CC BY
27
1 л 1 1 1 ъ 1
Х.Л. Гайнутдинов ' , В.В. Андрианов ' , Т.Х. Богодвид ' , И.Б. Дерябина , Л.Н. Муранова1
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ОКСИДА АЗОТА В ВОССТАНОВЛЕНИИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ ПРИ РЕКОНСОЛИДАЦИИ У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ
1Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия Казанский физико-технический институт КазНЦ РАН, Казань, Россия
-5
Поволжская академия физической культуры, спорта и туризма, Казань, Россия
Проведено исследование эффектов воздействия блокаторов нейрональной и индуцибильной NO-синтаз на формирование обстановочного условного рефлекса (ОбУР) и процесс реконсолидации долговременной памяти после обучения. Показано, что применение блокатора биосинтеза белков анизомицина после сеанса напоминания обстановки приводит к реконсолидации долговременной памяти. Инъекция нитропруссида натрия не вызывала изменений выработки ОбУР относительно инъекции ФР, а неспецифический блокатор NO-синтаз L-NAME препятствовал обучению. Также нами было найдено, что L-NAME и 7-нитроиндазол значительно уменьшают реконсолидацию долговременной памяти после формирования ОбУР. В то же время, блокатор индуцибильной NO- синтазы аминогуанидин не влиял на процесс реконсолидации. Таким образом, в этих экспериментах нами было показано, что NO необходим как для обучения (выработка ОбУР), так и для сохранения долговременной памяти.
Ключевые слова: оксид азота, обучение, долговременная память, реконсолидация памяти, блокаторы NO-синтаз.
A study of the effects of blockers of neuronal and inducible NO-synthases in the formation of situational conditional reflex (SCR) and the process of reconsolidation of long-term memory after training was sent. It was shown that application of a blocker of protein biosynthesis of anisomycin after the session of reminder of the situation leads to reconsolidate of long-term memory. The nitroprusside sodium injection did not cause changes of generate of SCR relatively injections of saline solution and non-specific blocker of NO-synthases L-NAME let the training. Also we have found that L-NAME and 7-nitroindazole significantly reduce reconsolidate of long-term memory after the formation of SCR. At the same time, blocker of inducible NO-synthase aminoguanidine did not affect on the process of reconsolidation. Thus, in these experiments we have shown that NO is necessary for learning (generation SCR) and to preserve long-term memory.
Key words: nitric oxide, learning, long-term memory, reconsolidation of memory, inhibitors of NO-synthases
Оксид азота (NO) рассматривается в настоящее время как новая сигнальная молекула, играющая роль универсального регулятора многих физиологических процессов в организме [1]. Установлена роль NO как одного из возможных патогенетических факторов при нейрогенеративных заболеваниях ЦНС, ишемии, мозговом инсульте, эпилепсии. Не вызывает сомнения определяющая роль системы NO в функционировании сердечно-сосудистой системы - в патогенезе инфаркта миокарда, а также целого ряда других заболеваний, связанных прежде всего с сосудистыми нарушениями [1, 2]. Открытие способности клеток млекопитающих к синтезу свободного радикала оксида азота стимулировало огромные усилия исследователей к изучению роли NO во всех областях биологии и медицины [3]. NO-синтезирующие нейроны обнаружены в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков. Найдено, что NO участвует в поведенческих программах и причастен к активации синтеза цГМФ [1, 2]. Все
больше данных накапливается о том, что в нервной системе NO участвует в развитии, созревании и старении мозга, в процессах обучения и памяти [4, 5].
В рамках проблемы механизмов обучения и памяти всегда остается важным этап сохранения результатов обучения. Стадию долговременной памяти, которая является результатом обучения, хорошо можно тестировать через процесс реконсолидации памяти [5, 6]. Было показано, что может произойти амнезия памяти, если консолидированная и стабильная длительная память будет реактивирована перед амнестическим воздействием [6]. К настоящему времени сформировано следующее представление о механизмах обучения и памяти: есть долговременные процессы формирования памяти и они связаны с новым синтезом белком, а есть процессы более кратковременные и они связаны с ковалентной модификацией уже существующих белков в пре- и постсинаптических структурах. Подтверждение такой идеи представили С.Роуз и его сотрудники. Было показано, что односессионная задача пассивного оборонительного поведения при реконсолидации в противоположность первоначальной консолидации не нарушается колхицином, который блокирует аксональный транспорт. Видимо при напоминании запускается локальный синтез белка в синапсах. Поэтому представляется актуальной задачей исследование роли NO в формировании и реконсолидации долговременной памяти.
Материалы и методы. Для экспериментов в качестве объекта была выбрана виноградная улитка Helix lucorum. Процедура выработки обстановочного условного рефлекса (ОбУР) проводилась в стандартных условиях, когда раковина улитка жестко крепилась к штативу, а сама улитка свободно ползала по шару, плавающему в воде. До первого тестирования все улитки 2 дня приучались к экспериментальной обстановке. После тестирования начинали процедуру обучения, при этом улитки в течение 5 дней получали по 5 электрических раздражений в день (1-4 мА, 1с., 50Гц) через прикосновение двух макроэлектродов к дорзальной передней части ноги и к хвосту. Электрические раздражения разделяли по времени от тактильной тестовой стимуляции. Во время 2-х дневного периода отдыха после процедуры выработки рефлекса улиток кормили, затем тестировали оборонительное поведение животных. Для этого измеряли амплитуду втягивания омматофоров в ответ на тактильную стимуляцию передней части ноги [7]. Тестирование поведенческих реакций проводили: 1) на шаре (т.е., в стандартных условиях), 2) на плоской поверхности крышки террариума (т.е., в условиях, отличных от стандартных). На следующий день, после тестирования, подтверждающего выработку ОбУР, улиток помещали на 20 мин. на шар, что служило напоминанием ОбУР, а затем блокировали биосинтез белка инъекцией анизомицина (АН) в дозе 0,4 мг на улитку. Другой группе, для сравнения, после напоминания вводили такое же количество физиологического раствора (ФР). На следующий день вновь производили тестирование, по результатам которого судили о сохранении памяти на выработанный условный рефлекс. Все поведенческие эксперименты проводились с применением метода двойного слепого контроля. Для блокады биосинтеза белков применяли анизомицин (АН) фирмы "Sigma" в дозе по 0,4 мг на улитку, который был растворен в 0,2 мл ФР. NO постоянно продуцируют конститутивные изоформы NO-синтаз (NOS): эндотелиальная (eNOS), нейрональная (nNOS) и индуцибильная (iNOS). Поэтому были использованы блокаторы этих ферментов (соответственно): L-NAME в дозе 100 мг/кг веса; 7-нитроиндазол в концентрации 10-4 моль/л; аминогуанидин в концентрации 10-4 моль/л. Все препараты фирмы "Sigma".
При статистической обработке получали среднее значение измеряемой величины и стандартную ошибку среднего M ± SEM. Достоверность различий оценивали по t- критерию Стьюдента и U- критерию Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение. Во время предварительного тестирования не наблюдалось значительных отличий в амплитуде отдергивания омматофоров в ответ на тестовую тактильную стимуляцию во всех группах животных как на пластиковых шарах, так и на плоской поверхности (была использована статистика ANOVA). Результаты показывают, что во всех случаях ответы в контексте, в котором улитки подвергались электрическим стимулам, были значительно сильнее, чем те, которые были в нейтральном контексте (P<0.001, Манн -
Уитни). Было продемонстрировано достоверное возрастание оборонительных реакций, когда виноградная улитка находится на шаре (в 5-7 раз, p<0.001), в то же время число оборонительных реакций при тестировании на плоской поверхности достоверно не увеличивается. Этот результат демонстрирует выработку у улитки ОбУР. Эти результаты предполагают существование долговременных изменений в поведении (появление контекстуально зависимой памяти) после неслучайной сильной стимуляции, что может появиться только в том контексте, в котором появилась электрическая стимуляция. Эту процедуру называют выработкой обстановочного условного рефлекса [5, 7]. На следующий день после тестирования, подтверждающего выработку ОбУР, проводили сеанс «напоминания», который заключался в том, что улиток помещали на 20 мин. на шар (то есть, в обстановку, в которой проводилось обучение), что служило напоминанием ОбУР, а затем сразу блокировали биосинтез белка инъекцией АН, а контрольным улиткам вводился ФР. Повторное тестирование показало, что инъекция АН после первого тестирования приводила к полному забыванию ОбУР. Таким образом, проявления ОбУР могут быть заблокированы применением блокатора биосинтеза во время напоминания.
Большой интерес вызывают работы по изучению роли NO в обучении. Для этой цели нами изучались эффекты воздействия блокаторов нейрональной и индуцибильной NO-синтаз на формирование ОбУР и процесс реконсолидации долговременной памяти после обучения. Инъекция нитропруссида натрия не вызывала изменений выработки ОбУР относительно инъекции ФР, а неспецифический блокатор NO- синтаз L-NAME препятствовал обучению. Также нами было найдено, что L-NAME и 7-нитроиндазол значительно уменьшают реконсолидацию долговременной памяти после формирования ОбУР. В то же время, блокатор индуцибильной NO- синтазы аминогуанидин не влиял на процесс реконсолидации. Таким образом, в этих экспериментах нами было показано, что NO необходим, как для обучения (выработка ОбУР), так и для сохранения долговременной памяти. Причем речь идет только о работе нейрональной и эндотелиальной NO- синтаз.
Список литературы:
1. Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия - 1998. - Т. 63. - С. 924-938.
2. Реутов В.П., Охотин В.Е., Шуклин А.В. и др. Оксид азота и цикл в миокарде: молекулярные, биохимические и физиологические аспекты // Успехи физиол. наук. - 2007. - Т. 38. - № 4. - С. 39-58.
3. Vanin A.F., Huisman A., Van Faassen E.E. Iron dithiocarbamate as spin trap for nitric oxide detection: pitfalls and successes // Methods in Enzymology - 2003. - V. 359. - P. 27-42.
4. Katzoff A., Ben-Gedalya T., Hurwitz I. et al. Nitric oxide signals that aplysia have attempted to eat, a necessary component of memory formation after learning that food is inedible // J. Neurophysiol. - 2006. - V. 96. - P. 1247-1257.
5. Balaban P.M., Roshchin M.V., Timoshenko A.Kh. et al. Nitric oxide is necessary for labilization of a consolidated context memory during reconsolidation in terrestrial snails // Eur. J. Neurosci. - 2014. - V. 40. -P. 2963-2970.
6. Sara S.J. Retrieval and reconsolidation: toward a neurobiology of remembering // Learn. Mem. - 2000. - V. 7. - P. 73-84.
7. Gainutdinova T.H., Tagirova R.R., Ismailova A.I. et al. Reconsolidation of a context long-term memory in the terrestrial snail requires protein synthesis // Learn Mem. - 2005. - V. 12, - P. 620-625.
