CC BY
85
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _____________________________________2011, том 54, №11_________________________________
БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.132.633.11
Член-корреспондент АН Республики Таджикистан А.Абдуллаев, Г.Ф.Касымова , И.А.Сабоиев
ВЛИЯНИЕ ПОЧВЕННОЙ ЗАСУХИ НА КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ ПШЕНИЦЫ
Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан, Институт химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджикистан
С целью выявления изменения белкового состава пшеницы двух перспективных сортов Зафар и Алекс, выращенных в условиях почвенной засухи и в обычных условиях, проведено электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле запасных белков зерна (альбуминов, глобулинов, глиади-нов). Установлено, что сорта Зафар и Алекс имеют свои специфические белковые спектры, что может быть использовано при идентификации и систематике сортов. В составе глиадиновой фракции сорта Зафар, выращенного в условиях почвенной засухи, присутствует компонент с Rf 0.36, отсутствующий в контроле, что, вероятно, является результатом адаптации сорта к экстремальным условиям произрастания.
Ключевые слова: пшеница - сорта Зафар и Алекс - засухоустойчивость - электрофорез белков -полиакриламидный гель - альбумины - глобулины - глиадины.
В последние годы внимание многих исследователей направлено на изучение влияния глобальных климатических изменений на растения. Это связано с тем, что влияние климатических и антропогенных факторов может негативно отразиться на жизнедеятельности живых организмов [1].
Повышение температуры воздуха на протяжении длительного времени может усилить испарение воды с поверхности почвы, и интенсивная транспирация приведёт к иссушению корнеобитаемого слоя почвы и повышению содержания солей в нём. Нагретый воздух, иссушенный и засолённый слой почвы могут существенно повлиять на рост, развитие и продуктивность сельскохозяйственных культур.
Потепление с сопровождением почвенной и атмосферной засухи может сильно воздействовать на продукционные процессы сельскохозяйственных растений [2]. Известно, что температурный и водный стресс приводят к нарушению метаболических процессов у растений, распаду белков, изменению коллоидно-химического состояния цитоплазмы и, в конечном итоге, к снижению количества накапливаемого растениями органического вещества [3]. Такие полигенные признаки, как продуктивность, устойчивость к стрессам, качество урожая и другие, могут сильно варьировать под влиянием условий среды. В связи с этим для получення более объективной информации о свойствах генотипов крайне важно проведение исследований полиморфизма белков. Для этих целей в последние годы широко используются методы определения состава запасных белков семян [4]. Наиболее информа-
Адрес для корреспонденции: Сабоиев Изатшо Айналишоевич. 734017, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул.Карамова, 27, Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан. E-mail: izatsho@mail.ru
тивным методом является метод разделения и идентификации белков в полиакриламидном геле (ПААГ), который позволяет выявлять изменения белкового состава генотипов.
Исходя из этого, нами проведена работа по электрофоретическому разделению в ПААГ запасных белков (альбуминов, глобулинов, глиадинов) пшеницы двух перспективных сортов - Зафар и Алекс, выращенных в условиях почвенной засухи и в обычных условиях, с целью выявления изменений белкового состава.
Методика
Белки выделяли из тонкоизмельчённой муки семян по методу Осборна [5] последовательной экстракцией вначале легкорастворимых фракций - альбуминов и глобулинов, а затем труднорастворимой - глиадинов. Для этого 0.5 г муки заливали 5 мл 1М КаС1 в 0.1М фосфатном буфере и на магнитной мешалке при 4оС экстрагировали легкорастворимые фракции в течение 1 ч. Процедуру повторяли дважды, экстракты объединяли, центрифугировали при 6000 об./мин 20 мин и ставили на диализ против дистиллированной воды. Фракцию альбуминов отделяли от глобулинов центрифугированием и осаждали ацетоном. Осадок после отделения легкорастворимых фракций промывали дважды холодной дистиллированной водой, заливали 5мл 70% этанола и экстрагировали спирторастворимые белки - глиадины на магнитной мешалке при комнатной температуре. Экстракцию повторяли дважды, экстракты объединяли и ставили на диализ против воды. Глиадины отделяли центрифугированием и высушивали при комнатной температуре. Выделенные фракции использовали для проведения электрофореза.
Для определения компонентного состава белков использовали два принципиально раз-
личных способа электрофоретического разделения: электрофорез в присутствии мочевины при рН 3.1 для разделения глиадинов и электрофорез в присутствии ДДС-Ка и в-меркаптоэтанола при рН 8.3 для разделения альбуминов и глобулинов. В первом случае белки сохраняют свою индивидуальность и их состав полнее отражает биологическую специфичность. Во втором случае разрушается третичная структура и проявляются свойства полипептидов, что позволяет фракционировать белки в зависимости от их молекулярной массы.
Электрофорез легкорастворимых фракций проводили в присутствии ДДС- Ка в пластинах градиентного ПААГ по методу Томаса и Корнберга [6] с градиентом концентрации акриламида 414%. Белки растворяли в 0.125 М Трис-буфере (рН 6.8), содержащем 0.06% ДДС- Ка, 20% сахарозу, 10% в -меркаптоэтанол и нагревали на водяной бане 30 с. Электрофорез проводили при 60-120 В. После завершения электрофореза гели фиксировали в 20% трихлоруксусной кислоте и окрашивали 0.1% раствором Кумасси в 50% этаноле с 5% уксусной кислотой. Для определения молекулярных масс (кД) одновременно проводили электрофорез белков-стандартов: бычьего альбумина (66.000), карбоксиангидразы (29.000), апротинина (6.000). Интенсивность окрашивания компонентов определяли в пределах чувствительности выбранного метода окрашивания.
Электрофорез глиадинов проводили в 6.5% ПААГ при напряжении 580 В в течение 6 ч. Электродным буфером служила 0.013 Н уксусная кислота (рН 3.1). Для предотвращения агрегации белков перед разделением в ПААГ белки растворяли в буфере, содержащем 2М мочевину с 6% акрилами-
дом. Гели после завершения электрофореза окрашивали в смеси 0.25% водного раствора Кумасси и 12% трихлоруксусной кислоты в соотношении 1:20.
Результаты исследований
Результаты исследований показали, что высоковольтный электрофорез в 6.5% ПААГ (рН 3.1), содержащем 5% уксусную кислоту и 6 М мочевину, обладает высокой разрешающей способностью и позволяет выявить большое число компонентов. При этом ускоряется процесс фракционирования белков и снижается диффузия низкомолекулярных веществ. В кислой системе, возможно, происходит перестройка системы водородных связей и гидрофобных взаимодействий между боковыми группами молекул белка, порождающих конкуренцию электроотрицательных центров за протоны, что создаёт основу для конформационных изменений, положительно влияющих на разрешающую способность.
На рис.1 представлена электрофореграмма глиадинов, выделенных из обезжиренной муки пшеницы. Белковые спектры содержат от 13 до 16 компонентов, отличающихся по интенсивности окраски и электрофоретической подвижности в ПААГ. Среди них присутствуют компоненты с наибольшей и средней интенсивностью окраски. Для регистрации компонентов определяли их относительную электрофоретическую подвижность ( КГ ) в ПААГ, которую вычисляли по формуле:
расстояние от старта до зоны белка
.К!----------------------------------------------------.
расстояние от старта до быстромигрирующего белка
Из данных, представленных на рис.1 и табл.1, следует, что в составе глиадинов зерна обоих сортов имеются сортоспецифичные компоненты с КГ 0.33 и 0.53 у сорта Зафар и компоненты с КГ
0.51 и 1.0 у сорта Алекс, которые могут служить маркерами данных сортов. Наблюдаются также отличия по интенсивности окраски компонентов.
Сравнительный анализ показал, что в компонентном составе глиадинов пшеницы сорта За-фар, выращенной в условиях почвенной засухи, присутствовал компонент с КГ 0.36, который отсутствовал у этого же сорта, выращенного в обычных условиях. Можно предположить, что с данным компонентом связана адаптация сорта к экстремальным условиям произрастания. Этот вопрос требует проведения специальной экспериментальной проверки.
1 2 3 4
Рис. 1. Электрофореграмма глиадинов пшеницы сортов Зафар и Алекс в 65% полиакриламидном геле (1 и 3 -вариант опыта с почвенной засухой, 2 и 4 - вариант опыта с оптимальной влажностью почвы).
У пшеницы сорта Алекс, выращенной условиях засухи и в контроле, отличия наблюдались только по интенсивности окраски компонентов с 0.66; 0.71 и 0.91.
На рис.2 представлена электрофореграмма легкорастворимых фракций - альбуминов и глобулинов пшеницы сортов Зафар и Алекс, выращенных в условиях почвенной засухи и в обычных условиях, а в табл. 2 и 3 - компонентный состав, электрофоретическая подвижность (Я!1) и молекулярная масса (кД) белков, рассчитанная по калибровочному графику. Альбумины представлены 15-ю компонентами, из них четыре интенсивной окраски, шесть средней интенсивности окраски, остальные -минорные фракции. Глобулины представлены 12-ю компонентами, девять из которых имеют очень интенсивную окраску, остальные окраску средней интенсивности. Полученные данные свидетельствуют о том, что состав белков обоих сортов пшеницы, выращенной в двух различных условиях, отличается только по интенсивности окраски компонентов. Однако следует отметить, что спектры альбуминов и глобулинов имеют свои специфические особенности, заключающиеся в присутствии или отсутствии компонентов и по электрофоретической подвижности. Так, в альбуминовых фракциях присутствуют белки с молекулярной массой 99, 80, 42, 40, 25 и 16 кД, которые отсутствуют в глобулинах. В глобулинах присутствуют компоненты 32, 17.5 и 10 кД, которые отсутствуют в альбуминах. Эти компоненты являются сортоспецифическими и могут быть использованы при идентификации и систематике данных сортов.
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Рис.2. Электрофореграмма альбуминов зерна пшеницы сортов Зафар и Алекс и глобулинов сортов Зафар и Алекс в 4-14%-полиакриламидном геле. 2, 4, 7 и 9 - вариант опыта с почвенной засухой; 3, 5, 8 и 10 - вариант опыта с оптимальной влажностью почвы. 1,6,11 - белки-маркеры: бычий альбумин - м.м.66000, карбоксиан-
гидраза - м.м 29000, апротинин - м.м. 6000.
На основании данных электрофоретического анализа можно заключить, что сорта Зафар и Алекс имеют свои специфические белковые спектры. В составе глиадинов у пшеницы сорта Зафар, выращенной в условиях почвенной засухи, выявлен компонент с 0.36, отсутствующий в контроле, что, вероятно, является результатом адаптации сорта к экстремальным условиям произрастания.
Таблица 1
Компонентный состав глиадинов пшеницы сортов Зафар и Алекс
№ Rf Зафар Алекс
оптимальная влажность оптимальная влажность
почвы почвенная засуха почвы почвенная засуха
1 0.21 ++ ++ ++ ++
2 0.25 ++ ++ ++ ++
3 0.28 ++ ++ ++ ++
4 0.33 ++ ++
5 0.36 +++
6 0.51 ++ ++
7 0.53 ++++ ++++
8 0.56 +++ +++ ++++ ++++
9 0.61 ++ ++ ++ ++
10 0.66 ++ ++ +++ ++++
11 0.71 +++ +++ +++ ++++
12 0.80 +++ +++ +++ +++
13 0.88 +++ +++ +++ +++
14 0.91 ++++ ++++ +++ ++++
15 0.96 +++ +++ +++ +++
16 1.0 ++ ++
(-) - отсутствует компонент, (++) - слабая интенсивность окраски компонента, (+++) - средняя интенсивность
окраски компонента, (++++) - большая интенсивность окраски.
Таблица 2
Компонентный состав альбуминов и глобулинов пшеницы сортов Зафар и Алекс
Альбумин Глобулин
№ Rf Lg М м кД № Rf Lg М м М м
1 0.18 5.0 99000 1 0.22 4.85 71000
2 0.20 4.9 80000 2 0.27 4.8 66000
3 0.22 4.85 71000 3 0.31 4.78 61000
4 0.27 4.8 66000 4 0.36 4.65 45000
5 0.31 4.78 61000 5 0.45 4.5 32000
6 0.36 4.65 45000 6 0.5 4.46 29000
7 0.38 4.62 42000 7 0.59 4.28 20000
8 0.40 4.6 40000 8 0.65 4.25 18000
9 0.50 4.46 29000 9 0.72 4.18 17500
10 0.52 4.4 25000 10 0.81 4.0 10000
11 0.59 4.28 20000 11 0.86 3.9 8000
12 0.62 4.25 18000 12 1.0 3.77 6000
13 0.68 4.2 16000
14 0.86 3.9 8000
15 1.0 3.77 6000
Работа выполнена при поддержке Международного научно-технического центра
(Проект Т-1635).
Поступило 23.09.2011 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Alam Zeb., Zahir Ali. et al. - Pakistan Journal of Biological Science, 2006, № 9, pp.1823-1827.
2. Abdullaev S.F. - International Workshop of the experts on ecology, 02-04, April, 2008, Moscow, the ISTC and the State Duma of Russia.
3. Эргашев А. Влияние высоких экстремальных температур на физиолого-биохимические процессы и продуктивность хлопчатника. Обзорная информация. - НПИЦентр: Душанбе, 1997,44 с.
4. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. - М.: Наука, 1985, 272 с.
5. Sidorova V.V.,Timofeeva G.I., Konarev V.G. - Protein Markers. - L., 1987, рp. 61-75.
6. Thomas J.O., Kornberg R.D. - Proc. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72 , № 7, pp. 2626-2630.
А.Абдуллоев, Г.Ф.^осимова*, И.А.Сабоиев ТАЪСИРИ ХУШКИИ ХОК БА ЦИСМИ ТАРКИБИИ САФЕДА^ОИ ЗАХИРАКУНАНДАИ ГАНДУМ
Институти ботаника, физиология ва генетикаи растании Академияи илм^ои Xум%урии Тоцикистон,
* Институти химияи ба номи В.И.Никитини Академияи илмх;ои Xум%урии Тоцикистон
Бо максади ошкор намудани тагйирёбии таркиби сафедавии ду навъи ояндадори Зафар ва Алекс, ки дар шароити хушкии хок ва дар шароити мукаррарй парвариш карда шудаанд, таксимкунии электрофоретикии сафедах,ои захиравии дон (албуминх,о, глобулинх,о ва глиадинх,о) дар гели полиакриламидй (ГПАА) гузаронида шуд. Мукаррар карда шудааст, ки навъи Зафар ва Алекс дорои спектри ба худ хос мебошад ва онро хднгоми идентификатсия ва систематикаи навъх,о истифода бурдан мумкин аст. Дар таркиби фраксияи глиадинии навъи Зафар, ки дар шароити хушкии хок парвариш карда шудааст, компоненти Rf 0.36, иштирок ме-намояд ва он дар варианти назоратй ба назар намерасад, шояд хдмаи ин натичаи мутобикшавии навъх,о ба шароити номусоид парвариш бошад.
Калима^ои калиди: гандум - навъи Зафар ва Алекс - устуворноки ба хушки - электрофорези сафедауо - гели полиакриламиды - албумищо - глобулинуо - глиадинуо.
A.Abdullaev, G.F.Kasimova*, I.A.Saboiev INFLUENCE OF SOIL DROUGHT ON THE COMPONENT COMPOSITION OF STORAGE PROTEINS OF WHEAT
Institute of Botany, Physiology and Genetics of Plant, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan, *V.I.Nikitin Institute of Chemistry, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan
In order to identify changes in protein composition of wheat of two perspective varieties of Zafar and Alex, grown up in the conditions of a soil drought and in usual conditions, it is spent electrophoretic division in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) of grain storage proteins (albumin, globulin, gliadin). Established, that the sorts Zafar and Alex have their own specific protein spectra, that can be used for identification and systematization of sorts. In the composition of gliadin fractions sort Zafar grown in conditions of a soil drought, there is a component with Rf 0.36, absent in control, that is probably the result of sorts adaptation to extreme conditions of growth.
Key words: wheat - variety Zafar and Alex - drought - protein electrophoresis - polyacrylamide gel - albumins - globulins - gliadins.
