CC BY
378
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.155-074:681.5
Д. Ю. Соснин, О. Ю. Ненашева, Б. Ф. Фалков, Л. А. Трушева
ВЛИЯНИЕ ПОДГОТОВКИ МАЗКА КРОВИ НА ЭффЕКТИВНОСТь РАБОТЫ цИфРОВОй СИСТЕМЫ АВТОМАТИчЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ VisioN НЕМА
ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е. А. Вагнера, ООО WestMedica
Изучено влияние стандартизации подготовки мазков крови на эффективность работы системы Vision Hema. Проведен анализ результатов подсчета 200лейкоцитов в 30мазках крови, приготовленных из ЭДТА-стабилизированной венозной крови на тщательно обезжиренных предметных стеклах с использованием автомата для приготовления мазков крови (группа сравнения), и 49 препаратов, приготовленных ручным способом из нестабилизированной капиллярной крови (контрольная группа). Стандартизация процедуры подготовки стеклопрепаратов привела к снижению общего числа артефактов в 5 раз, исчезновению агрегатов тромбоцитов и клеток плоского эпителия, уменьшению в 2,4 раза абсолютного количества разрушенных лейкоцитов и в 9,5 раза частиц грязи. Предложенный способ подготовки мазка увеличил скорость автоматического анализа лейкоцитарной формулы системой Vision Hema в 2 раза и в 3 раза ускорил валидацию полученных результатов врачом.
Ключевые слова: морфологический анализ клеток крови, стандартизация подготовки препарата крови, цифровая система автоматического анализа крови
D.Yu. Sosnin, O.Yu. Nenasheva, B.F. Falkov, L.A. Trusheva
THE IMPACT OF BLOOD SMEAR PREPARATION ON EFFECTIVENESS OF FUNCTIONING OF VISION HEMA -THE DIGITAL SYSTEM OF AUTOMATIC BLOOD ANALYSIS
The article deals with study of the impact of standardization of blood smears preparation on effectiveness of functioning of Vision Hema system. The analysis was applied to the results of counting of200 leukocytes in 30 blood smears prepared from venous blood stabilized with ethylenediaminetetraacetic acid using thoroughly degreased slide plates and applying automatic device to prepare blood smears (comparative group) and in 49 preparations prepared manually from non-stabilized capillary blood (control group). The standardization of the procedure ofpreparation of glass samples resulted in five time decrease of total amount of artifacts and in disappearance of thrombocytes aggregates and pavement epithelium cells. The absolute amount of destroyed leukocytes decreased in 2.4 times and particles of dirt in 9.5 time. The proposed technique ofpreparation of smear increased velocity of automatic analysis of leukogram by the Vision Hema system in 2 times and speeded up validation by physician of derived results in 3 times.
Key words: morphologic analysis of blood cells, standardization of preparation of blood sample, digital system of automatic blood analysis
Современное развитие гематологических исследований характеризуется широким внедрением различных автоматизированных приборов [2, 4]. Использование гематологических анализаторов, осуществляющих диф-ференцировку пяти классов лейкоцитов, привело к существенному сокращению числа микроскопических исследований мазков крови, но не исключило их полностью [3, 8]. Морфологический анализ клеток крови по-прежнему остается наиболее распространенным видом лабораторного анализа. В крупных лабораториях на его долю приходится до 5-6% всех выполняемых исследований.
В практике разработаны и внедряются различные системы, предназначенные для морфологического анализа клеток крови [3, 5, 7]. Их использование повышает эффективность работы сотрудников клинико-диагностических лабораторий, объективизирует результаты анализа [6]. Применение таких высокотехнологичных систем морфологического анализа крови предъявляет более высокие требования к качеству подготовки мазка крови, так как система автоматического анализа крови часто фиксирует изображение каких-либо объектов, не являющихся лейкоцитами (артефактов). Необходима выработка стан-
Для корреспонденции:
Соснин Дмитрий Юрьевич, д-р мед. наук, доц. курса клин. лаб. ди-агн. ФПК и ППС
Адрес: 614017, Пермь, ул. Уральская, 95/136 Телефон: 8(342)230-22-37 E-mail: sosnin_dm@mail.ru
дарта подготовки препарата крови, обеспечивающего высокое качество его автоматического анализа.
Цель исследования - оценить влияние различных способов подготовки мазков крови на эффективность работы цифровой системы анализа клеток крови, оценку морфологии клеток, а также на количество и состав артефактов, обнаруживаемых системой.
Материалы и методы. Проведена сравнительная оценка результатов автоматического анализа мазков крови, приготовленных различными способами, здоровых взрослых людей, проходивших профилактический осмотр. Было протестировано 49 стеклопрепаратов (контрольная группа), предоставленных сотрудниками лабораторий Перми, приготовленных традиционным способом из капиллярной крови, и 30 стеклопрепаратов, процедура приготовления которых была стандартизована (группа сравнения).
Стандартизация процесса заключалась в использовании только образцов ЭДТА-стабилизированной венозной крови, которые забирали с использованием вакуумных пробирок. Препараты крови готовили на тщательно обезжиренных стеклах, используемых однократно, с помощью автоматического устройства для приготовления мазков крови V-Sampler ("West Medica"). Использовали объем крови 5,0±0,5 мкл, который, как было установлено ранее, является оптимальным для получения качественного препарата крови. Маркировка мазков осуществлялась наклейкой штрих-кода, а не надписью карандашом. Мазки фиксировали краской-фиксатором Мая-Грюнвальда в течение 3 мин с последующим до-
Таблица 1
Количество артефактов, зафиксированных автоматической системой VisionHema при сборе изображений 200 лейкоцитов
Показатель
Группа сравнения (n = 30)
Контрольная группа (n = 49)
Среднее количество артефактов в мазке крови
Минимальное содержание артефактов в мазке крови (абс/% от лейкоцитов)
Максимальное содержание артефактов в одном мазке крови (абс/% от лейкоцитов)
31,0±13,1 15,5±6,6
12
(6)
67 (33,5%)
< 0,001
156,6±57,7 78,3±28,9
67
(33,5)
308 (154%)
< 0,001
Примечание. В числителе - абсолютные значения, в знаменателе - относительные (в %).
Рис. 1. Агрегаты тромбоцитов, формирующиеся при заборе капиллярной крови без консерванта.
Здесь и на рис. 2-4 окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. 10 х 40.
крашиванием забуференным рабочим раствором краски Романовского-Гимзы, приготовленным ех temporae [4].
Морфологический анализ мазков проводили с использованием цифровой системы автоматического анализа мазка крови Vision Hema ("West Medica"). Систему программировали на подсчет лейкоцитарной формулы из 200 лейкоцитов, что соответствует международным стандартам. Vision Hema автоматически собирала изображения 200 лейкоцитов, идентифицировала их и формировала галереи изображений, попутно фиксируя объекты, сходные с лейкоцитами (артефакты). Окончательную правильность идентификации клеток делал опытный врач клинической лабораторной диагностики. Исследования проводили в дублях.
Для оценки эффективности работы системы автоматического анализа мазка крови Vision ^ma определяли время, затраченное системой на автоматический анализ препарата, общее количество и качественный состав артефактов. Кроме этого, учитывали затраты времени на коррекцию результатов сотрудником лаборатории.
Полученные результаты обрабатывали на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Microsoft с применением традиционных методов статистического анализа. Рассчитывали среднее ма-
Таблица 2
Влияние качества приготовления мазка крови на качественный состав артефактов при подсчете 200 лейкоцитов с использованием системы vision Hema
Рис. 2. Грязь, представленная частичками графита. Здесь и на рис. 3, 4 ув. 10 х 100.
Обследованные Количество артефактов Виды артефактов
разрушенные лейкоциты агрегаты тромбоцитов "грязь" другие (эпителий, тромбоциты, пыль)
Группа 31,0±13,1 14,7±2,5 0 6,8±1,7 9,3±1,6
(n = 30) 100 47,2±19,8 0 22,0±12,7 30,Ш2,2
Контрольная группа (n = 49) 156,0±57,7 ----1-0-0---- 35,3±9,12 22,0±16,3 42,5±11,42 20Д±19,8 64,4±14,7 41Д±24,4 14,4±2,7 9,2±4,5
Р < 0,001 < 0,05 < 0,001 < 0,001 < 0,01
Примечание. ные.
В числителе - абсолютные значения, в знаменателе - относитель-
тематическое (X), для оценки рассеяния вариант использовали величину среднеквадратического отклонения (о) и коэффициент вариации (CV), для оценки достоверности различий использовали /-критерий Стьюдента [1].
Результаты и обсуждение. Количество артефактов, зафиксированных системой Vision Hema при подсчете лейкоцитарной формулы, было достоверно меньше в мазках группы сравнения, чем в контрольной группе (табл. 1).Распределение результатов в обеих группах характеризовалось большим разбросом, коэффициенты вариации составили в группе сравнения 42,2% а в контрольной - 36,8%, что свидетельствует о значительном влиянии качества подготовленного мазка на его изображение.
Различия между исследованными группами носили не только количественный, но и качественный характер (табл. 2). В контрольной группе артефакты были пред-
Рис. 3. Преципитаты красителя.
ставлены: агрегатами тромбоцитов (рис. 1); "грязью", чаще всего частичками графита карандаша (рис. 2) или преципитатами красителя (рис. 3), а также разрушенными лейкоцитами (клетками лейкоцитолиза) (рис. 4). Значительно реже встречались клетки плоского орого-вевающего эпителия кожи, пыль, в том числе осколки стекла, а иногда система относила к артефактам крупные тромбоциты и царапины на поверхности стекла. Данные объекты не имеют практически никакой диагностической ценности и поэтому не указываются при описании мазка сотрудниками лабораторий, выполняющими общий анализ крови. Однако их присутствие в препарате фиксируется системой автоматического анализа мазков крови и замедляет ее работу.
Стандартизация процедуры приготовления мазков крови не только в 5 раз уменьшила количество артефактов, но и изменила их состав (см. табл. 2). В мазках группы сравнения отсутствовали агрегаты тромбоцитов и клетки эпителия кожи, уменьшилось количество "грязи" (р < 0,001). Относительное содержание клеток лейкоцитолиза и других артефактов увеличилось в 2,1 и 3,3 раза соответственно за счет исчезновения агрегатов тромбоцитов и уменьшения "грязи" в 9,5 раза. Однако при подсчете абсолютного числа этих элементов установлено их достоверное снижение. Количество разрушенных лейкоцитов уменьшилось в 2,4 раза (р < 0,05).
Отсутствие агрегатов тромбоцитов и клеток эпителия кожи связано с использованием ЭДТА-стабилизированной венозной крови, а значительное уменьшение грязи достигнуто за счет отказа от использования графитных карандашей и одноразового употребления тщательно обезжиренных стекол. Достоверное
Штш
L QL " WymmL \
LI
Рис. 4. Разрушенный лейкоцит (клетка лейкоцитолиза).
уменьшение числа разрушенных лейкоцитов связано с автоматизацией процедуры приготовления мазков крови. Использование V-Sampler обеспечило получение качественных стеклопрепаратов независимо от опыта и квалификации сотрудников лаборатории. Следует отметить, что использование прибора позволяет автоматически контролировать процесс приготовления мазка крови и получать препараты с обширной "рабочей областью", что особенно важно для их дальнейшей автоматизированной окраски и компьютерной обработки изображения. Следует отметить, что как длинные, так и короткие мазки, как правило, благодаря постоянной скорости распределения имеют одинаковый монослой. Данное свойство мазков крови, приготовленных с помощью устройства V-Sampler, является оптимальным при использовании автоматических систем оценки изображения, так как снижает зависимость результатов анализа от выбора стартовой точки.
Уменьшение количества артефактов привело почти к двукратному ускорению работы системы автоматического анализа Vision Hema (табл. 3). Это связано с увеличением скорости сбора галереи изображений лейкоцитов. При малом содержании артефактов система не затрачивает время на их обнаружение, фокусировку изображения и распознавание, все это увеличивает скорость перемещения стеклопрепарата и ускоряет сбор изображений лейкоцитов. Перекрывание областей абсолютных значений времени, затраченных на автоматический анализ препаратов (см. табл. 3), объясняется тем, что абсолютное количество лейкоцитов в крови обследованных здоровых людей отличалось почти в 2 раза, изменяясь от 4,6 • 109 до 9,0 • 109/л.
Таблица 3
Время автоматического подсчета системой Vision Hema лейкоцитарной формулы на 200 клеток в мазках крови, приготовленных различным способом (X ±п)
Обследованные Средняя скорость, мин • с Min-Max, мин:с
Группа сравнения 4:25±1:17 1:32-9:04
(n = 30)
Контрольная 8:34±3:21 3:41-10:19
группа (n = 49)
Р < 0,01
Таблица 4
Время, затраченное врачом на валидацию результатов подсчета лейкоцитарной формулы системой Vision Hema (X ±п)
Обследованные Средняя скорость, мин:с Min-Мах, мин:с
Группа сравнения 1:10±0:35 0:23-2:05
(n = 30)
Контрольная 3:07±1:44 2:03-6:22
группа (n = 49)
Р < 0,01
Стандартизация процесса приготовления мазков крови привела не только к ускорению работы автоматической системы, но и к повышению производительности работы сотрудников лаборатории (табл. 4). Врач, работающий с установкой, после окончания формирования галереи изображений должен визуально проверить правильность распределения клеток по галереям и при необходимости в режиме ручной коррекции внести изменения. Низкое количество артефактов не отвлекает внимание сотрудника, утверждающего полученные результаты, от оценки морфологии лейкоцитов и уменьшает процент ручной коррекции полученных результатов. Это сократило время, затрачиваемое врачом на утверждение полученных результатов, почти в 3 раза (см. табл. 4).
Таким образом, предложенная стандартизация процедуры подготовки мазка крови повышает эффективность работы системы автоматического анализа крови Vision Hema.
Выводы. 1. При выполнении общего анализа крови качество приготовления мазка достоверно влияет на эффективность работы автоматических систем анализа крови.
2. Стандартизация процедуры приготовления мазков крови является важным фактором, повышающим эффективность их автоматического анализа. Она приводит к увеличению скорости работы системы за счет ускорения сбора галереи изображений и ускорения валидации полученных результатов анализа врачом.
3. Использование ЭДТА-стабилизованной венозной крови, штрих-кодированных одноразовых тщательно обезжиренных стекол и автоматизированного приготов-
ления мазков крови уменьшает количество артефактов в 5 раз и позволяет получать мазки крови с отсутствием агрегатов тромбоцитов и низким содержанием разрушенных лейкоцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика; 1999.
2. Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е., Долгов В. В. Лабораторная гематология. М.; Тверь: Триада-Х; 2006.
3. Медовый B. C., Парпара А. А., Пятницкий A. M., Соколинский Б. З., Демьянов В. Л. Обзор методик автоматизированной микроскопии биоматериалов. Клиническая лабораторная диагностика. 2006; 7: 15-20.
4. Меньшиков В. В. Клиническая лабораторная аналитика. Лабинформ-РАМЛД; 1999. 352 с.
5. Bacus J. W. The development of automated differential systems. In: Koepke J. A., ed. Differential leukocyte counting. Aspen: College of American Pathologist; 1977: 95-117.
6. Tatsumi N., Pierre R. V. Automated image processing. Past, present and future of blood cell morphometry identification. Clin. Lab. Med. 2002; 22: 299-315.
7. Angulo J., Flandrin G. Automated detection of working area of peripheral blood smears using mathematical morphology. Anal. Cell. Pathol. 2003; 25: 37-49.
8. Swolin В., Simonson P., Backman S., Lofqvist I., Bredin I., Johnsson M. Differential counting of blood leukocytes using automated microscopy and a decision support system based on artificial neural networks - evaluation of DiffMaster T M Octavia. Clin. Lab. Haematol. 2003; 25: 139-47.
Поступила 10.10.12
КОАГУЛОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.111/.112.117.083
Б. И. Кузник1, И. А. Файн2, A. B. Каминский2, О. Г. максимова1, E. M. Кустовская1, Ю. В. Богданова1, Н. Г. Жданович1, О. С. Роднина1, Н. В. хасанова1
неинвазивный метод изучения агрегационной активности тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов
1ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия; 2ELFI-TECH LTD, Rehovot, Israel
Предложен неинвазивный метод исследования агрегационной активности тромбоцитов и образования лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов, а также некоторых показателей системы гемостаза, основанный на спекл-анализе характера рассеяния когерентного света с поверхности движущихся в искусственно изолированном отрезке сосуда эритроцитов. Получены высокие корреляционные отношения между индексом рассеяния света и спонтанной, АДФ-, адреналин- и коллагениндуцированной агрегацией тромбоцитов, образованием лейкоцитарно-эритроцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов. Установленные факты позволяют считать, что с помощью неинвазивного метода исследования можно ориентировочно судить об агрегационной активности форменных элементов крови.
Ключевые слова: неинвазивный метод исследования гемостаза, агрегация тромбоцитов, лейкоцитарно-эритроцитарные и тромбоцитарно-эритроцитарные агрегаты
