CC BY
8
УДК 618.14-006.3.04: 616-092 © 2018 Галембикова А.Р. и соавторы
Влияние пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений на механизмы репарации повреждений ДНК клеток саркомы Юинга
Айгуль Рафиковна Галембикова1, Сергей Васильевич Бойчук1*, Павел Дмитриевич Дунаев1, Рамиль Рамисович Хуснутдинов1, Светлана Сергеевна Зыкова2
1 Казанский государственный медицинский университет, г. Казань, Россия; 2Пермский институт ФСИН России, г. Пермь, Россия
Реферат doi: 10.17816/KMJ2018-245
Цель. Изучить механизмы репарации повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и регуляции клеточного цикла клеток саркомы Юинга под влиянием пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений.
Методы. Исследования были выполнены на клеточной линии саркомы Юинга А673. Опухолевые клетки инкубировали в присутствии пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (соединение №20 и соединение №24) в течение 48 ч. Методом иммуноблоттинга были исследованы уровни экспрессии маркёров репарации однонитевых (фосфорилированные формы ATR и Chk1) и двунитевых (фосфорилирован-ные формы H2AX, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, Chk-2) разрывов ДНК. Анализ фаз клеточного цикла проводили методом проточной цитометрии (BD FacsCanto, США).
Результаты. Под влиянием пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений в клетках саркомы Юинга повышался уровень экспрессии гистона 2А, фосфорилированного по остаткам серина в положении 139 (y-H2AX), что свидетельствовало о наличии повреждений ДНК (двунитевых разрывов). Под влиянием пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений в исследуемых клетках повышалась экспрессия фосфорилированных форм ATM-киназы и BRCA-1. Были также отмечены нарушения клеточного цикла, приводящие к накоплению клеток в фазах G2/M, и усиление гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза.
Вывод. Пивалоил-замещённые пиррол-содержащие гетероциклические соединения индуцировали двунитевые повреждения ДНК в опухолевых клетках саркомы Юинга линии А673; в ответ на повреждение ДНК в опухолевых клетках активировались механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК; несмотря на запуск системы репарации ДНК клетки А673 накапливались в G2/M-фазе клеточного цикла и погибали по механизму апоптоза. Ключевые слова: саркома Юинга, повреждение и репарация ДНК, клеточный цикл, пивалоил-замещённые пир-рол-содержащие гетероциклические соединения.
Effect of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds on DNA repair pathways in Ewing's sarcoma
A.R. Galembikova1, S.V. Boychuk1, P.D. Dunaev1, R.R. Khusnutdinov1, S.S. Zykova2 'Kazan State Medical University, Kazan, Russia; 2Perm Penal Service Institute, Perm, Russia
Aim. To examine deoxyribonucleic acid (DNA) damage repair and cell cycle regulatory mechanisms of Ewing sarcoma cells exposed to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds.
Methods. The study was performed on A673 Ewing sarcoma cell line. The tumor cells were incubated for 48 h in the presence of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds (compounds №20 and №24). Western blot analysis was utilized to examine expression of the markers of DNA single-strand (phosphorylated forms of ATR and Chk1) and double-strand breaks (phosphorylated forms of H2AX, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, Chk-2). Analysis of the cell cycle phases was performed by flow cytometry (BD FacsCanto, USA).
Results. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds substantially increased the expression of histone 2A phosphorylated on serine 138 (y-H2AX) that indicates DNA damage (double-strand breaks). Under exposure to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds the studied cells increased expression of phosphorylated forms of ATM-kinase and BRCA-1. Also cell cycle disorders leading to substantial G2/M arrest and enhanced apoptosis of tumor cells were observed.
Conclusion. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds induced DNA double-strand breaks in A673 Ewing sarcoma cell line; in response to DNA damage in tumor cells, the mechanisms of DNA double-strand breaks repair were activated; despite activation of DNA repair mechanisms, A673 cells underwent cell cycle arrest in the G2/M-phase and apoptosis.
Keywords: Ewing sarcoma, DNA damage and repair, cell cycle, pivaloyl-substituted pyrrole-containing heterocyclic compounds.
Адрес для переписки: boichuksergei@mail.ru
Поступила 05.09.2017; принята в печать 26.09.2017.
Саркома Юинга — одна из наиболее распространённых злокачественных опухолей костной ткани у детей и подростков. Заболевание впервые описал в 1921 г. американский патолог Джеймс Юинг (1866-1943). Саркома Юинга чаще встречается у мальчиков, пик заболеваемости приходится на возраст от 10 до 15 лет [1].
Данная опухоль в основном поражает диафизы длинных трубчатых костей. Кроме того, саркома Юинга может локализоваться в рёбрах, тазовых костях, лопатке и ключице. Клинически данное заболевание, как правило, проявляется болевым синдромом и развитием отёка в области поражённой кости [2]. Опухоль характеризуется весьма агрессивным течением, и у 20-30% пациентов на момент постановки диагноза отмечают метастазы (лёгкие, костная ткань, лимфатические узлы) [3].
Общая стратегия лечения саркомы Юин-га включает химиотерапию с последующей оперативной и/или лучевой местной терапией [4]. К основным группам химиопре-паратов, применяемых в лечении саркомы Юинга, относятся алкилирующие агенты (ифосфамид, циклофосфамид), антрацикли-ны (адриамицин, доксорубицин), этопо-зид, актиномицин D и алкалоиды барвинка (винбластин) [5, 6]. Пациентам с плохим гистологическим ответом на обычные дозы химиотерапии назначают высокие дозы бу-сульфана и мелфалан. Благодаря комбинации химиотерапии и местного лечения 5-летняя выживаемость больных составляет более 70%. Тем не менее, у ряда больных развиваются рецидивы опухоли, характеризующиеся тяжёлым течением и плохим прогнозом (2-летняя выживаемость после рецидива составляет 20%) [7, 8].
В соответствии с вышеизложенным представляло интерес изучить механизмы активности синтезированных нами пи-валоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) в отношении клеток саркомы Юинга. Ранее нами было установлено, что ПЗПГ вызывают в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей деполимеризацию белка тубулина. В результате этого клетки задерживаются в М-фазе клеточного цикла (митотическая катастрофа) и гибнут по механизму апоптоза [9].
Объектом исследования были опухолевые клетки саркомы Юинга линии А673 (АТСС, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% С02) в
Рис. 1. Изучение способности химиопрепаратов (доксорубицина, винбластина) и пивалоил-за-мещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) индуцировать двуни-тевые разрывы ДНК в клетках саркомы Юинга линии А673 и их репарацию. Инкубация 24 и 48 ч. у-Н2АХ — маркёр двунитевых разрывов ДНК; рАТМ S1981 — маркёр репарации двунитевых разрывов; рВRСА S1524 — маркёр активации гомологичной рекомбинации; Н2АХ, АТМ, ВRСА — общие (неактивированные) формы белков; актин отражает уровень белка в образцах. Доксорубицин (Докс) — 0,25 мкг/мл; винбластин (Вин) — 1 нмоль; ПЗПГ-20 — 5 мкмоль, ПЗПГ-24 — 5 мкмоль
культуральный среде DMEM («ПанЭКО») с добавлением L-глутамина («ПанЭКО»), эмбриональной телячьей сыворотки («НуС1опе») и антибиотиков («ПанЭКО»). При достижении 70% конфлюентности к клеткам добавляли ПЗПГ №20 (ПЗПГ-20) и №24 (ПЗПГ-24) в количестве 5 мкмоль. Через 24 и 48 ч инкубации клетки подвергали лизису. Полученные клеточные лизаты методом электрофореза разделяли по молекулярной массе и детектировали с помощью биохимической реакции «антиген-антитело» методом иммуноблоттинга.
Были исследованы уровни экспрессии маркёров репарации однонитевых (ATR, СЫк-1) и двунитевых (у-Н2АХ, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, СИк-2) повреждений дезоксирибо-нуклеиновой кислоты (ДНК). В качестве препаратов сравнения были использованы доксорубицин в дозе 0,25 мкг/мл и винбластин в дозе 1 нмоль (Sigma-Aldrich, США).
Доксорубицин является противоопухолевым антибиотиком антрациклиново-го ряда и по механизму действия относится к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа.
Таблица 1. Изучение влияния доксорубицина, винбластина, ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 на фазы клеточного цикла опухолевых клеток линии А673
Исследуемое вещество Фазы клеточного цикла Апоптоз, %
G0/G1, % S, % G2/M, %
Контроль 77,1±1,0 4,8±1,6 15,4±1,6 2,1±0,9
Доксорубицин, 0,25 мкг/мл 11,0±0,8* 4,1±1,0 81,8±2,1* 3,0±0,7
Винбластин, 1 нмоль 14,8±0,9* 1,3±0,6 54,0±1,2* 30,0±1,2*
ПЗПГ-20, 15 мкмоль 36,6±1,1* 8,0±0,7* 36,0±1,1* 19,4±1,1*
ПЗПГ-24, 15 мкмоль 40,3±1,2* 9,4±0,7* 33,5±0,9* 16,8±1,0*
Примечание: инкубация 48 ч; полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение; *различия относительно контроля статистически значимы (р <0,05); ПЗПГ — пивалоил-замещённые пиррол-содержащие гетероциклические соединения.
Винбластин относится к митотическим ядам (так же, как и ПЗПГ, деполимеризует тубулин), является алкалоидом барвинка. Оба препарата используют в лечении саркомы Юинга.
Методом проточной цитометрии (BD FacsCanto, США) изучали влияние ПЗПГ-20, ПЗПГ-24 и химиопрепаратов на регуляцию фаз клеточного цикла опухолевых клеток линии А673, а также механизмы их гибели. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.
Было обнаружено, что ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцируют фосфорилирование гистона 2 по серину 139 (y-H2AX) в клетках саркомы Юинга линии А673 (рис. 1). Эффект был более выражен через 48 ч инкубации клеток с исследуемыми соединениями. Подобный эффект также отмечен у доксорубицина и, в меньшей степени, у вин-бластина.
Повышенная экспрессия в опухолевых клетках y-H2AX свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК. В пользу этого также свидетельствует активация соответствующих путей репарации ДНК, в частности белков ATM-киназы, и BRCA1 (см. рис. 1). Увеличение экспрессии фосфорилированной формы BRCA-1 свидетельствует об активации репарации двунитевых разрывов путём гомологичной рекомбинации.
Известно, что появление в клетках од-нонитевых разрывов ДНК сопровождается активацией соответствующих путей репарации повреждений ДНК, о чём может
свидетельствовать гиперэкспрессия фос-форилированных форм ATR- и №к1-ки-назы [10]. Результаты проведённых нами исследований показывают, что в клетках саркомы Юинга через 48 ч инкубации с соединениями ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 не повышалась экспрессия активированных (то есть фосфорилированных) вышеуказанных киназ, что свидетельствует о способности соединений ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках линии А673 образование исключительно двунитевых разрывов ДНК.
Методом проточной цитометрии было установлено, что под влиянием ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 в опухолевых клетках линии А673 происходило нарушение регуляции фаз клеточного цикла, что проявлялось в виде накопления клеток в фазах G2/M клеточного цикла (табл. 1). Кроме того, соединения ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировали гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза (отмечалась повышенная экспрессия пропи-дия йодида, что указывает на наличие фрагментации молекул ДНК).
Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о способности ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках саркомы Юинга образование дву-нитевых разрывов ДНК, что приводит к последующей активации АТМ-опосредо-ванного пути репарации данных повреждений. Несмотря на активацию данной системы репарации повреждений ДНК, в опухолевых клетках происходила остановка клеточного цикла в фазе G2/M, а затем последующая их гибель по механизму апоптоза.
ВЫВОДЫ
1. Клетки саркомы Юинга линии А673 чувствительны к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим
соединениям, индуцирующим образование двунитевых разрывов ДНК и последующую гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.
2. Полученные нами результаты свидетельствуют о чувствительности клеток саркомы Юинга линии А673 к пивало-ил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям in vitro и открывают перспективы для более углублённого изучения механизмов цитоток-сического действия данных соединений в отношении опухолевых клеток саркомы Юинга.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант мол а №16-34-01005).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.
ЛИТЕРАТУРА
1. Delattre O., Zucman J., Melot T. et al. The Ewing-family of tumors — a subgroup of small-round-cell tumors defined by specific chimeric transcripts. N. Engl. J. Med. 1994; 331 (5): 294-299. DOI: 10.1056/ NEJM199408043310503.
2. Le Deley M.C., Delattre O., Schäfer K.L. et al. Impact of EWS-ETS fusion type on disease progression in Ewing's sarcoma/peripheral primitive neuroectodermal tumor: prospective results from the cooperative Euro-E.W.I.N.G. 99 trial. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 19821988. DOI: 10.1200/JC0.2009.23.3585.
3. Van Doominck J.A., Ji L., Schaub B. et al. Current treatment protocols have eliminated the
prognostic advantage of type 1 fusions in Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 1989-1994. DOI: 10.1200/ JCO.2009.24.5845.
4. Juergens C., Weston C., Lewis I. et al. Safety assessment of intensive induction with vincristine, ifosfamide, doxorubicin, and etoposide (VIDE) in the treatment of Ewing tumors in the EURO-E.W.I.N.G. 99 clinical trial. Pediatr. Blood Cancer. 2006; 47 (1): 22-29. DOI: 10.1002/pbc.20820.
5. Le Deley M.C., Paulussen M., Ian Lewis I. et al. Cyclophosphamide compared with ifosfamide in consolidation treatment of standard-risk Ewing sarcoma: results of the randomized noninferiority Euro-EWING99-R1 trial. J. Clin. Oncol. 2014; 32 (23): 24402448. DOI: 10.1200/JCO.2013.54.4833.
6. Womer R.B., West D.C., Krailo M.D. et al. Randomized controlled trial of interval-compressed chemotherapy for the treatment of localized Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2012; 30 (33): 4148-4154. DOI: 10.1200/ JCO.2011.41.5703.
7. Wagner L.M., McAllister N., Goldsby R.E. et al. Temozolomide and intravenous irinotecan for treatment of advanced Ewing sarcoma. Pediatr. Blood Cancer. 2007; 48 (2): 132-139. DOI: 10.1002/pbc.20697.
8. Haeusler J., Ranft A., Boelling T. et al. The value of local treatment in patients with primary, disseminated, multifocal Ewing sarcoma (PDMES). Cancer. 2010; 116 (2): 443-450. DOI: 10.1002/ cncr.24740.
9. Boichuk S., Galembikova A., Zykova S. et al. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro. AntiCancer Drugs. 2016; 27 (7): 620-634. DOI: 10.1097/ CAD.0000000000000372.
10. Kumagai A., Lee J., Yoo H.Y., Dunphy W.G. TopBP1 activates the ATR-ATRIP complex. Cell. 2006; 124 (5): 943-955. DOI: 10.1016/j.cell.2005.12.041.
УДК 617.713: 616-035 © 2018 Ожмухаметова Э.К. и соавторы
Экспериментальная гнойная язва роговицы у кроликов как модель для исследования глазных лекарственных форм
Эльвира Келгембаевна Ожмухаметова1, Марат Нукенович Мусин\1, Айбол Баяхметов1, Балгын Адамбосынов1, Виталий Викторович Хуторянский2* 1 Государственный медицинский университет, г. Семей, Казахстан; 2Университет Рединга, г. Рединг, Великобритания
Реферат DOI: 10Л78ШKMJ2018-248
Цель. Создание экспериментальной модели гнойной язвы роговицы у кроликов для её использования при исследовании глазных лекарственных форм.
Методы. Формирование язвы роговицы сопровождается повышением температуры тела, которая была исследована в трёх группах кроликов: (1) без нанесения травмы; (2) с нанесением травмы и формированием гнойной язвы без лечения; (3) с нанесением травмы и лечением ципрофлоксацином. Параллельно проводили забор гнойного отделяемого для подсчёта колоний стафилококка. После выведения кроликов второй и третьей групп из эксперимента извлечённые роговицы были подвержены патоморфологическому анализу.
Адрес для переписки: v.khutoryanskiy@reading.ac.uk 248
Поступила 21.12.2017; принята в печать 19.01.2018.
