CC BY
60
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 613.632.2:691.276]:612.6.05
Ингель Ф.И.1, Пылев Л.Н.2, ЮрцеваН.А.1, Кривцова Е.К.1, Смирнова О.В.2, ГолубеваН.М.3
ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ ХРИЗОТИЛА ХЛОРИДОМ ЖЕЛЕЗА (III) НА ЭФФЕКТ
нестабильности генома в культивированных лимфоцитах крови человека
[ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава РФ, 119992 Москва, РФ; 2ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, 115478, Москва, РФ; 3ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, РФ
Все виды асбеста являются канцерогенами для человека, что вызвало запрет его использования в странах Европы, Америки и др. Однако уникальность физико-химических свойств асбеста и множество возможностей для применения в разных областях промышленности и хозяйственной деятельности человека требуют создания новых технологий для снижения его биоагрессивности.
Анализ эффектов нестабильности генома в лимфоцитах крови человека в большом диапазоне доз (микроядерный тест с цитохалазином В продемонстрировал снижение основных показателей нестабильности генома (частота делящихся клеток с цитогенетическими повреждениями, асимметрия распределения генетического материала в митозе, пролиферативная активность) при инкубации клеток с асбестом, модифицированным хлоридом железа, по сравнению с исходным образцом. Эти данные согласуются с результатами анализа интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов крови человека при экспозиции изученными образцами.
На основании полученных данных сделаны некоторые практические рекомендации к протоколу цитогенетического анализа нестабильности генома людей, контактирующих с асбестом.
Ключевые слова: асбест; асбест, обработанный хлоридом железа (III); культура крови человека; микроядерный тест с цитохалазином В; нестабильность генома.
IngelF.I.1, Pylev L.N.2, Yurtseva N.A.1, Krivtsova E.K.1, Smirnova O.V.2, Golubeva N.M.3 — THE EFFECT OF TREATMENT OF CHRYSOTILE WITH CHLORIDE IRON (III) ON THE EFFECT OF GENOMIC INSTABILITY IN CULTURED HUMAN LYMPHOCYTES
1A.N. Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Hygiene, 119992, Moscow, Russian Federation; 2 Institute of Carcinogenesis, N.N.Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, 115478, Moscow, Russian Federation; 3Institute of Immunology, FMBA, 115478, Moscow, Russian Federation
All forms of asbestos are carcinogenic to humans, that caused the prohibition of its use in Europe, America, etc. However, the unique physical and chemical properties of asbestos and many opportunities for its applications in various industries and human activities require the creation of new technologies to
Analysis of genomic instability in human lymphocytes in a large range of doses (micronucleus test with cytochalasin B showed a decline of core indicators of genome instability (frequency of dividing cells with cytogenetic damage, asymmetry in the distribution of the genetic material in mitosis, proliferative activity) incubation of cells with asbestos modified chloride iron, as compared to the initial sample. These data are consistent with the results of analysis of the intensity of neutrophil chemiluminescence of luminol by exposure of human blood samples studied.
Based on the findings made some practical recommendations to the protocol cytogenetic analysis of genomic instability of people exposed to asbestos.
Key words: asbestos; asbestos, treated with ferric chloride (III); culture of human blood; micronucleus test with cytochalasin B , genomic instability.
Канцерогенность асбеста для человека доказана [1, 2], однако большинство исследователей отмечают недостаточность современного понимания механизмов индукции канцерогенных эффектов различными его видами [2-4], что требует продолжения работ в этом направлении.
Одним из механизмов действия асбеста на клетки-мишени in vivo и in vitro, включая канцерогенез, считается образование активных радикалов (АР) на поверхности волокна в местах расположения заряженных активных центров, причем установлено, что интенсивность процесса образования АР прямо коррелирует с содержанием железа в образцах природного асбеста [3-6]. Следует отметить, что АР, основным механизмом образования которых на асбестовом волокне считается реакция Фентона (при этом ионы железа выступают в качестве катализатора), не только принимают участие в перекисном окислении липидов, но и вызывают повреждения ДНК. Доказано, что в последнем случае активизируется синтез белка р53, ответствен-
Для корреспонденции: Ингель Фаина Исааковна, [email protected]
ного за запрограммированную гибель клеток - апоптоз [3-5].
По разным, в том числе и собственным, данным, в процессе асбестового канцерогенеза повышается уровень нестабильности генома1, что ведет к трансформации клеток-мишеней и возникновению опухолей [7-9]. Однако обогащение хризотила железом путем обработки волокна хлоридом железа (III) не только не приводит к увеличению нестабильности генома, но и снижает как ее уровень, так и канцерогенные эффекты асбеста [8]. Этот феномен требует специального изучения.
Поэтому задачей данной работы является анализ влияния асбеста, модифицированного хлоридом железа (III) (АFeIII), на процессы, связанные с развитием эффектов нестабильности генома. Для ее решения мы провели сравнительный цитогенетический анализ эффектов нестабильности генома,
Под нестабильностью генома принято понимать совокупность механизмов и их эффектов, реализующихся при трансформации стабильного генома нормальной клетки в нестабильный, характерный для клеток опухоли [10].
87
[гиена и санитария 2/2014
индуцированных природным хризотилом и AFe111 на культуре лимфоцитов периферической крови (лПК) человека.
Материалы и методы
Образец хризотила из Баженовского месторождения марки мка 1-50 измельчали в агатовой ступке, 30 мин прогревали при 320 оС и делили на две равные части [8]. Одну часть пробы оставляли без дальнейшей обработки, а другую 30 мин кипятили в насыщенном растворе хлорида железа (III). После охлаждения суспензию фильтровали, осадок многократно промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и растирали в ступке до получения однородного порошка А^е111.
Дисперсность образцов определяли на растровом электронном микроскопе Quanta 200 3D DualBeam ("FEI Company", США).
Для постановки культуры использовали гепаринизированную цельную венозную кровь молодого практически здорового некурящего донора-мужчины.
Клетки стимулировали к делению фитогемагглютинином (ФГА) и культивировали в соответствии с международным протоколом микроядерного теста в среде F10 с 15% инактивированной сывороткой крупного рогатого скота [11-13]. Асбест и AFe111 в дозах 0,005; 0,01; 0,02; 0,1; 0,5; 1,0 и 2,0 мг/мл суспендировали в среде F10 и вводили в культуру на 24-м часу. В качестве позитивного контроля использовали индуктор свободных радикалов антибиотик блеомицин, который вводили в культуру также на 24-м часу от начала культивирования в дозе 12,5 мкг/мл культуральной среды.
На 44-м часу во все культуры вводили цитохалазин В до конечной концентрации 6 мкг/мл, а на 72-м часу клетки фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты. Препараты окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. В работе использовали реактивы фирмы "ПанЭко", РФ.
Эксперимент проводили в 3 повторностях.
Окрашенные препараты шифровали и просматривали под микроскопом в проходящем свете при увеличении 10 х 100 (масляная иммерсия). Цитогенетический анализ проводили 3 исследователя, поэтому препараты были зашифрованы таким образом, чтобы каждый исследователь просматривал все стекла одной повторности.
Для цитогенетического анализа использовали расширенный протокол, для чего на каждом стекле анализирова-
ли 1000 двуядерных клеток, раздельно учитывая клетки с микроядрами (МЯ) и нуклеоплазменными мостами (НПМ). Дополнительно на каждом стекле анализировали 500 клеток, раздельно учитывая клетки с 1, 2, 3, 4 и более ядрами, клетки с МЯ и НПМ в них, а также количество клеток в состоянии митоза и апоптоза [14, 15]. По результатам анализа дополнительно рассчитывали частоту ускоренно делящихся клеток (% клеток с числом ядер более 2) в пролиферативном пуле, степень симметрии распределения генетического материала между дочерними ядрами для клеток, прошедших два митоза (по соотношению частот 3-ядерных и 4-ядерных клеток в спектре клеточных популяций) и общую частоту делящихся клеток с повреждениями (МЯ и НПМ). Кроме того, определяли индекс репликации ДНК и индекс пролиферации, характеризующий среднюю скорость деления клеток в культуре [16, 17].
Способность к индукции свободных радикалов кислорода хризотилом и AFe111 (в дозе 2 мг/мл) определяли в отдельных экспериментах на нейтрофилах крови человека по методике, разработанной в Институте иммунологии РАМН, по интенсивности хемилюминесценции [18]. Это исследование проводили на хемолюминометре LKB-125 (Швеция) с использованием люминола ("Sigma", США); в качестве положительного контроля использовали зимозан.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Манна-Уитни и регрессионного анализа в стандартном пакете компьютерных программ Statistica 6.1.
Результаты и обсуждение
Эффекты пролиферации. С увеличением дозы воздействия индекс репликации клеток в культуре снижался как под действием асбеста, так и в присутствии AFeIII, причем статистически дозовые кривые для этих веществ между собой не различались. Однако асбест во всем диапазоне доз ниже 1 мг/мл не оказывал влияния на спектр клеточных популяций, характеризующий скорость пролиферации клеток в культуре (рис. 1), а более высокие дозы тормозили пролиферацию клеток, на что указывает повышение частоты неделящихся (1-ядерных) клеток и клеток, прошедших 2 и более митотических цикла в спектре клеточных популяций. В то же время в присутствии AFeIII выраженное дозозависимое торможение пролиферации, определенное по тем же показателям, наблюдалось уже начиная с дозы 0,01 мг/мл (см. рис. 1). Следует
10-
О ю о о о о о о ю о о о о о о
о см о о о о о см о о о о
о о о см о о о о о LO о о
о о о о о см о о о о о см
Хризотил AFe III
Концентрация волокон в культуре, мг/мл 2 и более митозов Ц 1 митоз О Не делятся
б
°/ 100- 90- 80- 70- 60- 50- 40- 30- 20- 10- о )
о 0,005 0,010 >< 0,020 | 0,100 1 0,200 1,000 2,000 0,005 0,010 ^ 0,020 > _ S о,юо = 0,500 1,000 2,000
Концентрация волокон в культуре, мг/мл @ Делятся О Не делятся
Рис. 1. Пролиферативная активность клеток в культуре ЛПК человека при экспозиции хризотилом (а) и AFeIП (б). По оси ординат - доля данного типа клеток в спектре клеточных популяций.
88
Асбест AFe III
Концентрация волокон в культуре, мг/мл Концентрация волокон в культуре, мг/мл
Рис. 2. Частота генетических повреждений в делящихся ЛПК человека, культивированных в условиях цитокинетического блока.
отметить, что и митотическая активность клеток в присутствии АFeIII была ниже, чем в культурах, экспонированных асбестом (р=0,017). В совокупности обнаруженные эффекты свидетельствуют об увеличении продолжительности клеточного цикла в присутствии АРе111 по сравнению с действием хризотила.
Важно понимать, что увеличение продолжительности клеточного цикла считается не только одним из признаков мутагенного действия, но и, главным образом, индикатором активизации процессов репарации ДНК, индуцированных изучаемым фактором [19, 20]. С учетом этих представлений полученные данные позволяют предположить, либо асбест не проявил генотоксической активности, за исключением двух максимальных доз, либо образование генетических повреждений, которые он индуцировал, не связано с индукцией репарации ДНК. И наоборот, торможение пролиферации клеток, экспонированных АРе111, вероятнее всего, может свидетельствовать об индукции репаративной активности и, следовательно, о возможности снижения генотоксических эффектов.
Анализ генотоксических эффектов. Частота делящихся клеток, несущих генетические повреждения, в присутствии асбеста не менялась во всем диапазоне изученных доз, а в культурах, экспонированных АFeIII, наблюдалась обратная
Рис. 3. Соотношение частот поврежденных клеток, прошедших один (2-ядерных) и несколько (ускоренно делящихся) циклов деления за время культивирования.
дозовая зависимость (рис. 2). В последнем случае эффект может быть связан с гибелью поврежденных клеток путем апоптоза (генотоксическое действие) или некроза (в основном токсические эффекты). Поскольку цитогенетический анализ не выявил различий в частотах апоптоза, индуцированных асбестом и АРе111 во всем диапазоне изученных доз, можно предположить, что основным механизмом гибели клеток в обоих случаях являлся не апоптоз, а некроз, который в данном тесте при рутинной окраске препаратов не определяется.
Важно отметить, что в присутствии асбеста генетические повреждения чаще встречались среди клеток, прошедших за время культивирования более одного цикла деления (ускоренно делящихся), в то время как при экспозиции АFeIII наибольшая частота повреждений была зафиксирована в клетках, прошедших всего один цикл деления (двуядерных) (рис. 3).
Эти данные позволяют предположить следующие альтернативные сценарии развития эффектов нестабильности генома:
1. Опухолевая трансформация клеток в присутствии АРе111 должна происходить значительно раньше, чем при действии тех же доз асбеста, и тогда АРе111 является более опасным канцерогеном, чем асбест.
Рис. 4. Доля клеток с НПМ среди всех делящихся клеток с повреждениями в культуре лПК человека при инкубации с хризотилом или АРе111.
89
[гиена и санитария 2/2014
Асбест
Y=4,4207+1,9627*х; 0,95 Conf.lnt.
AFe III
Var2=7,7828-1,7503*х; 0,95 Conf.lnt.
Концентрация волокон в культуре, мг/мл
Концентрация волокон в культуре, мг/мл
Рис. 5. Частота асимметричных 3-ядерных клеток в спектре клеточных популяций.
2. В присутствии AFe111 поврежденные клетки либо погибают (некроз) после первого митоза, либо повреждения ДНК активно репарируются, причем в любом из этих случаев канцерогенный потенциал АFeIII не может быть сколько-нибудь значительным.
Для выбора наиболее релевантного сценария мы сравнили типы генетических повреждений, индуцированных в клетках хризотилом и AFe111. При этом рассуждали следующим образом: известно, что клетка с МЯ обычно гибнет после ближайшего митоза и, следовательно, не может дать дефектное потомство, а клетка, несущая НПМ, после первого митоза, как правило, выживает, но наличие НПМ препятствует равномерному распределению генетического материала между дочерними клетками во время митоза. Поэтому образование НПМ как один из механизмов возникновения анеуплоидии (наиболее серьезного эффекта, отличающего клетки опухоли от нормальных [21]) считается более серьезным генетическими повреждением, чем МЯ, возникшее либо из концевого фрагмента хромосомы, либо при избыточной репликации ДНК [13].
В диапазоне малых доз хризотил и AFe111 индуцировали практически равные частоты клеток, содержащих МЯ и НПМ (рис. 4). Однако начиная с дозы 0,2 мг/мл в культурах, экспонированных асбестом, начинали доминировать клетки с НПМ, а в культурах, экспонированных AFe111, - клетки с МЯ. На основании этих наблюдений можно предположить, что при экспозиции AFe111 риск асимметричного распределения генетического материала в митозе ниже, чем при экспозиции асбестом.
Это предположение подтвердил анализ частоты образования асимметричных 3-ядерных клеток (рис. 5), который четко показал прямую дозовую зависимость для асбеста, но обратную — для AFe111.
Таким образом, результаты цитогенетических исследований согласуются между собой и показывают, что кипячение асбеста в насыщенном растворе хлорида железа (III) привело к таким изменениям волокна, которые реализовались в снижении частоты и изменении спектра индуцированных генетических повреждений в клетках и некотором торможении пролиферативной активности ЛПК человека по сравнению с действием хризотила. В совокупности эти различия в цитогенетических эффектах могут свидетельствовать о качественных различиях в механизмах индукции эффектов нестабильности генома под действием AFe111 и хризотила.
Поиск причин обнаруженных различий показал, что их нельзя связать с изменением размеров волокна при обработке хлоридом железа, поскольку распределения размеров частиц в образцах хризотила и AFe111, полученные на растровом
электронном микроскопе, статистически не различались. В то же время следует учесть, что при кипячении асбеста в растворе хлорида железа (III) на поверхности волокна хризотила образуется эпитаксиальный слой (эпитаксия это процесс наращивания монокристаллических слоев вещества на подложку), состоящий из малорастворимых соединений железа (силикатов и гидроксида железа III), существенно меняющий свойства этой поверхности. В таком виде, в отличие от железа, входящего в состав природного хризотила, железо эпитаксиального слоя не должно принимать участие в реакции Фентона и, следовательно, стимулировать образование AP как в биологических средах, так и в организме человека [8]. Для проверки этого предположения в отдельных экспериментах была проанализирована интенсивность люминолзависи-мой хемилюминесценции нейтрофилов крови человека при экспозиции образцами хризотила и AFe111 (рис. 6). На этом рисунке видно, что индукция AP под действием асбеста во все время эксперимента была в несколько раз выше, чем под действием AFe111 (p=0,000001), т. е., действительно, эпитаксиальный слой на поверхности асбестового волокна блокирует образование свободных радикалов кислорода. Эти данные доказывают снижение вклада свободных радикалов кислорода в биоагрессивность AFe111, что позволяет объяснить снижение эффектов нестабильности генома под действием AFe111 по сравнению с хризотилом.
Однако снижение частоты клеток с повреждениями, отмеченное в культурах, экспонированных AFe111 (см. рис. 2),
Время, мин
—О— Контроль —•— Хризотил —О-- AFe III
Рис. 6. Интенсивность хемилюминесценции нейтрофилов крови человека при воздействии природного асбеста и AFe111.
90
не может быть объяснено относительным снижением уровня АР, индуцированным AFe111 по сравнению с асбестом, так как в культуре общее количество АР должно увеличиваться пропорционально увеличению концентрации AFeIII. Поэтому реальным объяснением этого эффекта остается только его связь с гибелью поврежденных клеток. Поскольку частота апоптоза с увеличением концентрации как хризотила, так и AFeIII не изменялась, можно предположить, что обсуждаемые изменения связаны только с индукцией некротической гибели клеток.
Таким образом, совокупность данных, приведенных в настоящей публикации, позволяет понять, что механизм индукции эффектов нестабильности генома человека in vitro под действием асбеста в значительной степени обусловлен как действием свободных радикалов кислорода, так и гибелью поврежденных клеток. В итоге модификация поверхности волокна асбеста обработкой раствором хлорида железа (III) значительно снижает его генотоксическую активность, что подтверждает ранее опубликованные результаты исследований на животных [8].
Полученные данные также позволяют сделать некоторые практические рекомендации к проведению исследований по оценке нестабильности генома людей, контактирующих с асбестом:
- поскольку асбестиндуцированные генетические повреждения были обнаружены преимущественно в клетках, прошедших в культуре более одного цикла деления, при обследовании людей следует использовать именно микроядерный тест на ЛПК, культивируемых в условиях цитокинетического блока, позволяющий определить количество митотических циклов для большинства клеток, разделившихся в культуре;
- поскольку классический вариант микроядерного теста не позволяет анализировать повреждения в клетках, прошедших более одного цикла деления, для цитогенетического анализа эффектов асбеста корректно использовать расширенный протокол;
- при проведении цитогенетического анализа следует особо обратить внимание на такие повреждения генома, как НПМ, а также на степень асимметрии распределения генетического материала при делении клеток во втором митозе.
Выводы. 1. Механизм асбестиндуцированной нестабильности генома человека in vitro во многом связан с образованием генетических повреждений, которые возникают преимущественно в клетках, прошедших за время культивирования более одного цикла деления. Среди этих повреждений доминирующую роль играют НПМ и асимметричное распределение генетического материала в митозе.
2. Эпитаксиальный слой, образовавшийся на поверхности волокна асбеста при кипячении в насыщенном растворе хлорида железа (III), значительно снижает эффекты нестабильности генома.
3. Для оценки нестабильности генома людей, контактирующих с асбестом, следует использовать лПК, культивируемые в условиях цитокинетического блока; цитогенетический анализ рекомендуется проводить по расширенному протоколу, позволяющему выявить эффекты в клетках, прошедших в культуре более одного цикла деления. Особое внимание следует обратить на такие повреждения генома, как НПМ, а также на частоту асимметричных 3-ядерных клеток.
Литература (пп. 1-6, 9-13, 16, 17, 19, 20 - см. References)
7. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Смирнова О.В., Везенцев А.И.,
Гудкова Е.А. Активные радикалы кислорода и волокнистый
(асбестовый) канцерогенез. Токсикологический вестник.
2009; 1: 27-31.
8. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Смирнова О.В., Везенцев А.И.,
Гудкова Е.А., Ингель Ф.И. Канцерогенная и мутагенная ак-
тивность хризотила, обработанного хлоридом железа (III). Гигиена и санитария. 2013; 3: 76-80.
14. Ингель Ф.И. Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока. Часть 1. Пролиферация клеток. Экологическая генетика. 2006; 4(3): 7-19.
15. Ингель Ф.И. Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока. Часть 2. Факторы среды и индивидуальные особенности в системе оценки нестабильности генома человека. Экологическая генетика. 2006; 4(4): 39-54.
18. Комплекс методов оценки иммунного статуса человека: Методическое пособие для врачей-лаборантов. М.; 2001.
21. Тимошевский В.А., Назаренко С.А. Биологическая индикация мутагенных воздействий и генетической нестабильности у человека путем учета числовых хромосомных нарушений. ВестниквОГиС. 2006; 10(3): 530-40.
References
1. IARC Scientific Publications No. 140. Mechanisms of fibre carcinogenesis. Lyon, France; 2009.
2. IARC Special Report: Policy. A review of human carcinogens -Part C: metals, arsenic, dusts and fibres. Lyon, France; 2009.
3. Lutz W., Krajewska B. Oxidative stress as a basic mechanism of the carcinogenic effect of manmade mineral fibers on the human body. Med. Pr. 1995; 46(3): 275-84.
4. Nygren J., Suhonen S., Norppa H., Linnainmaa K. DNA damage in bronchial epithelial and mesothelial cells with and without associated crocidolite asbestos fibers. Environ. Mol. Mutagen. 2004; 44(5): 477-82.
5. Puhakka A., Ollikainen T., Soini Y, Kahlos K., Saily M., Koistinen P. et al. Modulation of DNA single-strand breaks by intracellular glutathione in human lung cells exposed to asbestos fibers. Mutat. Res. 2002; 514(1-2): 7-17.
6. Quinlan T.R., Marsh J.R., Janssen Y.M.W., Borm P.A., Mossman B.T. Oxygen radicals and asbestos-mediated disease. ‘Environ. Health Perspect. 1994; 102(10): 107-10.
7. Pylev L.N., Vasil’eva L.A., Smirnova O.V, Vezentsev A.I., Gudkova E.A. The active oxygen radicals, and fibrous (asbestos) carcinogenesis. Toksikologicheskiy vestnik. 2009; 1: 27-31. (in Russian)
8. Pylev L.N., Vasil’eva L.A., Smirnova O.V, Vezentsev A.I., Gudkov E.A., Ingel F.I. Carcinogenic and mutagenic activity of chrysotile treated with iron chloride (III). Gigiena i sanitariya. 2013; 3: 76-80. (in Russian)
9. Gadbois D.M., Lehnert B.E. Cell cycle response to DNA damage differs in bronchial epithelial cells and lung fibroblasts. Cancer Res. 1997; 57(15): 3174-9.
10. Smith L.E., Nagar S., Kim G.J., Morgan W.F. Radiation-induced genomic instability: radiation quality and dose response. Health Phys. 2003; 85(1): 23-9.
11. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus assay evolves into a “cytome” assay of chromosomal instability, mitotic dysfunction and cell death. Mutat. Res. 2006; 537(7): 127-32.
12. El-Zein R.A., Schabath M.B., Etzel C.J., Lopez M.S., Franklin J.D., Spitz M.R. Cytokinesis-blocked micronucleus assay as a novel biomarker for lung cancer risk. Cancer Res. 2006; 66: 6449-56.
13. Fenech M., Kirsch-Volders M., NatarajanA.T., Surralles J., Crott J.W., Parry J. et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 2011; 26(1): 125: 32.
14. Ingel F.I. Prospects of using of micronucleus test on human lymphocytes, cultivated in cytokinetic block. Part 1 Cell proliferation. Ekologicheskaya genetika. 2006; 4(3): 7-19. (in Russian)
15. Ingel F.I. Prospects of using of micronucleus test on human lymphocytes, cultured in cytokinetic block. Part 2. Environmental factors and individual characteristics in the evaluation system of the human genome instability. Ekologicheskaya genetika. 2006; 4(4): 39-54. (in Russian)
91
[гиена и санитария 2/2014
16. Parry J.M. A proposalfor a new OECD. Guideline for the in vitro micronucleus test. Available at: http://www.oecd.org/dataoecd (accessed 10 May 2010).
17. Titenko-Holland N., Jacob R.A., Shang N., Balaraman A^Smith M.T. Micronuclei in lymphocytes and exfoliated buccal cells of postmenopausal women with dietary changes in filate. Mutat. Res. 1998; 417: 101-14.
18. Complex of methods assessing the immune status of the individual Toolkit for medical laboratory technicians [Kompleks metodov otsenki immunnogo statusa cheloveka: Metodicheskoe posobie dlya vrachey-laborantov]. Moscow; 2001. (in Russian)
19. Dimitrijevic-Bussod M., Balzaretti-Maggi V.S., Gadbois D.M. Extracellular matrix and radiation G1 cell cycle arrest in human fibroblasts. Cancer Res. 1999; 59(19): 4843-7.
20. Raptis S., Bapat B. Genetic instability in human tumors. Experientia. 2006; 96: 303-20.
21. Timoshevsky V.A., Nazarenko S.A. Biological indication of mutagenic effects and genetic instability in humans by integrating of numerical chromosome abnormalities. Vestnik VOGiS. 2006; 10(3): 530-40. (in Russian)
Поступила 27.10.12 Received 27.10.12
Методы гигиенических исследований
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 613.31-074:543.544.45
Сотников Е.Е.1, Загайнов В.Ф.2, Михайлова Р.И.1, Милочкин Д.А.2, Рыжова И.Н.1, Корнилов И. О.2
парофазный анализ летучих органических соединений в Питьевой воде методом газовой хроматографии
1ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава России, 119121, Москва; 2ЗАО СКБ «Хро-матэк», 424000, Республика Марий Эл, г. Йошкар-Ола
В статье представлена методика парофазного анализа 52 летучих органических соединений в питьевой воде методом газовой хроматографии с использованием хроматографа «Кристалл 5000.2» с тремя детекторами и автоматической приставкой Lab Hut НТ 200Н-200 для подготовки образца воды и ввода парогазовой фазы. Нижний предел обнаружения для всех соединений в 2 - 10 раз ниже соответствующего нормативного значения.
Ключевые слова: газовая хроматография; статический парофазный анализ; летучие соединения.
Sotnikov E.E.1, Zagajnov V.F.2, Mihajlova R.I. 1, Milochkin D.A.2, Ryzhova I.M.1, Kornilov I.O.2 — HEADSPACE ANALYSIS OF VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS (VOC) IN DRINKING WATER BY THE METHOD OF GAS CHROMATOGRAPHY
2A. N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, 119121, Moscow, Russian Federation; 2JSC SDO CHROMATEC, 424000, Yoshkar-Ola, Republic Mari El, Russian Federation
In the paper there is presented a methodology of analysis of headspace 52 volatile organic compounds in drinking water by the method of gas chromatography with the use of the chromatograph “Crystal 5000.2” with three detectors and automatic attachment Lab Hut 200N NT-200for the preparation of the sample water and vapor phase input. The lower limit of detection for all compounds in the 2-10 times lower than that of the corresponding standard value.
Key words: gas chromatography; static headspace; volatile compounds.
введение
Определение летучих органических соединений (ЛОС) в питьевой воде на уровне предельно допустимых концентраций (ПДК) является сложной аналитической задачей, состоящей из их извлечения и концентрирования из исследуемого образца, последующего газохроматографического (ГХ) разделения и детектирования с помощью различных детекторов.
Для извлечения органических соединений из воды часто применяют жидкостную экстракцию (ЖЭ), например, после экстракции углеводородным растворителем для некоторых галогенсодержащих соединений (ГСС) с детектором по захвату электронов (ЭЗД) достигли чувствительности менее 0,1 мкг/л [1], ГОСТ Р51392-99. В последнее время при анализе питьевой воды находит применение метод микроэкстракции одной каплей растворителя (single-drop microextraction
Для корреспонденции: Сотников Евгений Евгеньевич, eugen. [email protected]
- SDME), имеющий несколько различных вариаций [2 - 4]. Ограничения методов ЖЭ и SDME связаны с высокими требованиями к чистоте используемых реактивов, а кроме того, ЖЭ занимает много времени.
Для повышения чувствительности ГХ-анализа ЛОС его сочетают с твердофазной микроэкстракцией (ТФМЭ) [5]. Часть соединений из газовой фазы над водой или непосредственно из неё концентрируются на волокнах с сорбирующим покрытием, вводимых в сосуды с водой специальным шприцем с выдвигаемым из иглы волокном. Соединения сорбируются на покрытии волокна определённое время, затем волокно убирается внутрь иглы шприца и переносится в испаритель хроматографа. Ограничения метода с ТФМЭ связаны с частой сменой волокна и подбором соответствующего сорбирующего покрытия волокна при анализе различных классов ЛОС из воды.
Для определения микропримесей ЛОС в воде широко используется парофазный анализ (ПФА), основанный на сочетании газовой экстракции (ее статической (СПФА) или динамической (ДПФА) версии) с ГХ или хромато-масс-
92
