CC BY
54
ВЕСТНИК ТГГПУ. 2008. №2(13)
УДК 612.833+612.822.5+591.51+53.083.2
ВЛИЯНИЕ ОКСИДА АЗОТА НА ПРОЦЕСС ФОРМИРОВАНИЯ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ СЕНСИТИЗАЦИИ У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ
© Л.Н.Муранова, В.В. Андрианов, Т.Х.Гайнутдинова, И.В.Залкеева, Х.Л.Гайнутдинов
Найдено, что предварительная инъекция как блокатора NО синтазы L-Name, так и донора NО нитроглицерина не предотвращают долговременной сисетизации, но уменьшают ее выраженность. Хроническое введение нитроглицерина не влияет на мембранный потенциал командный нейронов при долговременной сенситизации, а введение L-Name снижает пороговый потенциал, что демонстрирует повышение возбудимости этих нейронов и коррелирует с усиленной реакцией пневмо-стона.
Оксид азота (NO) является одним из наиболее важных посредников, который участвует в функционировании разнообразных систем организма. У моллюсков оксид азота играет роль межклеточного мессенджера и сигнальной молекулы [1, 2]. В различных ганглиях виноградной улитки ИеНх ¡ысогыт гистохимическим методом были выявлены NADPHd-позитивные нейроны, синтезирующие NO. Деполяризующее действие на NADPHd-позитивные нейроны оказывают доноры оксида азота [2, 3]. Они снижают пороги возбуждения, усиливают ответы на стимуляцию и потенцируют возбуждающее действие глутамата. Оксид азота контролирует пластические свойства этих нейронов: блокатор NO-синтазы способствует развитию привыкания, а доноры оксида азота дают эффект сенситизации [4]. Различные доноры оксида азота оказывают на серотониновые нейроны такое же действие, как и серотонин. Они вызывают деполяризацию, повышение импульсной и синаптической активности. Их действие обратимо и воспроизводится при повторном применении. Серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга [4]. Участие NO в синаптической пластичности наиболее ярко проявляется в таких процессах, как долговременная потенциация и депрессия. С долговременной синаптической потенциа-цией прежде всего в гиппокампе, связывают пластичность межнейронных связей, лежащих в основе памяти [5].
В настоящее время активно исследуется такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения, как долговременная сенситизация (ДС). ДС является одной из форм пластичности, которая появляется в ответ на экстрастимулы, такие как электрошок, сильные химические воздействия. Это состояние характеризуется резким усилением оборонительных реакций, сопровождающихся повышением возбудимости основных элементов нейронной сети -сенсорных, командных либо моторных нейронов [6, 7, 8, 9]. ДС, являясь видонеспецифическим
феноменом, т.е. присущим животным разного уровня организации, позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного при изменении поведения [7, 9]. Реализация такой экспериментальной модели на животных с простой нервной системой создает реальные предпосылки для выяснения клеточных механизмов формирования и развития состояний, возникающих при различных нервнопсихических расстройствах (стрессовые состояния, разного рода возбуждения, шизофрения и т.д.), и позволяет успешно исследовать мембранные механизмы долговременных модификаций поведения [6, 7] высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа [7, 8]
Таким образом, есть результаты, демонстрирующие, что в ряде важных процессов нервной системы, прежде всего пластичности, эффекты оксида азота синергичны с эффектами серотонина. Учитывая ведущую роль серотонина как медиатора в формировании ДС [7], цель данного исследования мы определили как изучение роли оксида азота и его метаболитов в процессе формирования долговременной сенситизации и эффектов их воздействия на внутриклеточные сигнальные системы нейрона при долговременной сенситизации у виноградной улитки.
Материал и методы
В данной работе все эксперименты проводились на одном из самых высокоразвитых представителей брюхоногих - наземном легочном моллюске рода ИеНх - ИеНх ¡ысотт, крымской популяции. В эксперименте использовали половозрелых особей, однородных по весу и размеру. Моллюсков содержали небольшими группами (по 15-25 особей) в стеклянных террариумах при комнатной температуре, высокой влажности и избытке пищи. В качестве пищи использовались морковь, листья лопуха и овсяные хлопья. Для
экспериментов выбирались здоровые на вид, подвижные животные примерно одного веса (2025 г). До эксперимента улитки не менее двух -трех недель находились в активном состоянии. На протяжении экспериментов разные группы (опытные и контрольные) содержались в одинаковых условиях.
Долговременную сенситизацию (ДС) оборонительного рефлекса вырабатывали по ранее отработанной схеме [7]. На животных воздействовали пакетом электрических импульсов в область головы 4 раза в день в течение 4-х дней с интервалом в 1,5-2 часа. Длительность каждого пакета составляла 0,5 с. Амплитуда прямоугольных импульсов тока в пакете составляла 6-8 мА, длительность - 10 мс, частота следования импульсов была 50 Гц. Реальная амплитуда тока при стимуляции контролировалась по экрану осциллографа. Критерием выработки ДС служило значительное увеличение времени закрытия пневмо-стома в ответ на предъявление тестирующего раздражения по сравнению с исходной реакцией. Только полное закрытие пневмостома определялось как положительная реакция на стимул.
Для того чтобы изучить влияние донора и блокатора оксида азота на формирование ДС у виноградной улитки, использовали растворы нитроглицерина (1% водный раствор отечественного производства) и L-NAME (L-NG-nitro Larginine methyl ester, Sigma, USA) в дозе 100 мг/кг веса животного, которые вводили шприцем во внутреннюю полость животного (в объеме жидкости 0,1 мл) в область синусного узла один раз в сутки в течение 4 дней за 30 минут до начала выработки ДС.
Результаты
Исследование действия экзогенного донора NO нитроглицерина на формирование долговременной сенситизации. Эксперименты показывают, что при предъявлении в течение 4-х дней электрических стимулов показатели оборонительного поведения (продолжительность закрытого состояния пневмостома в ответ на тестирующий стимул) у животных, инъецированных физиологическим раствором (n=15), достоверно (p<0,01) увеличились с 15,2±0,6 с до 61,7±2,8 с. Это показывает формирование у них долговременной сенситизации (рис.1А). Показатели оборонительного поведения контрольных (интакт-ных) животных (n=15) достоверно не изменились. Введение нитроглицерина за 30 минут до начала выработки ДС (n=15) привело к достоверному (р<0,01) увеличению реакции пневмостома с 19,3+0,8 до 44,1±1,4 с, но выраженность ДС уменьшилась (рис.1А).
Измерение электрических характеристик командных нейронов показало, что формирование ДС приводит к деполяризации мембран клеток. Потенциал покоя (Ут) у сенситизированных животных (р<0,01) смещается до -56,3±0,7 мВ (п=15) по сравнению с -59,8±0,7мВ у интактных улиток (п=19). При этом снижается (р<0,01) также величина порога генерации ПД (VI;) до 17,8±0,8 мВ по сравнению с 19,7±0,5 мВ у ин-такных улиток (рис.2). В группе животных, получавших инъекции донора оксида азота нитроглицерина за 30 минут до начала выработки ДС (п=9), значение Ут смещается до -55,7+1,2 мВ по сравнению с -59,8±0,7 мВ у интактных и с -56,3±0,7 мВ у сенситизированных улиток. Наблюдается также снижение VI до 16±1,2 мВ по сравнению с 19,7±0,5 мВ у интактных и с 17,8±0,8 мВ у сенситизированных улиток (рис.2). Измерение электрических характеристик командных нейронов показало, что отличия группы с введением нитроглицерина до начала формирования ДС от группы сенситизированных животных были недостоверными. Таким образом, введение донора оксида азота нитроглицерина за 30 минут до начала выработки ДС не препятствует формированию ДС, но в то же время снижает ее выраженность на поведенческом уровне.
Исследование действия блокатора N0-синтазы Ь^АЫЕ на формирование долговременной сенситизации
Далее были исследованы эффекты влияния блокатора КО-синтазы Ь-КЛМЕ на поведенческие реакции виноградных улиток при формировании ДС. В ходе эксперимента было получено, что при введении блокатора КО-синтазы Ь-КЛМЕ с последующей сенситизацией (п=15) показатели оборонительного поведения увеличились с 19,8+0,6 с до 40,8±1,8 с (рис.1В). В группе сенситизированных улиток продолжительность закрытого состояния пневмостома увеличилась с 15,2±0,6 до 61,7±2,8 с (рис.1В). Таким образом, в группе с введением Ь-КЛМЕ до начала формирования ДС выраженность ДС слабее, чем в группе сенситизированных животных.
Измерения электрических характеристик командных нейронов оборонительного поведения показало, что значение Ут у животных с выработкой сенситизации после инъекции блокатора КО-синтазы Ь-КЛМЕ (п=31) составило -58,1±0,7 мВ по сравнению с -59,8±0,7 мВ у интактных и с -56,3±0,7 мВ у сенситизированных улиток (рис.2). VI в группе улиток после инъекции Ь-КЛМЕ достоверно (р<0,05) снизился до 15,6±0,8 мВ по сравнению с 17,8±0,8 мВ в группе сенситизированных улиток и с 19,7+0,5 мВ в группе интактных улиток (рис.2). Таким обра-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
зом, предварительная инъекция блокатора NO-синтазы L-NAME не предотвращает формирова-
ния долговременной сенситизации.
в
с
S 30-
—■ - нитроглииерин+ ДС / Ï —L-N AM Е+ДС
-*-дс / Л 1 -*-ДС
- • контроль / * 40- —KOHipOJtb
Ч/ I
дни эксгнфимента
дни эксперимента
Рис.1. Динамика изменения реакции пневмостома при воздействии экзогенного донора NO нитроглицерина (А) и блокатора NO-синтазы L-NAME (В) на формирование долговременной сенситизации у виноградных улиток
Рис.2. Изменение мембранного потенциала покоя (Vm) и порога генерации потенциала действия (Vt) при воздействии экзогенного донора NO нитроглицерина и блокатора NO-синтазы L-NAME на формирование долговременной сенситизации
Обсуждение
Данные литературы свидетельствуют о том, что в мозгу улитки серотонин и оксид азота однонаправленно регулируют функцию серотони-нергической системы. Они не только возбуждают серотониновые нейроны, но и координируют их работу за счет активации общих синаптических видов, которые, по-видимому, тоже являются серотониновыми. Доноры N0, как и серотонин, блокируют привыкание на уровне элек-тровозбудимой мембраны и снижают пороги возбуждения нейронов [10]. Было выдвинуто предположение, что оксид азота тонически участвует в формировании фоновой активности се-ротониновых нейронов (блокирование синтеза N0 снижает уровень фоновой активности). N0 опосредует или усиливает возбуждающее действие серотонина на серотониновых нейронах (блокирование синтеза N0 уменьшает это действие серотонина). И, наконец, N0 участвует, по-видимому, в механизме синаптической передачи от общего пачечного входа или причастен к ге-
нерации эндогенной пачечной активности пре-синаптическим нейроном (блокирование синтеза NO включает синхронную пачечную активность и подавляет ее активацию серотонином, а добавление экзогенного оксида азота восстанавливает эту активность). Возможно, NO является вторичным посредником при возбуждающем действии серотонина [4].
Подобное предположение подтверждается экспериментами, показывающими, что блокирование NO-синтазы перед выработкой пищевого рефлекса сильно ухудшает обучение виноградной улитки. Улитки с выработанным условным рефлексом после ингибирования NOS остаются способными обнаружить пищу. Эти результаты указывают на то, что NO участвует в процессе приобретения памяти [11]. Кроме того, найдено, что донор NO вызывает у прудовика оборонительные реакции при ползании и аппликация доноров NO способствует торможению ВПСП в нейронах RPD1 and LP1 прудовика [12] и ведет к
торможению осцилляции в лобных долях моллюска Limax maximus [8, 13].
Нами было найдено, что предварительная инъекция как блокатора NO-синтазы L-NAME, так и донора NO нитроглицерина не предотвращает формирования ДС, но уменьшает выраженность долговременной сенситизации. Хроническое введение нитроглицерина не влияет на мембранный потенциал командных нейронов при долговременной сенситизации, а введение L-NAME снижает пороговый потенциал у сенситизированных улиток, что демонстрирует повышение возбудимости этих нейронов и коррелирует с усиленной реакцией пневмостома.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 06-04-48834).
1. Huang S., Kershbaum H.H., Engel E., Hermann A. Biochemical characterization and histochemikal localization of nitric oxide .synthase in the nervous system of the snail, Helixpomatia // J.Neurochem. 1998. V.69. P.2516-2528.
2. Zsombok A., Schrofner S., Hermann A., Kerschbaum H.H. Nitric oxide increases excitability by depressing a calcium activated potassium current in snail neurons // Neurosci. Lett. 2000. V.295. №3. P.85-88.
3. Kerschbaum H.H. NADPH-diaphorase activity and nitric oxide synthase activity in the kidney of clawed frog, Xenopus laevis // Cell Tissue Res. 2000. V.301, №3. P.405-411.
4. Дьяконова Т.Л. Взаимодействие серотонина и оксида азота (NO) в активации серотонинергиче-ской системы у виноградной улитки // Рос. физи-ол. журнал им.И.М.Сеченова. 2000. Т.86, №9. С.1210-1219.
5. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник // Соросовский образовательный журнал. 2000. T.6. №12.
6. Castellucci V.F., Frost W.N., Goelet P., Mon-tarollo P.G., Schacher S., Morgan J.A., Blumenfeld H., Kandel E.R. Cell and molecular analysis of long-term sensitization in Aplysia // J. Physiol. (Paris). 1986. V.81, №4. P.349-357.
7. Гайнутдинова Т.Х., Андрианов В.В., Назыро-ва P.P., Гайнутдинов Х.Л. Исследование длительности сохранения электрических характеристик командных нейронов при выработке долговременной сенситизации у виноградной улитки. // Журн. высш. нервн. деят. 1999. Т.49, №6. С.1063-1065.
8. Никитин В.П., Козырев С. А. Генерализованная и сигнал-специфическая долговременная ноцицеп-тивная сенситизация у виноградной улитки // Журн. высш. нервн. деят. 1995. Т.45, №4. С.732-741.
9. Cleary L.J., Lee W.L., and Byrne J.H. Cellular correlates of long-term sensitization in Aplysia // J. Neurosci. 1998. V.18. P.5988-5998.
10. Дьяконова Т.Л., В.П. Реутов Влияние нитрита на возбудимость нейронов мозга виноградной улитки // Рос. физиол. журнал им.И.М.Сеченова. 1998. Т.84, №11. С.1264-1272.
11. Teyke T. Nitric oxide, but not serotonin, is involved in acquisition of food-attraction conditioning in the snail Helix pomatia // Neurosci. Lett, 1996. V.206. P.29-32.
12. Kazakevich V.B. Nitric oxide coordinates feeding and defensive behavior of Lymnaea stagnalis // J. Neurophysiol. 2000. V.83. P.116-125.
13. Gelperin A., Flores J., Raccuia-Behling F., Cooke I.R. Nitric Oxide and Carbon Monoxide Modulate Oscillations of Olfactory Interneurons in a Terrestrial Mollusk // J. Neurophysiol. 2000. V.83. P.116-127.
EFFECTS OF NITRIC OXIDE ON ELABORATION OF SENSITIZATION IN HELIX POMATIA
L.N.Muranova, V.V.Andrianov, T.Kh.Gayjnutdinova, I.V.Zalkeeva, Kh.L.Gayjnutdinov
It was found that a preliminary injection of either NO-syntase inhibitor L-Name or the donor of nitroglycerine didn't prevent long-term sensitization but decreased it's intensity. Regular injection of nitroglycerine has no effect on membrane potential of multiple units during long term sensitization, and injection of L-Name decreases threshold potential which demonstrates the increase of neurons' excitability and correlates with the hyper-reaction of pneumostone.
