CC BY
31
ШОШЙКВоаОтаГО !
7. Шкодич П.Е., Желтобрюхов В.Ф., Клаучек В. В. Эколого-гигиенические аспекты проблемы уничтожения химического оружия. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2004. - 236 с.
8. Федеральная целевая программа Российской Федерации "Уничтожение запасов химического ору-
(19) 2006
жия в Российской Федерации", утверждена Постановлением Правительства Российской Федерации от 21 марта 1996 г., № 305 (в редакции Постановления Правительства Российской Федерации от 5 июля 2001 г., № 510).
УДК 616.982.27-039:576.858.9:579.25
ВЛИЯНИЕ ПЛАЗМИД НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК САПНОГО МИКРОБА К МЕЛИОИДОЗНОМУ БАКТЕРИОФАГУ
В.А. Антонов, Л.К. Меринова, Д.В. Викторов, Н.П. Агеева, B.C. Замараев, В.И. Илюхин
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
Передача плазмид RP4 и RP1::Tn10 Rep ts в штамм Burkholderia mallei Ц4 приводила к появлению лекарственной резистентности, детерминируемой плазмидными генами, изменению состава общеклеточных белков и антигенного спектра трансконъюгантов, а также чувствительности микроорганизма к мелиоидозным бактериофагам и снижению вирулентности.
Ключевые слова: плазмидные гены, мелиоидоз, бактериофаг, вирулентность, лекарственная резистентность, сап.
INFLUENCE OF PLASMIDS ON GLANDERS MICROBE CELLS VIRULENCE AND SENSITIVITY TO MELIOIDOSIS BACTERIOPHAGE
V.A. Antonov, L.K. Merinova, D.V. Victorov, N.P. Ageeva, V.S. Zamaraev, V.I. Ilyukhin
Abstract. The transfer of RP4 and RP1:: Tn10 Rep ts plasmids to Burkholderia mallei Ц4 invoked occurrence of drug resistance determined by plasmid genes, to changes in composition of whole proteins and antigenic spectrum in transconjugants and also change of microbe sensitivity to melioidosis bacteriophages and decrease of virulence.
Keywords: plasmid genes, melioidosis, bacteriophage, virulence, drug resistence, glanders.
Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomaliei) и сапа (Burkholderia mallei) известны как опасные для человека и некоторых видов животных патогенные микроорганизмы, обладающие высокой степенью филогенетического родства [2]. Вместе с тем они отличаются по ряду фенотипических признаков, связанных с вирулентностью, резистентностью к антибиотикам, биохимической активностью, продукцией внеклеточных ферментов и т. д. [4].
К отличительным биологическим свойствам возбудителя мелиоидоза следует отнести также лизогению. Практически все штаммы этого микроорганизма способны продуцировать бактериофаги, эффективно размножающиеся в клетках родственного вида В. mallei, который используют как индикатор фаголродукции мелиоидоз-ных культур [7].
Оба микроорганизма воспринимают в конь-югации R-плазмиды Inc Р-1 группы, приобретая детерминируемую их генами резистентность к антибиотикам [1]. Известно, что влияние R-плазмид различных групп несовместимости не исчерпывается только появлением у их хозяев признаков антибиотикорезистентности, при этом могут изменяться и другие свойства микроорганизмов, в частности способность поддерживать развитие бактериофагов.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияния плазмид Р-1 группы несовместимости RP4 и RP1::Tn10 Rep ts на чувствительность В. mallei к мелиоидозным бактериофагам, вирулентность и продукцию некоторых поверхностных биополимеров.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень использованных штаммов и плазмид приведен в табл. 1. Для культивирования микроорганизмов использовали L-бульон, L-arap, а также среды BHI на основе сердечно-мозгового перевара ("Difco", США).
Мелиоидозные бактериофаги выделяли из лизогенных музейных штаммов В pseudomaliei в виде хлороформных лизатов [7]. Содержание фага в хлороформном лизате определяли методом агаровых слоев [Там же]. Для определения частоты спонтанной фагопродукции использовали суточные бульонные культуры В. pseudomaliei. Число негативных колоний (стерильных пятен) подсчитывали на газоне индикаторного штамма В. mallei Ц4 Rif" через 24 ч. Коньюгационные скрещивания проводили на плотных питательных средах на поверхности фильтров "Владипор 4" в условиях, установленных ранее для переноса в В. mallei и В. pseudomaliei плазмиды RP4 [1].
iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiHiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiiiiiiiiii ааошгаи Qofflffanw iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiini
Таблица 1
Характеристика штаммов и плазмид, использованных в работе
Штаммы Характеристика Источник получения
В. pseudomallei 139 \М (дикий тип) Коллекция Волгог-радНИПЧИ
Е. coli С600 (RP1 ::Тп10) Тск КткАрк Рер1э
Е. coli С600 (RP4) —
В. mallei Ц4 \М (Дикий тип)
В. mallei 10230 \М (дикий тип)
В. mallei Z 12 \М (дикий тип)
В. mallei Ц4 (RP1 ::Тп10) Тск КткАрк Яер Получены в данной работе
В. mallei Ц4 (RP4) Тск Ктк Арк
В. mallei Ц4 Авторская коллекция Н.П. Агеевой
6. mallei 10230-163 chr::Tn5 Ктк Аде8"
В. mallei 10230-181 chr::Tn5 Ктк Аде8"
Примечание. Аде8~-дефект по антигену 8.
Для обнаружения плазмидных ДНК применяли ускоренные методы выделения [10]. Электрофорез в агарозном геле проводили с использованием трис-боратного буфера [12].
Продукцию общеклеточных бактериальных белков анализировали методами электрофореза в 10-11 %-м полиакриамидном геле с SDS (SDS-PAGE) [13] и вестерн-блоттинга [14]. Конъюгаты специфических иммуноглобулинов с щелочной фосфатазой ("Sigma") получали одноэтапно с использованием глутарового альдегида [11].
Вирулентность исследуемых культур В. mallei определяли на золотистых хомячках. Животных заражали подкожно суспензиями суточных агаровых культур. LD50 рассчитывали по методу Кербера [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для установления размножения мелиоидоз-ного бактериофага в качестве индикаторного был выбран штамм В. mallei Ц4 Rif , несущий мутацию устойчивости к рифампицину. Плазмиды RP4 и RP1 ::Тп10 Rep ts от доноров Е. coli С600 (RP4) и Е. coli С600 (RP1::Tn10) Rep ts передавали в реципиентный штамм В. mallei Ц4 Rif R возбудителя сапа, используя для контрселекции доноров рифампицин в концентрации 500 мкг/мл.
При анализе свойств трансконьюгантов возбудителя сапа, содержащих в составе своего генома плазмиды RP4 и RP1::Tn10 Rep ts, было выявлено, что они отличались от исходного штамма по ряду фенотипических признаков.
Помимо приобретения устойчивости к антибиотикам (тетрациклину, канамицину, ампициллину), детерминируемой плазмидными генами, у трансконьюгантов при культивировании при 40 °С наблюдали изменения в динамике размножения клеток и сокращении сроков выживания популяции. Кроме того, наличие плазмид в клетках В. mallei Ц4 отражалось на вирулентности культур, по-существу, приводя к ее полной утрате (ЛД50 трансконьюгантов превышала 1-108 м.к. в сравнении с 1-Ю2 м.к. родительского штамма). Одновременно трансконьюганты оказались резистентными к мелиоидозному фагу, выделенному из лизоген-ного штамма В. pseudomallei 139 (табл. 2).
Существует множество причин, по которым клетка может стать устойчивой к инфекции фагом. Одна из них заключается в гидролизе фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции, кодируемыми плазмидами. Ограничение развития фага в клетках, содержащих плазмиды, может быть обусловлено и нарушением адсорбции фага. Повышенная частота лизогенизации приводит к снижению количества фаговых частиц, способных осуществлять литический цикл. Кроме того, на различные этапы развития фага могут оказывать влияние плазмидспецифические белки [6, 8].
Штаммы Характеристика Частота спонтанной фагопродукции ЛД50 Чувствительность клеток к фагу В.pseudomallei 139
В. pseudomallei 139 Wt (дикий тип) n-10"5 <1Ю2 -
В. mallei Ц4 Wt (дикий тип) 0 <1-1 о2 +
В. mallei Ц4 RifR 0 <1-102 +
Б. mallei Z 12 Wt (дикий тип) 0 <1-102 +
8. mallei Ц4 (RP1::Tn10) RifR TcR KmR ApR Rep ts 0 >1-108 -
В. mallei Ц4 (RP4) RifR TcRKmRApR 0 >1Ю8 -
В. mallei 10230-163 chr::Tn5 KmR Age8" 0 >1-108 н
Б. mallei 10230-181 chr::Tn5 KmR Age8" 0 >1 ю8 н
Примечание."+" - клетки чувствительны к фагу; "-" - клетки резистентны к литическому действию фага; н - не определяли.
64
Таблица 2
Влияние R-плазмид Р-1 группы несовместимости на фенотипические свойства
трансконьюгантов В. mallei
вазшсак сзошсгш?
1(19) 2006
У полученных плазм идсодержащих транс-коньюгантов, также как и у исходных штаммов возбудителя сапа, не выявлялась спонтанная фа-гопродукция на индикаторном штамме В. mallei Ц4 Rif R и можно предположить, что устойчивость клеток сапного микроба к мелиоидозному фагу была обусловлена не лизогенизацией клеток. Вероятно, причиной резистентности могло стать изменение поверхностных клеточных структур, выполняющих для данного фага рецеп-торную функцию.
Для подтверждения этого положения мы провели сравнение титров фага в надосадоч-ной жидкости исходного индикаторного штамма В. mallei Ц4 Rif R и полученных трансконьюган-тов. С этой целью после смешивания фаголизата и индикаторной бульонной культуры (1-Ю8 м.к./мл) смесь выдерживали 20 мин для адсорбции фага, после чего микробные клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант стерилизовали фильтрованием. В су-пернатанте методом агаровых слоев определяли титр свободного неадсорбировавшегося фага.
Как оказалось, снижение титра фага было выявлено только при исследовании надосадоч-ной жидкости исходного индикаторного штамма В. mallei. В супернатанте, полученном из смеси фага и клеток трансконьюгантов возбудителя сапа, снижение титра фага не отмечали, что подтверждало нарушение адсорбции мелиоидозного фага на поверхности клеток В. mallei.
Известно, что наличие плазмид антибиоти-корезистентности в клетках различных микроорганизмов повышает гидрофобность клеточной стенки, изменяет чувствительность к хелати-рующим соединениям, а также приводит к изменению поверхностных структур и состава липо-сахаридов [9].
При анализе белковых и антигенных спектров исследуемых штаммов были обнаружены различия между плазмидсодержащими и исходными вариантами В. mallei в высокомолекулярной области белкового спектра (рис. 1). Антигенный спектр сапных штаммов, несущих плазмиды, также претерпевал определенные изменения, которые заключались в увеличении уровня продукции полисахаридсодержащих антигенов с молекулярными массами 60-120 «Да (рис. 2).
В работе D. Woods et al. [15] показано, что штаммы В. mallei, дефектные по синтезу капсу-лярных полисахаридов, были чувствительны к бактериофагу фЕ125, выделенному из В. thailanden-sis, и следовательно, данные структурные компоненты клеточной стенки не являлись рецепторами для этого фага. В то же время штаммы сапного микроба, у которых отсутствовал ЛПС О-антиген, или он синтезировался в измененной форме, становились не чувствительными к бактериофагу, что позволило авторам считать ЛПС О-антиген рецептором для фага фЕ125 [15].
1 2 з
4
W
5 6
Вариабельный I участок протеинограмм
78 кДа -45 кДа -
27,5 кДа -
Рис. 1. Электрофореграмма общеклеточных белков штаммов В. mallei: 1 - Маркеры молекулярных весов; 2-Е. coli С600; 3-й. mallei Ц-4; 4 - В. mallei Ц-4 RifR; 5 - В. mallei Ц-4 Rif r(RP4); 6-В. mallei Ц-4 Rif R(RP1::Tn10) Rep ts
120 кДа-
Вариабельный V регион 60-120 кДа
39 кДа -27 кДа -
14 кДа-
Рис. 2. Иммуноблоттинг клеточных белков штаммов
возбудителя сапа: 1 - В. mallei Ц-4 Rif R; 2 - В. mallei Ц-4 Rif R (RP4); 3 - В. mallei Ц-4 Rif R (RP1::Tn10)Rep ts
Можно предположить, что появление резистентности к мелиоидозному бактериофагу у полученных нами трансконьюгантов В. mallei обусловлено изменением рецепторного аппарата клеток сапного микроба.
Изменение вирулентности, отмеченное нами у возбудителя сапа в связи с приобретением плазмид Р-1 группы, вероятнее всего, также определяется структурными изменениями поверхностных биополимеров микроорганизма. Собственно влияние на вирулентные свойства В. mallei коньюгативных репликонов показано в работе В В. Веревкина с соавт. [5], установивших, что вирулентность трансконъюгантов зависела от полноценности Тга-оперона плазмид: плазмиды с де-
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ШаЗШИЕЭошО1^ lllll!l!!!lllllll!lllllll!l!ll!l!llllllllll!!lilllllllllllllll!!lll!lll
фектом в Тга-генах не оказывали влияния на вирулентность культур.
При анализе полученных ранее авирулентных прототрофных вариантов В. mallei 10230 chr::Tn5 (10230-163 и 10230-181) со вставкой в хромосому транспозона Тп5, у которых в реакции преципитации не выявлялся антиген 8, и наблюдалось изменение спектра общеклеточных белков, было также выявлено появление резистентности к бактериофагам В. pseudo-mallei. В частности, они утрачивали чувствительность к двум из 12 фагов, способных размножаться на исходном штамме В. mallei 10230.
Изучение спектра общеклеточных белков мутанта В. mallei 10230-163 обнаружило у него существенные отличия от исходного дикого штамма, заключавшиеся в отсутствии двух высокомолекулярных фракций (150 и 130 кДа) и протеинов с молекулярными массами 35, 39 и 40 кДа, имевшихся у штамма дикого типа (рис. 3).
уптшшшш шн i t
м i i i i
150 130 60 35 22 12 кДа
Рис. 3. Электрофорез общеклеточных белков в 10 %-м полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия: а-В. mallei 10230; б - В. mallei 10230-163
По данным дифференциального окрашивания протеинограмм и иммуноблоттинга с моноспецифической сывороткой к антигену 8, эти высокомолекулярные фракции представляли собой гл и ко протеиды, несущие антигенные детерминанты. Протеинограммы сравниваемых штаммов характеризовались значительной вариабельностью, что свидетельствовало о различном уровне экспрессии отдельных протеинов, в целом пониженном для В. mallei 10230-163 по сравнению с диким типом.
Изменение чувствительности обоих авирулентных штаммов В. mallei к мелиоидозным бактериофагам также свидетельствовало о модификации поверхностных структур клеточной стенки, являющихся рецепторами для фагов В. pseu-domallei.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, R-плазмиды Р-1 группы несовместимости RP4 и RP1 ::Тп10 Rep ts опосредуют при передаче в штамм В. mallei Ц4 Rif R, помимо появления лекарственной резистентности, детерминируемой плазмидными генами, также изменение чувствительности микроорганизма к мелиоидозным бактериофагам и снижение вирулентности. Трансконъюганты В. mallei ЦА, несущие указанные плазмиды, отличались от исходного штамма дикого типа продукцией протеинов, выявляемых в высокомолекулярной области белкового спектра, что указывает на наличие в этой области поверхностных биополимеров как фаговых рецепторов, так и детерминантов вирулентности возбудителя сапа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агеева Н.П., Меринова Л.К. // Микробиол. журн. - 1986. - № 5. - С. 3-6.
2. Антонов В.А., Илюхин В.И. // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 2005. - № 2. - С. 3-9.
3. Ашмарин А.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - П., 1962.
4. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. - М.: Медицина, 1990. -224 с.
5. Веревкин В.В., Воложанцев Н.В., Мякинина В.П. и др. // Вест. рос. мед. наук. - 1997. - № 6. - С. 37-40.
6. Горелышев A.C., Кульба A.M., Цыганков Ю.Д. и др. // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 1985. - № 9. -С. 3-6.
7. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. I/ Микробиол. журн. - 1993. - № 4. - С. 43—47.
8. Дидык O.A. // Микробиол. журн. - 1991. - Т. 53, №8.-С. 97-103.
9. Домарадский И.В. II Мол. генет. микробиол. вирусол . - 1985. - № 12. - С. 3-11.
10. Замараев B.C., Антонов В.А., Илюхин В.И. и др. // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 1998. - № 4. -С. 28-33.
11. Кэтти Д. Антитела 2. Методы. - М.: Мир. -1991.-250 с.
12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984.-479 с.
13. Laemmli U. II Nature. - 1970. - Vol. 227. -P. 680-685.
14. Towbin H„ Staehelin Т., Gordon E. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1979. - № 76. - P. 4350-4354.
15. Woods D.E., Jeddeloh J.A., Fritz D.L., et al. II J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, № 14. - P. 4003-4017.
