CC BY
51
УДК 618. 4 + 618. 5 - 089. 888. 61] - 07: 576. 314. 6
МИКРОВЕЗИКУЛЯЦИЯ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ РОДАХ И КЕСАРЕВОМ СЕЧЕНИИ
Н.В. Яковлев, Л.Д. Зубаирова, А.А. Хасанов, Ф.А. Абдулхаев
Кафедра акушерства и гинекологии N 1 (зав. - доц. А.А. Хасанов), кафедра патологической физиологии (зав. - проф. М.М. Миннебаев) кафедра биохимии (зав.- акад. АНТ, проф. ДМ. Зубаиров) Казанского государственного медицинского университета, Межрегиональный клинико-диагностический центр (главврач - Р.Н. Хайруллин), г. Казань
Согласно данным ВОЗ (1998), ежегодно в мире происходит 14 миллионов случаев акушерских кровотечений, при этом 128 тысяч женщин гибнут в первые 4 часа после родов. Частота кровотечений в последовом и раннем послеродовом периодах варьирует от 2,5 до 8 % [8]. Материнская смертность составляет 10- 13% в развитых странах и достигает 40% в развивающихся. В последние годы в акушерской практике наблюдается рост частоты оперативного ро-доразрешения, в основном за счет учащения производства кесарева сечения. Несмотря на длительный опыт применения и постоянное совершенствование последней, эта операция несет в себе угрозу здоровью матери, причем в первую очередь в связи с высоким риском развития тромбогеморрагических осложнений. По данным М.А. Репиной [6], кровотечение при кесаревом сечении возникает в 3-5 раз чаще, чем при естественном родоразрешении, в 68,4% случаев оно носит коагулопатический характер. Смертельные эмболии легочной артерии после кесарева сечения наблюдаются в 1,3-1,7 % случаев по сравнению с 0,03% после физиологических родов [1].
Послеродовый маточный гемостаз -сложный многофакторный процесс, включающий ретракцию миометрия и тромбооб-разование в сосудах плацентарной площадки [6].
Носителем доступного тканевого фактора, Р-селектина и его лиганда (РБОЬ), анионных фосфолипидов для сборки теназ-ного и протромбиназного комплексов свертывающей системы крови являются не только клетки, но и субклеточные образования - микровезикулы, образующиеся при активации и апоптозе клеток [2, 17, 18]. Микровезикулы, отделяющиеся от материнского эндотелия кровеносных сосудов и тромбоцитов, а также от трофобласта, могут усиливать прокоагулянтный эффект при их избыточном образовании и диссеми-нации [15, 16].
Целью настоящего исследования была оценка количества и некоторых качествен-
ных характеристик - экспрессии фосфати-дилсерина и клеточной принадлежности микровезикул в последовом и раннем послеродовом периодах, а также при кесаревом сечении.
Были исследованы пробы цитратной крови, взятой в первом и третьем периодах физиологических родов, до осуществления разреза на коже и после извлечения плода при кесаревом сечении, а также ретропла-центарной крови. Для работы были определены группы пациенток, родоразрешенных через естественные родовые пути (13 женщин) и путем кесарева сечения (14) в родильном отделении клиники им. проф. В.С. Груздева. Контролем служили 5 здоровых небеременных женщин. На проведение исследования было получено одобрение республиканского комитета по этическим вопросам МЗ РТ. Все женщины были проинформированы о сути исследования с подписанием добровольного согласия на участие. Основным критерием их включения было отсутствие клинических и лабораторных признаков коагулопатических расстройств, серьезной экстрагенитальной патологии, тяжелого гестоза. У всех обследованных отмечена кровопотеря, составившая по визуальной оценке в среднем 175 мл в родах и 422,5 мл при кесаревом сечении.
Выделение микровезикул. Забор периферической крови осуществляли путем венепункции иглой G21. Ретроплацентарную кровь собирали при ее свободном истечении из полости матки сразу после рождения последа при физиологических родах, а также забирали непосредственно из полости матки после извлечения последа при кесаревом сечении. 0,9 мл крови набирали в вакуумные пробирки, содержащие 0,1 мл 3,8% профильтрованного стерильного раствора антикоагулянта - цитрата натрия (разведение 1:9). Цитратную кровь центрифугировали 15 минут при 1500 g, отделяли бесклеточную плазму, которую разводили раствором Cell Wash (Becton Dickinson, США) 1:10 и исследовали методом проточ-
Таблица 1
Цитограмма крови в динамике родов и кесарева сечения
Первый период родов Третий период родов
До операции После извлечения плода
Лейкоциты,-109 /мкл 15,4±1,5 18,3±0,6 7,94±1,25 9,06±1,44
Гранулоциты,-10 9 /мкл 12,4±1,4 15,4±0,98** 5,8±0,9 6,3±0,85
Лимфоциты,-10 9 /мкл 1,64±0,12 2,0±0,41 1,85±0,32 2,35±0,51
Моноциты,-109 /мкл 0,34±0,07 0,5±0,12 0,34±0,1 0,39±0,13
Эритроциты,-1012 /мкл 3,63±0,1 3,64±0,1 3,58±0,2 3,42±0,2
Тромбоциты,-109/мкл 290,0±52,5 271,5±43,3 225,6±40,8 231,1±48,8
* р < 0,05, ** р < 0,01.
Скрининг гемостаза в динамике родов и кесарева сечения
Таблица 2
Первый период родов Третий период родов До операции После извлечения плода
Фибриноген, г/л 3,18±0,12
АЧТВ, с 33,88±2,58
ПВ, с 12,48±0,34
ной цитометрии на приборе “Facscan (Becton Dickinson).
Абсолютное количество микровезикул в 1 мкл определяли по светорассеиванию за фиксированное время (60 с) с использованием программы Cell Quest, регистрируя количество событий за единицу времени. Регистрация прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания в логарифмическом режиме позволила дискриминировать микровезикулы в отдельной зоне.
Оценка ремоделирования мембраны.
0,5 мл крови подвергали лизированию (ли-зирующий раствор Becton Dickinson) для удаления эритроцитов, трижды центрифугировали по 15 минут при 1500 g для удаления продуктов лизиса. Осадок клеток ресуспензировали в 0,5 мл раствора СеП Wash. Пробы клеточной взвеси и бескле-точной плазмы анализировали на проточном цитометре, определяя перестройку клеточной мембраны по связыванию клетками и микровезикулами липофильного флуо-рохрома мероцианина 540 (МС540), взаимодействие которого с мембранами повышается при их распаковке и совпадает со степенью экспрессии фосфатидилсерина (ФС) при оценке связывания его с аннек-сином V [5]. Результаты регистрировали на втором детекторе флуоресценции FL2. Фенотип МС540 положительных клеток и микровезикул определяли с использованием моноклональных антител к тромбоци-тарному гликопротеину IIbIIIa (FITC-CD61) в реакции прямой иммунофлуорес-
2,94±0,14 3,75±0,11 3,65±0,06
37,16±0,76 32,96±1,89 34,48±1,72
13,32±0,76 12,28±0,29 12,46±0,33
ценции. Визуализация различий в областях эмиссии используемых флуорохромов позволила одномоментно оценить фенотип активированных клеток крови и клеточное происхождение прокоагулянтных микровезикул. Для исключения неспецифической флуоресценции проводили реакцию с отрицательным изотипическим контролем (использовали иммуноглобулины мыши того же изотипа, меченные аналогичным флуо-рохромом FITC).
Скрининговую оценку системы гемостаза производили по уровню фибриногена, активированному частичному тромбоплас-тиновому времени, протромбиновому времени в коагулометре Thrombotimer 4 (Behnk Elektronik). Цитограмму крови определяли в гематологическом анализаторе MICROS-6O-I8 ABX. Статистическую значимость различий между средними величинами оценивали по t-критерию Стьюдента.
Анализ цитограммы выявил у беременных гранулоцитоз, усиливавшийся при ро-доразрешении через естественные родовые пути, что может быть объяснено мобилизацией гранулоцитарных лейкоцитов из пристеночного пула. Количество тромбоцитов во всех группах не выходило за границы нормальных колебаний. В наших исследованиях лишь у 2 женщин наблюдался тромбоцитоз. Количество эритроцитов соответствовало норме (табл.1). Анализ скрининга гемостаза не выявил патологических отклонений исследованных параметров ни в одной из обследованных групп (табл.2).
Рис. 1 Количество микровезикул в периферической крови в динамике родов и кесарева сечения.
Количество микровезикул в контрольной группе здоровых небеременных женщин составило 12353,0 ± 301,4/мкл, а у беременных перед родоразрешением -16700,4± 3164,5/мкл. В первом периоде физиологических родов количество микровезикул с 11610,6 ± 2676,9/мкл несколько увеличилось до 12627,4± 2520,2/мкл в третьем. В ретроплацентарной крови обнаружено 179248,0+ 48504,8/мкл микровезикул. В динамике кесарева сечения эти показатели были равны соответственно
Контрольная группа Физиологические роды Кесарево сечение (небеременные)
□ Первый период родов/До кожного разреза □Третий период родов/После извлечения плода
□ Ретроплацентарная кровь
Рис.2. Связывание МС 540 тромбоцитами.
23826,2 ± 5411,2/мкл, 14350,6 ± 2525,0/мкл и 209338,4±36394,3/Мкл. Значительные индивидуальные колебания количества микровезикул наблюдались в периферической крови - от 3440 до 44885/мкл. В этой связи математический анализ данных производился в относительных величинах (%). Микровезикулы из ретроплацентарной крови при проточной цитометрии занимали область, характерную для частиц большего размера и гранулярности.
При анализе результатов подсчета микровезикул было установлено, что беременность сопровождается повышением их об-
щего количества в периферической крови до 135% по сравнению с контрольным уровнем у небеременных. При родоразрешении через естественные родовые пути изменения уровня микровезикуляции в периферической крови не происходило, вместе с тем маточная кровь содержала в 14,2 раза большее количество микровезикул, то есть образование этих прокоагулянтных частиц ограничивалось плацентарной площадкой, где они и выполняют свои адаптивные функции. В динамике кесарева сечения в периферической крови отмечалось достоверное снижение количества микровезикул, которое составляло 60% от предоперационного уровня, а в маточной крови их было в 14,6 раза больше, что также свидетельствовало о локальном усилении процесса микрове-зикуляции в рамках адаптивной реакции (рж.1).
В контрольной группе мероцианин-по-ложительные клетки составляли 6,7% (рис. 2), в первом периоде родов - 21,9 + 3,43%, в третьем - 15,9 + 2,1% (р>0,05), а в маточной крови - 25,5 + 0,5%(р<0,01), т.е. 160,4% по сравнению с таковыми в периферической крови в том же периоде. Двойная метка мероцианином и СБ61 показала, что все МС540-положительльные клетки в периферической и плацентарной крови являются тромбоцитами.
До кесарева сечения МС540 положительные клетки составляли 17,6 + 1,3%, после операции - 29,5 + 3,9% (р<0,05), а в рет-роплацентарной крови - 23,8 + 4,8%, т.е. 80,7% по сравнению с уровнем в периферической крови в том же периоде.
Таким образом, беременность сопровождается активацией тромбоцитов, проявляющейся повышением экспрессии прокоа-гулянтного ФС. В ходе физиологических родов в периферической крови она не меняется, но возрастает на плацентарной площадке. В то же время в динамике кесарева сечения значительно (до 167,6% от исходного уровня) возрастает экспрессия ФС на тромбоцитах именно в периферической крови. Уровень этого прокоагулянтного фосфолипида на тромбоцитах в маточной крови также выше дооперационных значений в системной циркуляции, но ниже, чем в периферической крови после извлечения плода. В целом же следует отметить, что степень активации тромбоцитов, оцениваемая по изменению асимметрии мембранных фосфолипидов, в динамике оперативного вмешательства выше, чем при физиологических родах.
%
70 60 50 40 30 20 10 0
Физиологические роды Кесарево сечение
□ Первый период родов/Др кожного разреза
□ Третий период родов/После извлечения плода
□ Ретроплацентарная кровь
Рис.3. Связывание МС 540 микровезикулами.
В первом периоде родов количество ме-роцианин-положительных частиц в периферической крови составляло 25,8+0,6%, в третьем - 26,1+0,9%, в маточной крови -54,6+2,68% (р<0,001), или 209,2% от уровня в системном кровотоке. До операции МС540 положительные микровезикулы в плазме периферической крови составляли 20,8+2,2%, после извлечения плода - 32,6+ +2,9% (р<0,01), в плазме маточной крови -43,0+1,3% (р<0,01), или 131,9% от уровня в периферической крови в том же периоде (рис. 3).
Следовательно, при физиологических родах в периферической крови не меняется уровень ни МС540+ тромбоцитов, ни количества микровезикул. В то же время на плацентарной площадке, где, как выявлено нами, общее количество микровезикул было в 14 раз больше, чем на периферии, значительно выше (на 160,4%) и степень связывания мероцианина.
В динамике оперативного вмешательства в периферической крови существенно возрастает уровень связывания мерациани-на микровезикул. Обнаруженное нами снижение общего числа этих частиц после кесарева сечения показало, что остающиеся в циркуляции микровезикулы экспонируют больше ФС. Это может быть объяснено образованием их из активированных тромбоцитов, что согласуется с отмеченной выраженной экстернализацией ФС на этих клетках в периферической крови в динамике кесарева сечения. Степень экспозиции ФС на микровезикулах маточной крови после операции выше, чем в системной циркуляции, однако меньше, чем при физиологических родах, т.е. при кесаревом сечении активация и микровезикуляция тромбоцитов относительно более выражены в периферической крови.
Микровезикуляция клеток сосудистого сектора является физиологическим процессом, сопровождающим их активацию и
апоптоз [2, 12]. Образующиеся микровезикулы, несущие в своем составе мембранные детерминанты клеток-родителей, обладают рядом биологических активностей [14], среди которых одной из важнейших выступает прокоагулянтная [2, 11, 18]. В условиях избыточной микровезикуляции возникают условия для усиленного роста тромбов, а также распространения прокоагулянтного потенциала за пределы участка инициации свертывания крови.
Проведенное нами исследование количества и качественных характеристик микровезикул в динамике физиологического родоразрешения и путем кесарева сечения позволяет заключить, что колебания общего количества микровезикул от 135% у беременных по сравнению с небеременными женщинами до 60% в динамике операции не сопровождается патологическими изменениями системного гемостаза. При физиологических родах количество микровезикул в системном кровотоке и экспрессия на них ФС не претерпевают значительных изменений, вместе с тем в маточной крови чрезвычайно велико как общее число микровезикул, так и содержание в них ФС. Таким образом, наряду с другими прокоагу-лянтными компонентами, и в первую очередь повышенной экспрессией тканевого фактора [9, 10, 13], образующиеся на плацентарной площадке микровезикулы содержат в своем составе повышенное количество аминофосфолипидов для выполнения адаптивной гемостатической функции [4, 7].
Характер микровезикуляции при кесаревом сечении имеет ряд отличий. Высокий уровень микровезикул в ретроплацентар-ной крови, содержащих повышенное количество ФС, как и при физиологических родах, отражает местный адаптивный ответ системы гемостаза. Вместе с тем в системном кровотоке после извлечения плода экспрессия ФС на микровезикулах в 1,5 раза превышает предоперационный уровень, коррелируя с такой же степенью увеличения его экспрессии на тромбоцитах. Выраженная активация и микровезикуляция тромбоцитов в периферической крови с учетом прокоагулянтного потенциала микровезикул может являться фактором риска тромбогеморрагических осложнений кесарева сечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балуда В.П., Деянов И.И, Балуда М.В. и др. Профилактика тромбозов. - Саратов, 1992.
2. Зубаиров Д.М,, Андрушко И.А,, Зубаирова Л.Д. // Гематол. и трансфузиол. - 1999. - № 5. - С.24- 30.
3. Кулаков В.И., Чернуха Е.А., Комисарова Л.М. Кесарево сечение. - М., 2004.
4. Мальцева Л.И., Андрушко И.А., Ибрагимов О.Б. // Казанский мед.ж. - 1996. - № 2. - С.118-125.
5. Мустафин И.Г. Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-инфекции: Автореф. дисс. ...докт. мед. наук - Казань, 2005.
6. Репина М.А. Кровотечения в акушерской практике. - М., 1986.
7. Субханкулова А.Ф. // Казанский мед. ж. - 1987. -№ 4. - С. 279 -281.
8. Чернуха ЕА. Родовой блок. - М., 2005.
9. Aharon A., Brenner В. et al. // Thromb. Haemost. -2004. - Vol. 92 - P.776-786.
10. Brenner B. // Thrombosis Research. - 2004. -Vol.114.- P.409-414.
11. Freyssinet J.M. //J. Thromb. Haemost. - 2003. -Vol.1 - P.1655-1662.
12. Horstman L.L., Ahn Y.S. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. -1999. - Vol.30 - P. 111-142.
13. Lanir N, Aharon A., Brenner B. // Best Pract. Res. Clin. Haematol. - 2003. - Vol.16 - P.183 - 195.
14. MartHnez M. C, Tesse A. et al. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 2005. - Vol. 288 - P.1004 -1009.
15. Satta N., Toti F. et al. // J. Immunol. - 1994. -Vol.153. - P. 3245 - 3255.
16. Van Wijk MJ, Nieuwland R et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2002. - Vol.187 - P. 450-456.
17. Van Wijk M.J,, VanBavelE. et al. // Cardiovasc. Res.- 2003. - Vol.59 - P. 277-287.
18. Zwaal R.F., Schroit A.J. // Blood. - 1997. -Vol. 89 - P. 1121-1132.
Поступила 09.03.06.
MICROVESICULATION IN PHYSIOLOGICAL DELIVERY AND CESAREAN SECTION
N.V. Yakovlev, L.D. Zubairova, A.A. Khasanov,
F.A. Abdulkhaev
S u m m a r y
The total number of microvesicles and expression of procoagulant phosphatidylserine were evaluated in circulation and retroplacental blood of women during physiological delivery and cesarean section. The principal differences in women after cesareans were characterized by high expression of phosphatidylserine in microvesicles in peripheral blood and microvesiculation out of placental place
УДК 616. 3 - 006. 6 - 089. 8 : 612. 233. 12 : 616. 153. 915. 915 - 039 - 074
ВЛИЯНИЕ ОЗОНО-ОКСИГЕНИРОВАННЫХ КРИСТАЛЛОИДОВ НА ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В РАННЕМ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
В.М. Белопухов, Л.Р. Мингалина, Е.А. Ацель
Кафедра анестезиологии и реаниматологии (зав. - проф. В.М. Белопухов) Казанской государственной медицинской академии последипломного образования
Целью исследования являлось изучение общих закономерностей терапевтического действия озоно-оксигенированных кристаллоидов на перекисное окисление липидов (ПОЛ) с исследованием его ведущих механизмов в послеоперационном периоде у онкологических больных. В основу работы были положены клинические наблюдения за 170 больными с опухолями желудочно-кишечного тракта, которые находились на стационарном лечении в городском онкологическом диспансере (г. Казань) с 1998 по 2002 г. Все больные были разделены на 2 группы. В основной группе было 105 послеоперационных больных с заболеванием желудка (35), толстого кишечника (35), прямой кишки (35). В контрольную группу вошли 65 послеоперационных больных. Пациенты двух групп получали стандартное послеоперационное лечение, а в основной группе - дополнительно внутривенное капельное введение озонированного физиологического раствора с концентрацией
озона на выходе из прибора 20 мг/л по 200 мл в течение 5 дней. Озонирование физиологического раствора [1] осуществляли в стандартных флаконах по 200 мл методом барботирования через воздушную иглу кислородно-озоновой смесью, полученной на синтезаторе озона «Озон-3», способного создавать концентрацию озона на выходе, равную 50 мг/л. Время насыщения раствора озоном составляло 10 минут. В группе сравнения было 40 условно здоровых лиц, сопоставимых по возрасту и полу.
Перед назначением лечения и после завершения курса проводилось обследование больных всех групп, включавшее анализ коагулограммы, определение свертываемости крови по Сухареву, кажущейся вязкости крови, содержание продуктов ПОЛ и активности ферментов антиокислитель-ной системы, общий анализ крови [3].
Находили среднеарифметические показатели (М), стандартную ошибку (т). Достоверность различий между выборками по
