CC BY
32
2012
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616. 127:599.325
В. В. Воробьева1, Н. К. Мазина2, П. Д. Шабанов1 ВЛИЯНИЕ ОБЩЕЙ ВИБРАЦИИ
НА ФУНКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ ПЕЧЕНИ КРОЛИКОВ
1 ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова», Санкт-Петербург;
2 ГОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия»
Среди техногенных производственных факторов одним из наиболее распространенных и значимых является вибрация, действующая как хронический стрессор, вызывающий напряжение адаптационно-компенсаторных систем организма и формирование вибрационной болезни [1]. На вибрационное воздействие откликаются практически все гомеостатические системы организма, их ответная реакция зависит от энергии колебания [2]. Действие вибрации на биологические структуры приводит к нарушению структурной организации тканей, что можно уловить определением значимых тканевых биомаркеров [3, 4]. При этом максимально негативным эффектом обладает частота вибрации, резонансная к частоте данной ткани или органа, так как материальной основой резонанса в биологических объектах являются масса и ее упругие свойства. Диапазон резонансных частот для тканей и органов теплокровных животных и человека находится в диапазоне от 1 до 200 Гц [5].
Вибрация порождает гидродинамические силы, вызывающие колебания центрального и периферического внутрисосудистого давления и изменяющие кровенаполнение паренхиматозных органов, периферический крово- и лимфоотток, значительные изменения ультраструктуры клеток мышечного слоя артерий, деградацию регуляции их тонуса. Генерализованная эндотелиальная дисфункция, усугубляемая активизацией прооксидантной системы [6], ведет к микро- и макроангиопатиям, нарушению гемодинамики и микроциркуляции и завершается формированием синдрома регенераторно-пластической недостаточности (висцеропатии) на уровне паренхиматозных органов. Выраженность этих изменений может доходить до степени деструктуризации и паранекроза [7-9].
Несмотря на многочисленные данные о патогенезе вибрационной болезни, роль нарушения тканевой биоэнергетики в развитии вибрационно-обусловленных висце-ропатий и патологии печени, в том числе, остаются изученными не достаточно, что снижает эффективность профилактических и лечебных мероприятий. Поэтому целью
© В. В. Воробьева, Н. К. Мазина, П. Д. Шабанов, 2012
исследования явилось изучение влияния общей вибрации на функции дыхательной цепи печени кролика.
Материал и методы исследования. Эксперименты проводили на 80 кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5-3 кг в возрасте 3-4 месяца с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Действие общей вертикальной вибрации с амплитудой 0,5 мм осуществляли с помощью промышленной установки УВ 70/200 (производства машиностроительного объединения «Маяк», г. Киров). Ежедневные сеансы по 60 мин с частотой 8 и 44 Гц проводили в течение 7, 21, 56 дней (без выходных) в утренние часы с 9.00 до 11.00 в осенне-зимний период.
Получение нативных митохондрий печени осуществляли согласно методическим рекомендациям, разработанным М. Н. Кондрашовой [10]. Для имитации состава внутриклеточной среды использовали апробированные в других исследованиях [11] сложные солевые растворы (таблица). Для приготовления растворов применяли следующие реактивы: сахароза, КН2РО4, MgSO4, KCl (Реахим, Россия); трис-HCl, ЭДТА (Serva, Германия); субстраты окисления: натриевую соль янтарной кислоты (ЯК), смесь натриевых солей глутаминовой и яблочной кислоты (Глу+Мал), разобщитель 2,4-ди-нитрофенол (ДНФ) (Sigma, США); ингибиторы дыхательной цепи: амитал натрия (Serva, Германия) и малонат (Реахим, Россия). Все растворы готовили ех tempore на бидистиллированной воде.
Таблица. Рабочие концентрации компонентов среды выделения и инкубации, используемых для изучения ответных реакций нативных митохондрий ткани печени кролика
Компоненты рабочего раствора Концентрации компонентов, ммоль
Среда выделения Среда инкубации
Сахароза 250 0
Трис-HCl, рН 7,2 10 10
КН2РО4 0 20
HgSO4 0 10
КС1 0 150
Изучение функциональной активности нативных митохондрий печени кроликов проводили полярографическим методом в ячейке объемом 1 мл при 37°С в среде инкубации, уравновешенной с кислородом воздуха [12]. Скорость дыхания митохондрий (V) в зависимости от добавок в ячейку выражали в [нг-атом О мин-1 мг-1 белка]. Метаболические состояния митохондрий «покоя» и «активности» моделировали in vitro при варьировании экзогенных энергетических субстратов (до и после введения в ячейку 2,4-динитрофенола) [11, 13].
Вклад в эндогенную дыхательную активность (V3) митохондрий печени НАДи ФАД-зависимых субстратов (НАД-ЗС и ФАД-ЗС) оценивали по данным ингибитор-ного анализа [12] с амиталом (ам.) или малонатом (мал.), вводимым в ячейку на фоне эндогенного дыхания до концентрации 2 ммоль. Чувствительность V3 к ингибиторам вычисляли по формуле
«Инг.ч.» = (1 - VHHr/V3H,) • 100%,
где «инг. ч.» — чувствительность эндогенного дыхания к малонату (мал.ч.) или амиталу (ам. ч.); Vrai. (V3M или Vмал) — скорость окисления эндогенных энергетических субстратов в присутствии соответствующего ингибитора в ячейке. При концентрации ингибиторов 2 ммоль препараты, полученные от животных, подвергнутых разным воздействиям, дифференцировались наиболее рельефно, что позволяло в нашем исследовании оценить динамику соотношения ФАД- и НАД-зависимых фракций дыхательной цепи в митохондриях печени в зависимости от режимов вибрации. Коэффициент приращения (КП) малонатчувствительного дыхания вычисляли по формуле
КПмал.ч. = [ФАД/НАД]э = мал. ч/ам. ч. дыхания.
В качестве экзогенных субстратов использовали ФАД-зависимый субстрат — янтарную кислоту (Vjjk), 1 ммоль, или смесь НАД-зависимых субстратов — глутаминовой и яблочной кислот (Глу+мал) по 3 ммоля ^глу+мал). Введением в ячейку разобщителя 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) до 20 мкмоль имитировали состояние АТФ-азной активности митохондрий.
Отклик митохондрий на неблагоприятный фактор in vivo оценивали по совокупности кинетических (V) и расчетных параметров: Vm и ^лу+мал — скорости окисления экзогенного сукцината и смеси глутамата и малата в состоянии «покоя», и Vmy+мал^ — скорости окисления субстратов в «активном» состоянии митохондрий в условиях АТФ-азной нагрузки, моделируемой с помощью разобщителя 2,4-ДНФ. Ре-гуляторные параметры количественно характеризовали переход митохондрий в разные состояния (от эндогенного в состояние «покоя»; от «покоя» в «активное» состояние).
Рассчитывали коэффициенты стимуляции (КС):
КСяк = Vяк /V3 ; КСглу+мал = Vглy+мал /Vs; КРяк = Vяк-р /Vяк ; КРглу+мал = Vглy+мал-р /Vглy+мал,
где КС — стимуляция эндогенного дыхания экзогенным субстратом Vяк и Vглy+мал скорость дыхания митохондрий после добавления экзогенного субстрата (янтарной кислоты или Глу+Мал); КР — стимуляция субстратного дыхания 2,4-ДНФ; — скорость окисления экзогенной янтарной кислоты после добавления 2,4-ДНФ; V^m^ — скорость окисления экзогенных глутамата и малата после добавления 2,4-ДНФ. Коэффициенты КС и КР выражали в условных единицах.
Концентрацию белка в гомогенате ткани печени измеряли модифицированным микробиуретовым экспресс-методом [14], который обладает высокой специфичностью, чувствительностью, не зависит от аминокислотного состава белка и характеризуется линейной связью между концентрацией белка и интенсивностью окраски проб в широком диапазоне концентраций.
Повреждающее действие общей вибрации на печень подтверждали гистологически. Обработку гистологического материала осуществляли в ходе стандартной гистологической спиртопарафиновой проводки. Окрашивание препаратов производили гематоксилином и эозином. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ STATISTICA for Windows 6.0. Значимость межгрупповых различий оценивали по параметрическому (t-критерий Стьюдента) или непараметрическому (U-тест Вилкоксона—Манна—Уитни) критериям в зависимости от типа распределения.
Результаты и их обсуждение. Известно, что скорость эндогенного дыхания го-могената ткани представляет собой интегративный параметр, свидетельствующий об оснащенности ДЦ эндогенными метаболитами, накопленными в процессе ее функционирования [12] и откликается на воздействие внешних факторов, направленных на целостный организм. В нашем исследовании динамика показателя эндогенного дыхания зависела от режимов (частоты и длительности) вибрационного воздействия (рис. 1).
Рис. 1. Изменение скорости эндогенного дыхания нативных митохондрий печени кролика (нг-атом О мин-1 мг-1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7, 21, 56 сеансов относительно показателей группы интактного контроля (ИК):
звездочкой обозначены статистически значимые различия между группами интакт-ных и подвергнутых вибрации животных: * — р < 0,05.
Эндогенное дыхание ткани обеспечивается преимущественно потоком электронов через наиболее продуктивные I (НАД-зависимый) и II (ФАД-зависимый) фермент-субстратные комплексы, вклад которых в активность митохондрий оценивается посредством ингибиторного анализа [12]. Амитал ингибирует поток электронов в дыхательной цепи от НАД-зависимых субстратов, поэтому чувствительность дыхания тканевого препарата (гомогената) к этому ингибитору (% ам. чувст.) пропорциональна активности этого участка и вкладу эндогенных субстратов, окисляющихся по данному пути [13]. Чем выше чувствительность дыхания к амиталу, тем выше вклад НАД-зависимого звена дыхательной цепи в эндогенное дыхание. Малонат — абсолютный специфический ингибитор сукцинатдегидрогеназы (СДГ) — фермента, окисляющего янтарную кислоту на участке ФАД-зависимого звена дыхательной цепи. При добавлении малоната отсекается та часть эндогенного дыхания, которая определяется вкладом янтарной кислоты [15].
Ингибиторный анализ показал, что коэффициент приращения мал. ч. (КПмал.ч.) на фоне воздействия вибрации 8 Гц (рис. 2а) достоверно не отличался от показателей контрольных животных, свидетельствуя о достаточной сохранности активности НАД-зависимого звена дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов.
а
б
2,5
2,51
0,5
0,5
0
7
21
56
0
7
21 56
—- контроль —■— КП мал.ч.
Рис. 2. Динамика соотношения парциальных реакций скорости эндогенного дыхания митохондрий печени кролика по данным ингибиторного анализа при вибрации 8 Гц (а) и 44 Гц (б):
звездочками обозначены статистически значимые различия между группами контрольных животных и подвергнутых вибрации: ** — р < 0,01.
Через 7 сеансов вибрации 44 Гц (рис. 2б) КПмал. ч. увеличивался на 60% (р < 0,01) по отношению к показателям интактной группы, свидетельствуя о накоплении эндогенной янтарной кислоты и увеличении ее вклада в процессы окисления в ткани печени. После 56 сеансов вибрации 44 Гц данный показатель становился на 40% (р < 0,01) ниже уровня контроля, отражая процессы повреждения в ФАД-зависимом звене дыхательной цепи, начало низкоэнергетического сдвига на уровне дыхательной цепи митохондрий и истощение механизмов адаптивных перестроек, реализуемых, прежде всего, через изменение метаболизма янтарной кислоты [15, 16].
Субстратное дыхание Vглу+мал, Vяк отражает способность соответствующего звена дыхательной цепи окислять определенный энергетический субстрат (НАД- или ФАД-зависимый) и использовать его в качестве донора протонов и электронов для синтеза АТФ. Окисление экзогенных НАД-зависимых субстратов угнетаются как при низко-, так и при высокочастотной вибрации (рис. 3а). Скорость окисления экзогенной янтарной кислоты возрастает на 44% (р < 0,05) после 21 сеанса вибрации 44 Гц. Однако более продолжительная (56 сеансов) высокочастотная вибрация вызывает угнетающий эффект на данный кинетический параметр (рис. 3б).
Известно, что добавление экзогенного субстрата к тканевому препарату в состоянии эндогенного дыхания оказывает активизирующее воздействие, если дыхательная цепь работает в оптимальном режиме. Количественной мерой «энергизации» является коэффициент стимуляции дыхания (КСглу+мал, КСяк). Подобно этому стимуляция субстратного дыхания разобщителем окислительного фосфорилирования протонофором 2,4-динитрофенолом (ДНФ) косвенно отражает уровень сопряженности окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи и эффективность ее работы (КРглу+мал, КРяк).
30 25
'х
I 20
О £
г 15
т ^
го
г
^ ю >
5
0
Рис. 3. Влияние частоты и длительности вибрации на окисление НАД-зависимых (а) и ФАД-зависимых (б) субстратов (нг-атом О мин-1 мг-1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7, 21, 56 сеансов относительно показателей группы контроля (К):
звездочкой обозначены статистически значимые различия между группами контрольных и подвергнутых вибрации животных: * — р < 0,05.
Динамика стимуляции дыхания и его эффективности в системе окисления янтра-ной кислоты (рис. 4 б,г) более выражена, чем в системе окисления глутамата и малата через I фермент-субстратный комплекс (рис. 4 а,в). Вибрация с частотой 44 Гц (56 сеансов) повышает эффективность окисления экзогенной янтарной кислоты в большей мере, чем окисление экзогенного глутамата и малата. Таким образом, характер ответа со стороны кинетических параметров тканевого дыхания гомогената печени свидетельствует о разнонаправленности перестроек в системе окисления митохондриаль-ных субстратов. Более выраженные адаптивные перестройки наблюдаются в системе окисления янтарной кислоты.
Таким образом, дыхательная цепь откликается на изменение режима вибрационного воздействия фазными перестройками окислительного метаболизма, о чем свидетельствуют скорости окисления эндогенных и экзогенных энергетических субстратов, соотношения стимуляции и сопряженности окисления в НАД- и ФАД-зависимых фракциях дыхательной цепи; переключение тканевого дыхания на преимущественное использование янтарной кислоты.
Снижение стимуляции дыхания и уровня сопряженности окисления и фосфо-рилирования на глутамате и малате по мере усугубления вибрационного воздействия (увеличение частоты и длительности) указывают на развитие низкоэнергетического сдвига на уровне НАД-зависимого звена дыхательной цепи. Напротив, в ФАД-зависимом звене происходит повышение энергизации (возрастает стимуляция дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования на экзогенной янтарной кислоте, чувствительность эндогенного дыхания к малонату). Совокупность призна-
ков свидетельствует о развитии I фазы биоэнергетической гипоксии [17], аналогично тому, что было доказано в эксперименте для других органов (сердце) [11, 16].
Рис. 4. Влияние частоты и длительности вибрации на коэффициент стимуляции (КС в усл. ед) НАД-зависимого (а) и ФАД-зависимого (б) и коэффициент регуляции (КР в усл. ед) НАД-зависимого (в) и ФАД-зависимого звена (г) дыхательной цепи митохондрий печени:
звездочками обозначены статистически значимые различия между группами контрольных и подвергнутых вибрации животных: * — р < 0,05, ** — р < 0,01.
Архитектоника ткани печени также изменялась под воздействием вибрации, подобно другим тканям [18]. Морфогистологически гепатоциты интактных кроликов были кубической формы, хорошо прокрашивались. Цитоплазма имела равномерную эозинофильную окраску, ядра — базофильную. Клетки собирались в печеночные балки, радиально располагающиеся от портального тракта к центральной вене. Ба-лочность строения гепатоцитов в перицентральной области имела сотовое строение. Синусоиды были расширены, в просвете хорошо просматривались эритроциты, портальные тракты также были широкими. При низкочастотной (8 Гц) вибрации морфо-гистологические перестройки в печени были минимальными, значительных различий между препаратами в зависимости от длительности вибрации не определялось.
В условиях высокочастотной вибрации выраженность патологических изменений гепатоцитов зависела от количества сеансов, что свидетельствовало о суммации повреждающих эффектов. Через 7 сеансов вибрации 44 Гц синусоидная структура с балочным строением дольки сохранялась, но часть гепатоцитов уплощалась, часть набухала с явлениями вакуолизации. Процесс усиливался по направлению к перипорталь-ной зоне. Интенсивность окраски клеток ослабевала и приобретала мелкозернистый характер. Ядра набухали, умеренно нарастали признаки гипертрофии клеток. Через 21 сеанс наблюдалось полное нарушение синусоидной структуры по направлению к перипортальной зоне, деструкции печеночных балок, спадание синусоидов, развитие очагов некроза. Эозинофильность цитоплазмы клеток значительно сокращалась, у большинства клеток она становилась прозрачной с мелкой и редкой зернистостью и признаками вакуолизации. Процесс носил более выраженный характер в перицен-тральных отделах. В перипортальных зонах тинкториальные свойства цитоплазмы гепатоцитов (эозинофилия) частично сохранялись. Усиливалась гетерогенность гепа-тоцитов по форме и размерам: большинство клеток были набухшими с пикнотичными ядрами, встречались пустотелые гепатоциты. Через 56 сеансов отмечали тенденцию к изменению морфологической характеристики печени по компенсаторному типу, что соответствует литературным данным [8]. Интенсивность окрашивания увеличивалась, повышалась зернистость цитоплазмы и базофильность окраски ядер. Увеличивалось количество двухядерных гепатоцитов. На отдельных участках ткани появлялись признаки балочного строения и просветы синусоидов. Гетерогенность гепатоцитов по форме и размерам нарастала в перипортальном отделе. Отмечалось полнокровие портальной вены и набухание артерий.
В целом под влиянием вибрации с частотой 44 Гц морфогистологическая характеристика печени изменялась в направлении развития персистирующего гепатита в две фазы: с усилением патологического процесса в период с 7 по 21 сеанс и появлением признаков компенсации с частичным восстановлением балочной структуры долек — к 56 сеансу. Морфогистологические изменения, обусловленные усилением режимов общей вибрации, подтвердили ее дизрегулирующий и даже повреждающий характер [19, 20] и соотносятся с изменениями биоэнергетических показателей ткани.
Таким образом, при действии вибрации в ткани печени экспериментальных животных происходят процессы перестройки биоэнергетики, вероятно, запускаемые гипоксией [21, 22], нарушающие микроциркуляторное русло и ведущие к нарастанию дистрофии ткани. В ходе тканевой адаптации энергетические резервы истощаются, развивается I фаза биоэнергетической гипоксии, сопровождающаяся специфическими изменениями функций дыхательной цепи в сторону активизации ФАД-зависимого
звена, ответственного за окисление янтарной кислоты. Вероятно, именно данный участок дыхательной цепи при вибрационном воздействии необходимо использовать в качестве мишени для фармакологической коррекции развивающихся в организме повреждений при неблагоприятном вибрационном воздействии.
Литература
1. Измеров Н. Ф. Роль профпатологии в системе медицины труда // Мед. труда и пром. экология. 2008. № 11. С. 1-11.
2. Ando H. Frequency dependence of hand-arm vibration on palmar sweating response / H. Ando, R. Noguchi, T. Ishitake // Scand. J. Work Environ. Health. 2002. Vol. 28, N 5. P. 324-327.
3. Кирьяков В. А., Павловская Н. А., Сухова А. В. Критерии выбора информативных лабораторных биомаркеров в медицине труда (аналитический обзор литературы) // Мед. труда и пром. экология. 2010. № 12. С. 22-27.
4. Saxton J. M. A review of current literature on physiological tests and soft tissue biomarkers applicable to work-related upper limb disorders // Occup. Med. 2000. Vol. 50, N 2. P. 121-130.
5. Ishitake T. Hemodynamic changes in skin microcirculation induced by vibration stress in the conscious // Kurume Med. J. 1990. Vol. 37. P. 235-245.
6. Смирнова Е.Л., Потеряева Е.Л., Никифорова Н. Г. Индивидуальные особенности пере-кисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у лиц с вибрационной болезнью в по-слеконтактном периоде // Мед. труда и пром. экология. 2010. № 8. С. 36-40.
7. Сухаревская Т. М., Ефремов А. В., Непомнящих Г. И. и др. Микроангио- и висцеропатии при вибрационной болезни. Новосибирск, 2000. 238 с.
8. Рахимов Я. А., Сапин М.Р., Белкин В. Ш., Этинген Л. Е. Морфология внутренних органов при действии вибрации. Душанбе: Высшая школа, 1979. 264 с.
9. Зуева М. А., Шпагина Л. А., Герасименко О. Н. и др. Гемодинамические и микроциркуля-торные механизмы формирования поражения печени при вибрационной болезни // Мед. труда и пром. экология. 2010. № 8. С. 14-19.
10. Захарченко М. В., Хундерякова Н. В., Кондрашова М. Н. Важность сохранения биофизической организации выделенных митохондрий для выявления физиологической регуляции их функции // Биофизика. 2011. Т. 56, № 5. С. 840-847.
11. Воробьева В. В., Шабанов П. Д. Вибрационная модель гипоксического типа клеточного метаболизма, оцененная на кардиомиоцитах кролика // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2009. Т. 147, № 6. С. 712-715.
12. Кондрашова М. Н. Аппаратура и порядок работы при полярографическом измерении дыхания митохондрий // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / под ред. М. Н. Кондрашовой. М.: Наука, 1973. С. 50-59.
13. Никольс Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. М.: Мир, 1985. 152 с.
14. Goa J. A micro biuret method for protein determination. Determination of total protein in cerebrospinal fluid // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1953. Vol. 5. P. 218-222.
15. Маевский Е. И., Гришина Е. В., Розенфельд А. С. и др. Анаэробное образование сукцината и облегчение его окисления — возможные механизмы адаптации клетки к кислородному голоданию // Биофизика. 2000. Т. 45, № 3. С. 509-513.
16. Воробьева В. В., Шабанов П. Д. Функциональная активность системы энергопродукции миокарда кролика при воздействии общей вибрации // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2009. Т. 95, № 1. С. 19-26.
17. Лукьянова Л.Д. Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. М.: Медицина, 2004. 520 с.
18. Воробьева В. В., Шабанов П. Д. Морфофункциональные изменения миокарда кролика при воздействии общей вибрации и после фармакологической защиты янтарной кислотой // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 11. 2010. Вып. 3. С. 201-207.
19. Matoba T. Pathophysiology and clinical pucture of hand-arm vibration syndrome in Japanes workers // Nagoya J. Med. Sci. 1994. Vol. 57. P. 19-26.
20. Griffin M. J., Bovenzi М. Dose-responte patterns for vibration-induced white figner // Occup. Environ. Med. 2003. Vol. 60, N 1. Р. 16-26.
21. Stroka D. M., Burkhardt T., Desballerts I. HIF-1 is expressed in normoxia tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia // FASEB J. 2001. Vol. 15. P. 2445-2453.
22. Semenza G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1: mechanisms and consequences // Bio-chem. Pharmacol. 2000. Vol. 59. Р. 47-53.
Статья поступила в редакцию 2 июля 2012 г.
