CC BY
73
УДК 612.111.3: 612.41: 577.122.36: 616-005.1-036.111-092.9 © Ю.М. Захаров, Ф.Х. Камилов, 2014
Ю.М. Захаров1, Ф.Х. Камилов2 ВЛИЯНИЕ ОСТРОЙ КРОВОПОТЕРИ НА СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ТКАНИ КОСТНОГО МОЗГА, ПОЧЕК И ПЕЧЕНИ У КРОЛИКОВ
1 Южно-Уральский научный центр РАМН, г. Челябинск 2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Уфа
Исследованы особенности пула свободных аминокислот в ткани костного мозга, почек и печени кроликов к 24-му часу после острой кровопотери, в период усиления специфической функции данных органов.
Острая кровопотеря вызывает уменьшение в костном мозге содержания свободного цистеина, лизина, треонина и тирозина, но увеличивает содержание свободной глютаминовой кислоты, валина и фенилаланина; в почках уменьшается содержание свободного цистеина, метионина и аргинина, но увеличивается содержание аланина, триптофана и валина; в печени уменьшается концентрация гистидина, цистеина аргинина и метионина.
Ключевые слова: кровопотеря, аминокислоты, костный мозг, почки, печень.
Yu.M. Zakharov, F.Kh. Kamilov INFLUENCE OF BLEEDING ON CONCENTRATION OF FREE AMINO ACIDES IN BONE MARROW, KIDNEY AND LIVER IN RABBITS
The present research studies the features of pool of free amino acids in tissues of bone marrow, kidneys and liver in rabbits by 24th hour after acute bleeding at the period of these organs specific functions increase.
Acute bleeding decreases concentration of free cysteine, lysin, threonine and tyrosine, but increases concentrations of free glutamic acid, valine and phenylalanine in bone marrow, decreases free cysteine, methionine and arginine, but increases concentration of alanine, tryptophane and valine in kidneys; decreases concentration of histidine, arginine and methionine in liver of rabbits.
Key words: bleeding, amino acids, bone marrow, kidneys, liver.
Интенсивность биосинтетических процессов, пролиферации и дифференциации клеток тесно связана с использованием свободных аминокислот. При этом отмечена выраженная специфичность ответов тканей на их поступление. Аспарагин, лизин, аргинин, раздельно внесённые в культуру фрагментов селезёнки крыс, стимулируют пролиферацию клеток, не влияют на экспрессию р53 -проапоптозного белка [1,13]. Аспарагиновая же кислота, цистин, тирозин, треонин, метио-нин, лейцин, изолейцин, фенилаланин и триптофан ингибируют пролиферацию клеток им-плантов селезёнки [1], экспрессия р53 в них усиливается [13]. Имеются отдельные работы по исследованию пул свободных аминокислот и их влиянию на кроветворение в костном мозге [3,16]. Содержащая эритропоэтин плазма крови и раздельно добавленные к инкубируемой крови глицин, валин, лейцин, гисти-дин увеличивают за 5 часов инкубации in vitro прирост гемоглобина в ретикулоцитах, включение в них глицина -2-С14 [4]. Эритропоэз у млекопитающих и человека протекает в костном мозге в эритробластических островках (ЭО), представляющие собой ассоциации макрофагов с окружающей их «короной» из эритроидных клеток [8]. Абсолютное количество колониеобразующих клеток [2], вступающих в эритроидную дифференциацию в ЭО у крыс к 24-му часу после острой кровопотери по сравнению с исходным уровнем возрастает
в 2,3 раза, в 2 раза - абсолютное количество ЭО с «короной» из активно пролиферирую-щих эритробластов, снижается же число ЭО с «короной» из нормобластов, ускоренно созревающих в ретикулоциты [12], что влечет за собой почти двойное увеличение суточной продукции эритроцитов костным мозгом к 24-му часу после кровопотери [5]. Данная активация эритропоэза обусловлена резким увеличением содержания эритропоэтина в крови на 12-20 часов после кровопотери [5]. Эритропоэтин к 24-му часу после внесения в культуру ЭО резко увеличивает активность биосинтеза в эритробластах и макрофагах ЭО, синхронизуя ее с ростом пролиферации и созревания эритроидных клеток, эритропоэтической функции макрофагов [6].
В почках спустя 15 мин после гипокси-ческого воздействия на организм гипоксией индуцируемый фактор-1 активирует экспрессию гена эритропоэтина и его синтез [7]. Ткань печени отвечает на кровопотерю ростом синтеза белков плазмы крови, эритропоэтина [8]. В данной работе исследованы особенности пула свободных аминокислот в ткани костного мозга, почек и печени кроликов к 24-му часу после острой кровопотери, в период усиления специфической функции данных органов.
Материал и методы
Исследование проведено на 8 взрослых кроликах массой от 2,0 до 2,3 кг. У 4 кроли-
ков вызывали острую кровопотерю, равную 2% от массы тела. Группу контроля составили 4 кролика. Через 24 часа после острой крово-потери животных забивали, костный мозг получали из обеих бедренных костей, забирались также ткани печени и почек подопытных животных. Выделение и определение свободных аминокислот в данных тканях проводили по [11]. Бумагу FN - 1(Filtrak schnell laufend) обрабатывали 1% раствором трилона Б, многократно промывали бидистиллятом и высушивали на воздухе. В качестве подвижного растворителя применяли смесь н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (растворитель №1) и 40:15:5 (растворитель № 2). Безбелковый экстракт, полученный по указанному методу, наносили на бумагу в количестве 25 мкл, раствор смеси из 16 аминокислот - в количестве 5 мкл. Аминокислоты дважды подвергали хроматографиче-скому разделению растворителем № 1 и дважды растворителем № 2. После воздействия каждого растворителя хроматограммы высушивали на воздухе. Идентификацию аминокислот проводили по контрольной смеси аминокислот и коэффициенту «Rf». Количественное определение аминокислот (в мМ на 1 г свежей ткани) - цистеина, лизина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глицина, серина, глутаминовой кислоты, треонина, аланина, тирозина, триптофана, метионина, валина, фенилаланина, лейцина+изолейцина -проводили по [11].
У 6 интактных крыс одного пола, с одинаковой массой тела исследовали интенсивность включения аминокислоты валина-1-С14 в белки тканей селезенки, почек и печени. Ва-лин-1-С14 вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 100 микрокюри на 1 кг веса. Через 6 часов после введения метки органы животных отмывали in situ физиологическим раствором от крови и гомогенизировали с 0,15 М раствором валина. Гомогенат последовательно обрабатывали 10% трихлоруксусной кислотой (ТХУ), 5% ТХУ, спиртом, спиртом-эфиром и эфиром. 10 мг сухого препарата наносили тонким слоем на мишень и подсчитывали импульсы в течение 10 мин на радиометре Б-2. Активность выражали в имп / мин/ 100 мг сухой ткани.
Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Изменение исследованных параметров считали достоверным при р<0,05.
Результаты и обсуждение. В костном мозге интактных кроликов (табл. 1) отмечена
наибольшая удельная концентрация свободных аминокислот: цистеина, глицина, серина, глютаминовой и аспарагиновой кислот, тирозина, лейцина + изолейцина. Наименьшим в ткани костного мозга оказалось представительство фенилаланина, метионина и триптофана.
В ткани почек, так же как и в костном мозге, наибольшим в пуле было содержание аспарагиновой и глютаминовой кислот, глицина, аланина и тирозина. В почках и печени интактных кроликов обнаружен также более высокий уровень фонда свободных аминокислот по сравнению с костным мозгом. Содержание в ткани почек аспарагиновой и глюта-миновой кислот, треонина, аланина, тирозина, триптофана было достоверно выше, чем в костном мозге. Содержание лизина, аргинина, метионина, валина и фенилаланина было также достоверно выше в почках и печени, чем в костном мозге. Разница в содержании свободных аминокислот между тканью печени и почек была выявлена только в отношении мети-онина - его содержание в 2,3 раза было выше в печени, чем в почках. Кровопотеря вызывала достоверное уменьшение в костном мозге содержание свободного цистеина, лизина, треонина, тирозина, содержание же свободной глютаминовой кислоты, валина и фенилаланина статистически достоверно в нём увеличивалось. В почках после кровопотери достоверно уменьшалось содержание цистеина, метионина и аргинина, но увеличивалось содержание аланина, триптофана и валина (Р<0,05). Кровопотеря вызывала статистически достоверное уменьшение в ткани печени концентрации гистидина, цистеина, аргинина и метионина. Таким образом, в тканях после кровопотери имело место уменьшени, как высокомолекулярных аминокислот с низкой гидрофобностью - лизина, глютаминовой кислоты, аргинина, так и низкомолекулярных аминокислот с высокой гидрофобностью -треонина, тирозина, валина, метионина. Содержание свободного валина в тканях почек и печени интактных кроликов было практически одинаковым, но большим (р<0,05), чем в кроветворной ткани костного мозга. По данным [1], валин, внесенный в одинаковой дозе в органотипические культуры селезенки или печени одномесячных интактных крыс оказывает тормозящее действие на рост данных культур. Интенсивность включения валина-1-С14 в ткани интактных крыс в наших опытах составила: в белки печени - 588±48, почек -1137±128, селезенки - 788±73 имп/ мин/ 100 мг сухой ткани, то есть интенсивность захвата
валина из внеклеточной среды клетками по- содержания отдельных свободных аминокис-чек и селезёнки была выше, чем у печени. лот в ткани необходимо учитывать и особен-Данные результаты косвенно показывают, что ности интенсивности их захвата клетками.
при определении увеличения или уменьшения
Таблица 1
_Состояние фонда свободных аминокислот в тканях кроликов до и после кровопотери_
Аминокислоты Костный мозг, мМ/г Почки, мМ/г Печень, мМ/г
норма (п=4) после кровопотери норма (п=4) после кровопотери норма (п=4) после кровопотери
Цистеин 1,45±0,42 Следы 1,73±0,11 0,25±0,08 3,36±1,2 0,5±0,11
р2<0,02 р1>0,05 р2<0,001 р1>0,05 р2<0,05
Лизин 0,52±0,01 Следы 0,91±0,26 0,41±0,17 1,15±0,14 1,56±0,41
р2<0,01 р1<0,05 р2>0,05 р1>0,01 р2>0,05
Гистидин 0,55±0,14 0,49±0,11 1,55±0,49 0,45±0,08 2,08±0,2 0,91±0,38
р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р1>0,01 р2<0,05
Аргинин 0,29±0,12 0,33±0,08 1,45±0,02 0,43±0,15 1,45±0,05 0,81±0,26
р2>0,05 р1>0,001 р2<0,001 р1>0,001 р2<0,05
Аспарагиновая 1,27±0,19 1,13±0,16 2,55±0,32 2,5±0,1 1,71±0,17 1,85±0,26
кислота р2>0,05 р1<0,02 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Глицин 1,66±0,76 1,06±0,15 4,43±0,49 3,55±0,52 2,75±0,53 1,71±0,15
р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Серин 1,23±0,13 1,39±0,13 2,93±1,5 5,55±0,49 2,68±0,64 4,0±1,8
р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Глютаминовая 1,52±0,23 2,44±0,2 2,97±0,42 3,61±0,53 2,82±0,63 3,1±0,35
кислота р2<0,05 р1<0,05 р2<0,05 р1>0,05 р2>0,05
Треонин 0,93±0,01 0,41±0,11 1,41±0,15 1,26±0,25 0,91±0,2 1,0±0,06
р2<0,01 р1<0,05 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Алании 1,78±0,08 1,2±0,35 2,64±0,3 4,24±0,55 2,13±0,33 2,91±0,69
р2>0,05 р1<0,05 р2<0,05 р1>0,05 р2>0,05
Тирозин 1,5±0.15 1,0±0,14 2,65±0,32 2,36±0,77 1,95±0,5 1,23±0,15
р2<0,05 р1<0,02 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Триптофан 0,4±0,14 0,65±0,31 1,02±0,15 3,54±0,72 0,65±0,14 1,35±0,29
р2>0,05 р1<0,05 р2<0,02 р1>0,05 р2>0,05
Метионин 0,2±0,18 0,43±0,18 0,96±0,05 0,43±0,18 2,3±0,1 0,43±0,18
р2>0,05 р1<0,01 р2<0,05 р1<0,001 р3<0,001 р2<0,001
Валин 0,64±0,1 1,11±0,08 0,98±0,1 1,98±0,22 0,93±0,06 0,81±0,22
р2<0,01 р1<0,05 р2<0,01 р1<0,05 р2>0,05
Фенилаланин Следы 0,52±0,15 0,93±0,05 0,83±0,15 0,75±0,15 0,54±0,27
р2<0,01 р1<0,001 р2>0,05 р1<0,001 р2>0,05
Лейцин+изолейцин 1,6±0,24 0,95±0,29 1,45±0,04 2,12±0,28 1,35±0,42 1,65±0,39
р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05 р1>0,05 р2>0,05
Примечание. р1-показатели различий между содержанием аминокислоты в ткани костного мозга, с одной стороны, почками и печенью - с другой у интактных кроликов; р2 - различия в содержании аминокислоты в ткани до и после кровопотери; р3 -разница в содержании аминокислоты между тканью почек и печенью интактных кроликов.
Понижение содержания в сердце, почках, нервной ткани свободных аминокислот у экспериментальных животных [10], в сыворотке крови - у больных с анемией [9] рассматривается как следствие их усиленного потребления тканями, вызванного ростом их метаболической активности. С этих позиций отмеченное нами уменьшение содержания цистеина, лизина, треонина и тирозина в костном мозге; цистеина, метионина и аргинина в почках; гистидина, аргинина и метионина в печени можно объяснить их повышенным потреблением тканями названных органов после кровопотери, которое необходимо для поддержания усиленного формирования эритроидной ткани и эритроцитов в костном мозге, синтеза эритропоэтина в почках, пури-новых производных для костного мозга в печени, синтеза в ней альбуминов. Этот вывод подкрепляется и опытами, показавшими замедление регенерации красной крови при недостатке в пище подопытных животных лизина, серосодержащих и ароматических амино-
кислот, сниженным содержанием в сыворотке крови лизина, аргинина, метионина, треонина при анемиях различной этиологии у больных людей [9]. Вместе с тем нельзя исключить, что меняющееся после кровопотери количественное соотношение аминокислот в пуле может создавать новые их сочетания (пары аминокислот), оказывающие большее активирующее действие, чем отдельные аминокислоты, на клетки исследуемых тканей [14]. В ткани костного мозга интактных кроликов удельная концентрация глютаминовой кислоты возрастала после кровопотери (р<0,05) и оставалась на высоком уровне в почках и печени. Глютаминовая кислота весьма активно стимулирует окисление ряда аминокислот в цикле трикарбоновых кислот (Кребса) и дыхательной цепи [15], амидный азот ее продукта - глютамина - участвует в синтезе пуринов, гистамина, глюкозаминов, продукт ее производного - а-кетоглютаровой кислоты -сукцинил-СоА - является источником образующейся из него Р-аминолевулиновой кис-
лоты, участвующей в формировании порфи-ринов. Указанные процессы оптимально протекают при высокой концентрации ее в тканях [17], что, возможно, и объясняет сделанное нами наблюдение. Таким образом, природа изменения концентрации свободных аминокислот в тканях после кровопотери представляется весьма сложной и может зависеть от их биосинтетической активности, выраженности процессов образования в них энергии, осо-
бенности транспорта аминокислот в клетки различных тканей.
Выводы
Кровопотеря значительно изменяет тка-неспецифический пул свободных аминокислот в костном мозге, почках и печени кроликов. Характер данных изменений, вероятно, отражает особенности метаболизма исследованных органов после острой кровопотери.
Сведения об авторах статьи:
Захаров Юрий Михайлович - д.м.н., профессор, академик РАМН, директор Южно-Уральского научного центра РАМН, зав. кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России. Адрес: 454096, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. Тел./факс 8 (351) 232-74-67.
Камилов Феликс Хусаинович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО БГМУМинздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. Тел./факс: 8 (347) 272-66-07.
ЛИТЕРАТУРА
1. Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс /А.И. Анискина [и др.] // Успехи геронтологии. - 2006. - Вып. 19. - С.55-59.
2. Воргова, Л.В. Об изменении эритробластических островков костного мозга при сочетании тепловых и физических нагрузок / Л.В. Ворогова, Ю.М. Захаров // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 1990. - Т. 76, № 2. - С. 200-206.
3. Давыдова, О.Н. Глутаматные рецепторы в клетках нервной и иммунной систем / О.Н. Давыдова, А.А. Болдырев // Анналы неврологии. - 2007. - Т.1, № 2. - С.28-34.
4. Захаров, Ю.М. О гуморальной регуляции созревания красных кровяных клеток / Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1970. - № 6. - С.61-64.
5. Захаров, Ю.М. О факторах, регулирующих эритроцитарную картину крови / Ю.М. Захаров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1970. - № 11. - С. 40-43.
6. Захаров, Ю.М. Регуляция эритропоэза в эритробластических островках костного мозга / Ю.М. Захаров // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2011. - Т.97, № 9. - С. 980-994.
7. Захаров, Ю.М. Чувствительность клеток к кислороду и продукция эритропоэтина / Ю.М. Захаров// Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2005. - Т.91, № 9. - С. 993-1004.
8. Захаров, Ю.М. Эритробластический островок - функционально-анатомическая единица эритропоэза / Ю.М. Захаров, И.Ю. Мельников // Гематология и трансфузиология - 1984. - № 10. - С. 51-56.
9. Иванов, А.Л. Содержание некоторых свободных аминокислот в сыворотке крови больных железодефицитным малокровием: автореф. дисс.... канд. мед. наук. - Саратов, 1971. - С.23.
10. Мищенко, В.П. Влияние возраста на транспорт аминокислот / В.П. Мищенко //Молекулярные и функциональные основы онтогенеза. - М., 1970. - С. 58-71.
11. Пасхина, Т.С. Количественное определение аминокислот при помощи хроматографии на бумаге. / Т.С. Пасхина // Современные методы в биохимии. - М., 1964. - Т.1. - С. 162-180.
12. Пушкарев, В.П. Об изменении эритропоэза в эритробластических островка костного мозга крыс после однократной кровопотери / В.П. Пушкарев, Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 1991. - Т.77, № 4. - С. 16-23.
13. Чалисова, Н.И. Модулирующая роль незаменимых и заменимых аминокислот в органотипической культуре тканей крыс разного возраста / Н.И.Чалисова, В.А. Пеннияйнен // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2003. - Т.89, № 5. -С. 591-596.
14. Влияние сочетаний аминокислот на клеточную пролиферацию в культуре тканей старых крыс / Н.И. Чалисова [и др.] // Успехи геронтологии. - 2012. - Т.25, № 2. - С. 360-362.
15. Ястребов, А.П. О роли гипоксии в механизмах регенерации крови: автореф. дисс.. д-ра. мед. наук. - Свердловск, 1972. - 32 с.
16. Aschkenasy A. Effects compares de la caseine et de divers mélanges aminoacides sur la resteuration de l'erythropoiese, de la neutropoise, et de la lymphopoiese, chez des rate prepares par une privation prolongie de proteins / A. Aschkenasy // Arch. Sci. Physiol. - 1971. - Vol. 25. - p. 415-450.
17. Layne E. / On the glutamate-stimulated oxidation of dicarboxylic acid through the Kreb's cycle / E. Layne, S. Bessman // Sympos. Enzymes. Tokyo. - 1968. - p. 173-175.
