food matrix, hyperglycemia, obesity, insulin resistance, glucose tolerance
В области клинической диетологии и нутрициологии разработка новых специализированных пищевых продуктов, эффективность которых должна устанавливаться с позиций доказательной медицины, признана приоритетной. Перспективным подходом к созданию специализированных пищевых продуктов профилактического антидиабетического действия является включение в их состав природных функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), целенаправленно корригирующих
нарушения углеводного и липидного обмена и тем самым снижающих риск развития сахарного диабета 2 типа и связанных с ним клинических проявлений. Экспериментальная оценка эффективности и безопасности в экспериментах in vivo является необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям специализированных пищевых продуктов, позволяет оптимизировать поиск входящих в их состав биологически активных соединений [1].
Все возрастающий интерес к вопросу использования индивидуальных растительных полифенолов как таковых или в составе экстрактов при метаболических нарушениях обусловлен результатами исследований, доказывающих эффективность и безопасность их применения за счет реализации одного из основных принципов фитотерапии: действия не только на пораженный орган, но и на сопряженные системы организма [2].
В серии наших предыдущих исследований были протестированы гипогликемические и гиполипидемические свойства водного раствора сухого экстракта листьев черники в опытах in vivo при использовании диабетической генетической линии тучных крыс-самцов Zucker Diabetic Fatty [3] и крыс-самцов линии Wistar c развившимися диабетическими проявлениями, индуцированными введением стрептозотоцина в сочетании с потреблением высокофруктозного рациона [4]. Полученные результаты, во-первых, свидетельствовали об определенном благоприятном воздействии экстракта листьев черники на углеводный и липидный обмен в организме использованных в эксперименте диабетических животных, а во-вторых, определили задачу, связанную с дальнейшим повышением эффективности разрабатываемого полифенольного ингредиента. Одним из перспективных технологических подходов, позволяющих защищать полифенольные соединения от деградации в пищеварительном тракте, повышать стабильность при хранении и концентрировать в пищевом продукте является сорбция на белковых матриксах [5]. Путем сорбции водного раствора сухого экстракта листьев черники на муке коричневой гречки нами получена пищевая матрица [6] для дальнейшего использования в качестве ФПИ в составе специализированных пищевых продуктов для лиц с нарушениями углеводного и липидного обмена.
Цель данного исследования - изучить гипоглике-мическое действие полифенольной пищевой матрицы в 3-месячном эксперименте in vivo с использованием ожиревших мышей-самцов линии C57BL/6.
Материал и методы
Для получения пищевой матрицы использовали муку коричневой гречки (ООО «Хлебзернопродукт», Россия) с массовой долей белка 9,7% и сухой экстракт листьев черники (ООО «Хармс», Россия) с содержанием полифенольных соединений 95,0±1,1 мг-экв галловой кислоты. ФПИ получали путем сорбции полифеноль-ных соединений из водного раствора сухого экстракта листьев черники на муке коричневой гречки путем инкубации 2% раствора экстракта (рН 3,6) с навеской гречневой муки в соотношении 1:50 раствора в течение 45 мин при 25 °С [6].
Определение санитарно-химических и санитарно-микробиологических показателей экспериментальной партии ФПИ для проведения исследования in vivo подтвердило их соответствие требованиям ТР ТС 021/21
«О безопасности пищевой продукции». Содержание фе-нольных соединений в экспериментальной партии ФПИ составило 26,6±0,5 мг-экв галловой кислоты в 1 г муки коричневой гречки.
Эксперимент проведен на 46 мышах-самцах линии С57Б1_/6с, полученных из питомника лабораторных животных Филиал «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил лабораторной практики» и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Животных содержали по 4 мыши в клетке в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20-26 °С, относительная влажность 30-60%, 12-часовой цикл освещения).
Исходная масса тела животных на начало эксперимента составила 20±2 г.
До проведения эксперимента у животных оценивали концентрацию глюкозы в крови (животных депривиро-вали голодом 4 ч) и проводили пероральный глюкозото-лерантный тест (ПГТТ) натощак для оценки состояния углеводного обмена.
Для определения концентрации глюкозы у животных отбирали кровь из хвостовой вены, уровень глюкозы определяли с помощью портативного электрохимического глюкометра («OneTouch Select», США). При проведении ПГТТ животным всех экспериментальных групп вводили 2 г глюкозы на 1 кг массы тела животного в виде 30% раствора. Отбирали кровь для определения уровня глюкозы до введения глюкозы (0-я точка), через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости концентрации глюкозы в крови от времени после введения глюкозной нагрузки, определяли значение площади под кривой (ППК, ммоль/лх180 мин).
Животных рандомизировали (по массе тела, уровню глюкозы и показателю ППК) на 4 группы: контрольную группу К1 (n=10 мышей), контрольную группу К2 (n=10) и 2 опытные группы Г3 и Г4 (n=13). Результаты распределения представлены в табл. 1. На рис. 1 приведены кривые, полученные в ПГТТ.
Животные группы К1 на протяжении всего эксперимента получали стандартный полусинтетический рацион. Животные групп К2 и Г3, Г4 получали модифицирован-
Группы:
— К1 ..........К2
— Г3 ....... Г4
.О 20,0
О м
м 15,0
со
Я 10,0
Е
X 5,0
е 00
о р > 0,0
30
60 120 Время, мин
180 240
Рис. 1. Кривые глюкозотолерантности
0
Таблица 1. Исходные показатели массы тела, уровня глюкозы и площади под кривом (ППК)
Показатель Группа __К1 К2
Масса тела, г__20,2±0,5__20,1±0,6
Концентрация глюкозы, ммоль/л 8,3±0,6 8,1 ±0,3
ППК, ммоль/лх180 мин 1402±128 1466±103
Здесь и в табл. 2: расшифровка аббревиатур дана в тексте. Таблица 2. Состав полусинтетических рационов
Г3
19,8±0,5
Г4
20,0±0,3
8,5±0,4
8,0±0,3
1587±136
1533±98
Компоненты Содержание на 100 г корма, г
К1 К2 Г3 Г4
Казеин, г 25,0 25,0 25,0 25,0
Жировая композиция подсолнечное масло, г 5,0 5,0 5,0 5,0
лярд, г 5,0 25,0 25,0 25,0
Крахмал, г 58,0 18,0 15,5 13,0
Сахароза, г - 20,0 20,0 20,0
ФПИ, г - - 2,5 5,0
Минеральная смесь, г [7] 4,0 4,0 4,0 4,0
Смесь жирорастворимых витаминов, мл [7] 1,0 1,0 1,0 1,0
Смесь водорастворимых витаминов, г [7] 0,1 0,1 0,1 0,1
Калорийность, ккал 380±2 493±3 492±2 491 ±3
ный изоазотистый высокожировой высокоуглеводный рацион (ВЖВУ-рацион). В рацион животных опытной группы Г3 вносили ФПИ (разработанную пищевую матрицу) в количестве 2,5 г на 100 г корма и в рацион опытной группы Г4 вносили ФПИ в количестве 5 г/100 г рациона. Состав рационов представлен в табл. 2.
Животные всех групп на протяжении эксперимента получали питьевую воду, фильтруемую системой RiOS 30 («Merck», Германия), ad libitum. 2 раза в неделю контролировали потребление корма, 1 раз в неделю животных взвешивали. 1 раз в 2 нед у животных измеряли концентрацию глюкозы в крови. Повторный ПГТТ проводили на 40-е и 82-е сутки.
На 15, 54 и на 91-е сутки проводили тест на чувствительность к инсулину (инсулинорезистентность). Животных депривировали голодом в течение 4 ч. Отбирали кровь из хвостовой вены и определяли концентрацию глюкозы (0-я точка). Животным всех экспериментальных групп вводили инсулин внутрибрюшинно в дозе 0,25 Ед на 1 кг массы тела. Измеряли концентрацию глюкозы в крови через 30, 60, 120 и 180 мин. Строили кривые зависимости уровня глюкозы от времени после введения инсулина, определяли значение ППК (в ммоль/лх180 мин).
В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) изучали поведение животных в условиях переменной стрессогенности, т.е. при свободном выборе комфортных условий, что позволяет оценить их уровень тревожности. При тестировании регистрировали число заходов и время пребывания в закрытых (ЗР) и открытых рукавах (ОР), общую исследовательскую активность [7]. 1-е тестирование проводили на 40-й день эксперимента, 2-е - на 90-й день эксперимента. Перемещение мышей по лабиринту регистрировали с помощью системы видеонаблюдения «Smart 3.0.04» (Panlab Harvard Apparatus, Испания).
Поведение и память животных оценивали, используя тест «Условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ) [8]. При обучении мышь однократно помещали в светлый отсек камеры спиной к темному отсеку. Регистрировали латентный период пребывания в светлом отсеке камеры. Как только мышь переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,2 мА в течение не более 8 с). Через 24 ч после обучения у животных проверяли сохранность памятного следа. Латентный период пребывания в светлом отсеке камеры при тестировании является показателем, характеризующим степень запоминания мышью отрицательного опыта - удара током, который она приобрела в темном отсеке камеры во время его первого посещения при обучении. С целью оценки влияния экспериментальных рационов на процессы забывания тестирование сохранения памятного следа проводили спустя отдаленный интервал времени - через 3 нед. Обучение проводили на 49-е сутки эксперимента, проверку обучения -на 50-е сутки эксперимента и оценку долгосрочной памяти проводили на 70-е сутки периода кормления.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 20 («IBM», США), используя непараметрический ранговый критерий Манна-Уитни и критерий Стьюдента. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Общее состояние животных контрольной группы К1 по внешнему виду, качеству шерстного покрова, потреблению корма и воды, поведению и скорости
роста при ежедневном осмотре на протяжении всего эксперимента было удовлетворительным. Общее состояние животных контрольной группы К2 и опытных групп Г3, Г4 по внешнему виду и качеству шерстного покрова отличалось от такового контрольной группы К1, шерсть у животных была жирная, тонкая, редкая и взъерошенная. Животные группы Г4, получавшие ФПИ в дозе 5 г на 100 г корма, отличались повышенной агрессивностью.
Потребление корма животными всех групп представлено на рис. 2.
На протяжении всего эксперимента мыши, получавшие ВЖВУ-рацион, достоверно меньше потребляли корма по сравнению с животными контрольной группы К1, получавшими стандартный рацион, что, вероятно, связано с большей калорийностью ВЖВУ-корма. При этом животные опытных групп Г3 и Г4 потребляли достоверно меньше корма по сравнению с животными контрольной группы К2. Такой результат можно объяснить снижением аппетита на фоне потребления ФПИ.
На рис. 3 представлена кривая прироста массы тела животных.
Несмотря на большую потребляемость ВЖВУ-раци-она животными контрольной группы К2, прирост массы тела животных этой группы до 77-х суток статистически значимо не отличался от прироста массы тела животных других групп. Также на данном этапе эксперимента не выявлено отличий по показателю прироста массы тела у животных, получавших стандартный рацион (группа К1), и животных, получавших ВЖВУ-рацион (все остальные группы). На 77-е сутки эксперимента статистически зна-
Группы:
14 21 28 35 40 42 49 54 56 63 70 77 82 84 91 93
Сутки эксперимента
Рис. 3. Прирост массы тела животных, %
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К1.
чимо выше по сравнению с группой контроля К1 была прибавка массы тела животных группы К2, получавших ВЖВУ-рацион. Полученный результат может свидетельствовать о начале развития признаков ожирения у животных контрольной группы К2, получавших ВЖВУ-рацион, к 11-й неделе эксперимента. К 13-й неделе экс-
S 3,0-
° 1,0-
_*#
■
Г1
Г2
Г3
Г4
Группы
Рис. 2. Среднее потребление корма животными за весь эксперимент, г/сут на мышь
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К1; # - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К2.
*
#
*
10,0-
9,0-
я
с
8,0-
7,0-
6,0
14
28 42 54
Сутки эксперимента
67
""Г"
91
Рис. 4. Мониторинг концентрации глюкозы в крови животных
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К1.
Таблица 3. Изменения площади под кривой (ППК) при пероральном глюкозотолерантном и инсулинорезистентном тестах
*
Группа Глюкозотолерантность ППК, ммоль/л х 180 мин Инсулинорезистентность ППК, ммоль/л х 180 мин
40-е сутки 82-е сутки 15-е сутки 54-е сутки 91-е сутки
К1 815±35 812±89 601±53 630±39 496±53
К2 933±19* 1025±32* 685±30 723±21* 738±57*
Г3 909±41 1009±54 628±59 741±41 * 715±57*
Г4 984±47* 1083±54* 518±35# 547±53# 724±49*
П р и м е ч а н и е. * - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К1; # - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К2.
перимента разница между вышеуказанными группами оставалась значимой. При этом видно, что начиная с 10-й недели эксперимента прибавка массы тела животных контрольной группы К1 оставалась практически неизменной, тогда как поедаемость корма не снижалась. Животные всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, продолжали равномерно набирать массу тела, при этом ее прирост у животных групп Г3 и Г4, получавших ФПИ в различных дозировках, вплоть до 13-й недели статистически значимо не отличался от показателя контрольной группы К1.
На рис. 4 представлена динамика концентрации глюкозы в крови.
На 42-е сутки эксперимента (6-я неделя кормления) разница в концентрации глюкозы для всех групп нивелировалась, наметилась тенденция к увеличению концентрации глюкозы в крови животных контрольной группы К2 и опытных групп Г3 и Г4. На 54-е сутки эксперимента концентрация глюкозы в крови животных контрольной группы К2 и животных опытных групп Г3 и Г4 статистически значимо отличалась от таковой для животных контрольной группы К1, получавших стандартный рацион.
Выявленное различие говорит о развитии гипергликемии к 8-й неделе эксперимента на фоне приема животными ВЖВУ-рациона. На 91-е сутки эксперимента статистически значимо выше концентрация глюкозы в крови была только у животных группы К2 по сравнению с таковой у животных группы К1. Концентрация глюкозы в крови животных опытных групп Г3 и Г4 от животных группы К1 достоверно не отличалась и, в отличие от группы К2, не только не продолжила расти, но и начала снижаться.
В табл. 3 представлены результаты ПГТТ и инсулино-резистентного теста.
Глюкозотолерантность
Из данных, представленных в табл. 3, следует, что у животных контрольной группы К1 показатель ППК оставался постоянным. На 40-е сутки эксперимента у животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, был отмечен рост ППК, причем у животных групп К2 и Г4 увеличение было достоверным. На 82-е сутки эксперимента ППК только для животных группы Г3, получавших ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона, не отличалась статистически значимо от ППК для животных группы К1.
Таблица 4. Результаты теста «Приподнятый крестообразный лабиринт»
Группа 1-е тестирование 2-е тестирование
переходы время пребывания в открытых рукавах, с время пребывания в закрытых рукавах, с дистанция, см переходы время пребывания в открытых рукавах, с время пребывания в закрытых рукавах, с дистанция, см
К1 31 ±4 39,2±9,0 220,7±11,5 1507,0±116,3 19±3* 30,2±8,7 228,9±17,2 1009,2±142,7*
К2 39±4 70,9±14,1 181,0±12,5 1795,1±138,8 26±4* 79,2±23,0# 180,3±24,4# 1298,9±167,9*
Г3 30±4 51,6±13,6 209,4±14,2 1415,4±146,2 17±4* 51,8±22,5 219,8±29,0 986,5±150,9*
Г4 30±3 49,3±11,2 213,3±14,3 1440,4±143,1 18±4* 26,1 ±8,8$ 238,1 ±13,2$ 1175,6±175,0
П р и м е ч а н и е. Статистически значимое (р<0,05) отличие согласно критерию Стьюдента: * - от показателя при 1-м тестировании; # - от показателя животных контрольной группы К1; $ - от показателя животных контрольной группы К2.
Таблица 5. Результаты тестирования на «Условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ)
Группа Время входа, с
1-е тестирование (выработка УРПИ) 2-е тестирование (через 24 ч), краткосрочная память 3-е тестирование (через 3 нед), долгосрочная память
К1 87,3±24,6 180,0 180,0
К2 94,2±13,8 180,0 161,6±11,6
Г3 96,0±13,7 180,0 180,0
Г4 72,9±10,9 163,4±16,6 145,8±22,6*
* - статистически значимое (р<0,05) отличие от показателя животных контрольной группы К1.
Инсулинорезистентность
Показатель ППК в тесте на инсулинорезистентность на 15-е и 45-е сутки был наименьшим у животных группы Г4, получавших ФПИ в дозе 5,0 г/100 г рациона. К 90-м суткам эксперимента у мышей всех опытных групп показатель ППК достоверно возрос по сравнению с контрольной группой К1.
Результаты физиологических тестов
Как видно из данных, представленных в табл. 4, при 1-м тестировании, проводимом на 40-е сутки кормления, не было отмечено достоверных различий между всеми группами по показателям общей активности: общему числу переходов между рукавами лабиринта и пройденной дистанции; время, проведенное в ОР и ЗР, между группами также достоверно не различалось.
При 2-м тестировании, проводимом на 90-е сутки кормления, отмечено статистически значимое снижение показателей общей исследовательской активности: общего числа переходов у животных всех групп по сравнению с 1-м тестированием и общей пройденной дистанции у мышей из групп К1, К2, Г3 по сравнению с 1-м тестированием. Статистически значимое отличие по показателю пройденной дистанции не выявлено только для животных группы Г4, получавших ФПИ в дозе 5 г на 100 г рациона. По показателям тревожности не выявлено различий между группами в 1-м и во 2-м тестировании. Однако животные группы К2 проводили достоверно больше времени в ОР и достоверно меньше в ЗР по сравнению с мышами контрольной группы К1 на 90-е сутки эксперимента. Полученный результат говорит о возможном снижении тревожности у животных контрольной группы К2 по сравнению с животными группы К1.
В табл. 5 представлены результаты выработки УРПИ на 49, 50 и 70-е сутки эксперимента.
Во время 1-го тестирования - выработки УРПИ животные всех групп входили в темный отсек камеры (100% выработка рефлекса). На 2-е сутки тестирования краткосрочной памяти статистически значимых различий во времени латентного входа в темную камеру животных всех групп не выявлено. Через 3 нед при тестировании долгосрочной памяти также не выявлено значимых различий между группами.
Таким образом, полученные нами данные хорошо согласуются с результатами работы [9], в которой в опытах in vivo также с использованием мышей линии C57BL/6J было установлено выраженное гипогликеми-ческое действие комплекса обезжиренной соевой муки с полифенолами сока черники. Этими же авторами было показано, что сорбция полифенолов на обезжиренной соевой муке повышала их устойчивость к разложению при высоких температурах и низких значениях pH [10]. Комплексная оценка стабильности разработанного ФПИ при различных условиях хранения составит предмет наших дальнейших исследований
Выводы
1. Потребление ВЖВУ-рациона животными группы К2 привело к развитию у них к 11-й неделе ожирения, характеризуемого статистически значимым увеличением массы тела по сравнению с животными контрольной группы К1, получавшей стандартный полусинтетический рацион. Введение в рацион животных ФПИ (полифенольной пищевой матрицы) заметно снижало у них прибавку массы тела по сравнению с животными контрольной группы К2.
2. К 8-й неделе эксперимента выявлено статистически значимое увеличение концентрации глюкозы в крови животных всех групп, получавших ВЖВУ-рацион, по сравнению с контрольной группой К1. На 91-е сутки эксперимента эта разница оставалась значимой только для контрольной группы К2, что говорит о благоприятном гипогликемическом действии ФПИ в обеих дозировках.
3. К 8-й неделе эксперимента у животных контрольной группы К2 выявлено нарушение толерантности к глюкозе, что является одним из проявлений сахарного диабета 2 типа. Профилактическое введение в рацион животных группы Г3 ФПИ в дозе 2,5 г/100 г рациона тормозило развитие симптомов данного заболевания.
4. Профилактическое введение в рацион животных группы Г4 высокой дозы ФПИ (5,0 г/100 г рациона)
в определенной степени препятствовало увеличению инсулинорезистентности. Показатель ППК в тесте на инсулинорезистентность на 15-е и 45-е сутки был наименьшим у группы Г4.
5. Введение в рацион функционального пищевого ингредиента не оказывало влияния на когнитивные функции животных, на краткосрочную и долгосрочную память.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-3600041).
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Сидорова Юлия Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: sidorovaulia28@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2168-2659
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: v.shipelin@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-0015-8735
Петров Никита Александрович - младший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома
E-mail: petrov-nikita-y@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-9755-6002
Фролова Юлия Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений
метаболома
E-mail: himic14@mail.ru
https://orcid.org/0000-0001-6065-2244
Кочеткова Алла Алексеевна - доктор технических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: kochetkova@ion.ru https://orcid.org/0000-0001-9821-192X
Мазо Владимир Кимович - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории алиментарной коррекции нарушений метаболома E-mail: mazo@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3237-7967
Литература
1. Мазо В.К., Сидорова Ю.С., Шипелин В.А., Петров Н.А., Кочет- 4. кова А.А. Полифенольные растительные экстракты: влияние
на нарушения углеводного и липидного обмена у лабораторных грызунов // Пробл. эндокринол. 2016. Т. 62, № 4. С. 38-44. 5.
2. Тутельян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А. Растительные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов антидиабетического действия / под ред. В.А. Тутелья-на, Т.Л. Киселевой, А.А. Кочетковой. М. : БИБЛИО-ГЛОБУС, 2016. 422 с. 6.
3. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Comparative studies of antidiabetic activity of bilberry leaf extract in Wistar rats with STZ-induced diabetes and Zucker diabetic fatty rats // Int. Food Res. J. 2018. Vol. 25, N 3. P. 1288-1294.
Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vac-cinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats // Nutrition. 2017. Vol. 41. P. 107-112. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B. et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activity of a grape polyphenol-soybean flour complex // J. Agric. Food Chem. 2012. Vol. 60, N 36. P. 8860-8865. doi: 10.1021/ jf300232h.
Петров Н.А., Семин М.О. Разработка методики получения комплекса полифенолов экстракта листьев черники, сорбированных на белковом матриксе // Актуальные вопросы нутрициологии, биотехнологии и безопасности пищи : материалы Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием. М., 2017. С. 97-101.
7. Сидорова Ю.С., Зорин С.Н., Петров Н.А., Макаренко М.А., Саркисян В.А., Мазо В.К. и др. Физиолого-биохимическая оценка обогащения рациона крыс докозагексаеновой кислотой и астаксантином // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 5. С. 46-55.
8. Valcheva-Kuzmanova S.V., Eftimov M.T., Tashev R.E., Belcheva I.P., Belcheva S.P. Memory effects of Aronia melanocarpa fruit juice in a passive avoidance test in rats // Folia Med. (Plovdiv). 2014. Vol. 56, N 3. P. 199-203.
9. Roopchand D.E., Kuhn P., Rojo L.E., Lila M.A., Raskin I. Blueberry polyphenol-enriched soybean flour reduces hyperglycemia, body weight gain and serum cholesterol in mice // Pharmacol. Res. 2013. Vol. 68, N 1. doi: 10.1016/j.phrs.2012.11.008.
10. Roopchand D.E., Grace M.H., Kuhn P., Cheng D.M., Plundrich N., Poulev A. et al. Efficient sorption of polyphenols to soybean flour enables natural fortification of foods // Food Chem. 2012. Vol. 131, N 4. P. 1193-1200. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.09.103.
References
1. Mazo V.K., Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Polyphenol plant extracts: the impact on carbohydrate and lipid metabolism disorders in laboratory animals. Problemy endokrinologii [Problems of Endocrinology]. 2016; 62 (4): 38-44. (in Russian)
2. Tutelyan V.A., Kiseleva T.L., Kochetkova A.A. Plant sources of phyto-nutrients for specialized food products with antidiabetic activity. In: V.A. Tutelyan, T.L. Kiseleva, A.A. Kochetkova (eds). Moscow: BIBLIO-GLOBUS, 2016: 422 p. (in Russian)
3. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Comparative studies of antidiabetic activity of bilberry leaf extract in Wistar rats with STZ-induced diabetes and Zucker diabetic fatty rats. Int Food Res J. 2018; 25 (3): 1288-94.
4. Sidorova Yu.S., Shipelin V.A., Mazo V.K., Zorin S.N., Petrov N.A., Kochetkova A.A. Hypoglycemic and hypolipidemic effect of Vac-cinium myrtillus L. leaf and Phaseolus vulgaris L. seed coat extracts in diabetic rats. Nutrition. 2017; 41: 107-12.
5. Roopchand D.E., Kuhn P., Poulev A., Oren A., Lila M.A., Fridlender B., et al. Biochemical analysis and in vivo hypoglycemic activity of a grape polyphenol-soybean flour complex. J Agric Food Chem. 2012; 60 (36): 8860-5. doi: 10.1021/jf300232h.
6. Petrov N.A., Semin M.O. The development of method for obtaining the complex of polyphenols from bilberry leaves extract, sorbed on
protein matrix. In: Aktualnye voprosy nutritsiologii, biotehnologii i bezopsanosti pitschi materialy Vserossiiskoy konferentsii molodyh uchenyh s mezhdunarodnym uchastiem [Actual Problems of Nutrition, Biotechnology and Food Safety. The proceedings of Russian Conference for Young Scientists with International Participation]. Moscow, 2017: 97-101. (in Russian)
7. Sidorova Yu.S., Zorin S.N., Petrov N.A., Makarenko M.A., Sarki-syan V.A., Mazo V.K., et al. Physiological and biochemichal evaluation of enrichment the rats diet with docosahexaenoic acid and astaxanthin. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; 84 (5): 46-55. (in Russian)
8. Valcheva-Kuzmanova S.V., Eftimov M.T., Tashev R.E., Belcheva I.P., Belcheva S.P. Memory effects of Aronia melanocarpa fruit juice in a passive avoidance test in rats. Folia Med (Plovdiv). 2014; 56 (3): 199-203.
9. Roopchand D.E., Kuhn P., Rojo L.E., Lila M.A., Raskin I. Blueberry polyphenol-enriched soybean flour reduces hyperglycemia, body weight gain and serum cholesterol in mice. Pharmacol Res . 2013; 68 (1). doi: 10.1016/j.phrs.2012.11.008.
10. Roopchand D.E., Grace M.H., Kuhn P., Cheng D.M., Plundrich N., Poulev A., et al. Efficient sorption of polyphenols to soybean flour enables natural fortification of foods. Food Chem. 2012; 131 (4): 1193-200. doi: 10.1016/j.foodchem.2011.09.103.
