CC BY
59
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
оригинальные статьи
3
УДК 57.085.23:616.832-089-091.8
В.Б. Огай1, Ш.Е. Байдосова1, Е.А. Ли1, Т.Т. Керимбаев2 (д.м.н.), В.Г. Алейников2, Н.Т. Алдиярова2 (д.м.н.), С.К. Акшулаков2 (д.м.н.)
1 РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, Астана, Казахстан
2 АО «Национальный центр нейрохирургии» МЗ РК, Астана, Казахстан
ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА BDNF И ХОНДРОИТИНАЗы АВС НА ФУНКЦИОНАЛьНУЮ АКТИВНОСТь МЕЗЕНХИМАЛьныХ
стволовых клеток и двигательных НЕЙРОНОВ крыс при
ПОВРЕЖДЕНИИ СПИННОГО МОЗГА
Целью исследования являлось изучение влияния нейротрофического фактора BDNF и хондроитиназы АВС на функциональную активность двигательных нейронов и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) крыс. Функциональную активность двигательных нейронов и МСК крыс изучали с помощью пролиферативного, морфологического и иммуноцитохимического анализа. Результаты исследования показали, что BDNF повышает пролиферативную активность как МСК, так и двигательных нейронов. При этом, был обнаружен дозозависимый эффект BDNF на пролиферацию этих клеток. Более того, было показано, что BDNF способен индуцировать дифференцировку МСК в нейрональном направлении. В случае хондротиназы АВС, то ее добавление к МСК не оказывало никакого эффекта на пролиферативную активность. Напротив, культивирование двигательных нейронов с хондроитиназой АВС приводило к повышению пролиферации этих клеток. При этом, эффект был дозозависимым, начиная от 2 до 10 Ед./мл.
Таким образом, полученные данные показали, что BDNF и хондроитиназа АВС оказывают стимулирующий
эффект на функциональную активность двигательных нейронов спинного мозга и МСК.
Ключевые слова: BDNF, хондроитиназа АВС, мезенхимальные стволовые клетки, двигательные нейроны
Введение
Повреждение спинного мозга (ПСМ) является одной из самых разрушительных травм и может приводить к серьезному сенсорному и моторному дефициту со многими тяжелыми осложнениями [1]. В настоящее время лекарственная терапия, рекомендуемая для лечения травматических повреждений спинного мозга, используется с заметным, но, к сожалению, ограниченным успехом [2]. Одним из основных препятствий для восстановления функции спинного мозга является его низкая способность к регенерации. Кроме того, при острой травме взрослые аксоны не вырастают так же быстро, как молодые, хронически поврежденные аксоны еще более склонны к нарушению регенерации, им нужна дополнительная стимуляция с помощью экзогенных нейротрофических факторов, такой как BDNF (нейротрофический фактор головного мозга). Было доказано, что BDNF играет важную роль в развитии и функционировании центральной нервной системы (ЦНС) и имеет существенное значение в развитии ее различных патологических состояний. Ряд исследований показали, что BDNF обладает выраженными нейрозащитными свойствами, подавляет клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и стимулирует рост нервных волокон при ишемических повреждениях и травмах ЦНС [37].
Еще одним препятствием для успешной регенерации является глиальный рубец, который образуется сразу вокруг поражения спинного мозга. Реактивные астроциты, фибробласты, стволовые клетки в пределах рубца быстро активируют секрецию ингибирующих молекул, в том числе нескольких хондроитин сульфат протеогликанов (CSPG), которые, возможно, играют ключевую роль в низкой регенеративной способности поврежденных нервных клеток. CSPG - бактериальный фермент хондроитиназы ABC, который расщепляет ингибирую-щий фрагмент сахара из сердцевины белка CSPG, приводил к улучшению повторного роста остро поврежденных аксонов в естественных условиях и вызывал некоторое функциональное восстановление [8]. Некоторые авторы показали, что, если дальний интерфейс периферического нерва обрабатывать хондроитиназой ABC, то значительно больше аксонов пересекают границу рубцовой ткани, чтобы повторно реиннервировать спинной мозг, что в результате может улучшить регенерацию при хронической травме спинного мозга.
В последнее время перспективной стратегией для лечения ПСМ является трансплантация стволовых клеток для замены погибших или поврежденных клеток, которые обеспечивают трофическую поддержку для восстановления поврежденных структур и утраченных функций спинного мозга [9, 10]. В частности, мезенхимальные стволовые клет-
В.Б. Огай, e-mail: ogay@biocenter.kz
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№1 (46), 2017
ки (МСК), выделенные из костного мозга являются отличными кандидатами для клеточной терапии, поскольку они могут быть легко выделены и быстро размножены в условиях in vitro. Эти клетки муль-типотентны и могут дифференцироваться в различные специализированные клетки, в том числе нейроны. Было показано, что МСК могут секрети-ровать множество цитокинов и факторов роста, которые способствуют эндогенному росту нейронов, влиять на нейрогенез и ангиогенез, стимулировать синаптическую связь и ремиелинизацию поврежденных аксонов, ингибировать апоптоз, и регулировать воспаление через паракринные механизмы
[11]. Ряд доклинических исследований показали, что трансплантация МСК экспериментальным животным с повреждением спинного мозга ускоряет восстановление аксонов и определенных функций
[12]. Однако эта стратегия в настоящее время ограничивается плохой выживаемостью животных и неконтролируемостью дифференциации трансплантированных стволовых клеток.
Поэтому, в последние годы ученые все больше фокусируются на разработке комбинированных подходов лечения травм спинного мозга с использованием стволовых клеток, лекарственных препаратов, ферментов, нейротрофических факторов и различных биосовместимых гидрогелей. Так, например, в литературе существует ряд работ по разработке новых подходов с применением подсадки периферического нерва в хронический очаг ушиба спинного мозга с высокими концетрациями хон-дроитиназы ABC для удаления глиальных рубцов, и/ или в комбинации с нейротрофическим факторами для стимулирования роста поврежденных аксонов [13-15]. Однако нет никаких данных о стратегиях регенеративного лечения травмы спинного мозга с использованием комбинированного применения хондроитиназы ABC, нейротрофического фактора BDNF и МСК.
В этой связи, для того чтобы проверить насколько будет эффективна данная комбинированная стратегия для восстановления травмы спинного мозга на модельных животных была поставлена первоначальная задача, заключающаяся в изучении эффектов нейротрофического фактора BDNF и хондроитиназы АВС на функциональную активность, как МСК, так и двигательных нейронов в условиях in vitro.
Материалы и методы Животные
В данном исследовании использовали аут-бредных крыс-самцов линии Вистар весом 250-300 гр., которые были приобретены из питомника лабораторных животных «Пущино» (Россия). Животные содержались в условиях вивария включающий 12 часовой цикл день/ночь, при температуре 22-23°С. Все эксперименты с животными проводились только после одобрения локального этического комитета.
Выделение и культивирование МСК костного мозга крыс
Для выделения клеток костного мозга, животных выводили из эксперимента с помощью установки для эвтаназии, согласно инструкции производителя ООО «НПК Открытая Наука» (РФ). МСК выделяли из бедренных костей животных. Полученную клеточную суспензию профильтровали через 70 мкм клеточный фильтр (Beckton-Dickenson, USA), ресуспендировали в среде а-МЕМ, подсчитывали в камере Нойбауэра количество клеток и культивировали в полной питательной среде а-МЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Через 3 дня неприкрепленные к пластику клетки удаляли промыванием фосфатно-солевым буфером (ФСБ), а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади культурального флакона. Пассирование клеток производили рекомбинантным трипсином TrypLE Express (Life Technologies, UK) с интервалом 6-7 дней.
Выделение и культивирование двигательных нейронов спинного мозга крыс
Новорожденных однодневных крысят усыпляли методом эвтаназии с использованием СО2-ка-меры. Спинной мозг животных выделяли в стерильных условиях на льду под стереомикроскопом SZ61. Спинной позвонок от позвоночника отделяли с помощью пинцета. Ножницами полученный материал измельчали на мелкие кусочки 1 мм2. Затем кусочки спинного мозга были обработаны теплым 0,25% трипсином и инкубировались в течение 45 минут при 37°С, периодически перемешивая. На следующем этапе добавляли полную питательную среду DMEM/F12, содержащей 10% ЭТС, ростовую добавку B-27 и 2 мМ L-глютамина, чтобы инактивировать действие трипсина. После этого супернатант с 6,7% метризамидом центрифугировали 3000 об/мин 15 минут. Осадок клеток ресуспендировали в среде для культивирования и осаждали при 1000 об/мин в течение 5 минут. В дальнейшем к осадку добавляли свежей полной питательной среды DMEM/ F12 и инкубировали 30 минут для седиментации клеток. Подсчет клеток осуществляли в гемоци-тометре и разводили клетки до конечной концентрации 5x104 клеток/мл. Культуральный флакон для культивирования клеток предварительно обрабатывали поли^-лизином (0,1 мг/мл) отмывали дважды ФСБ и подсушивали. Культивирование клеток осуществляли при 37°С и 5% СО2. На второй день производили смену среды DMEM/F12 на нейроба-зальную среду (Life Technologies, USA) содержащей ростовую добавку B27, 2 мМ L-глютамина, 100 Ед./ мл пенициллина и 100 мкг стрептомицина. Через 2 дня неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади культурального флакона. Пассирование клеток производи-
ли рекомбинатным трипсином (TrypLe Express, Life Technologies, USA) c интервалом 6-7 дней.
Тест на образование фибробластных колоние-образующих единиц
Клетки выделенные из костного мозга крыс рассевали в культуральные флаконы Т25 с расчетом 10 клеток/см2 и культивировали в полной питательной среде в течение 14 дней при 37°С и 5% СО2. По окончании срока культивирования, клетки промывали ФСБ и окрашивали 0,5% раствором кристаллического фиолетового в течение 5 мин при комнатной температуре. После двукратной отмывки ФСБ проводили подсчет образовавшихся колоний с использованием стереомикроскопа SZ61 (Olympus, Germany). Снимки получали с помощью CCD-каме-ры SC-100 (Olympus, Germany).
Иммуноцитохимический анализ
Клетки рассевали на 4-луночный слайд по 1 х 105 клеток на лунку и инкубировали в течение ночи в СО2-инкубаторе для образования монослоя. Затем, монослой клеток фиксировали свежеприготовленным раствором 4% параформальдегида в ФСБ (pH 7,2) в течение 20 мин. После пятиминутной обработки тритоном Х-100 клетки отмывали три раза ФСБ и добавляли 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 30 мин. Далее клетки инкубировали с антителами против CD90, CD105, CD73, NeuN и MAP2. Для приготовления необходимой концентрации, антитела разводили в растворе, содержащем 1% БСА и 0,2% Tween 20 в фосфатном буфере. Первичные антитела разводили в следующем соотношении: мышиные моноклональные антитела против CD90 (1:200), CD105 (1:100), NeuN (1:100) и MAP2 (1:100) (Abcam, UK), кроличьи антитела против CD73 (1:200), (Abcam, UK). Инкубирование препаратов клеток в растворе антител проводили при 37°C в течение 1 часа. После трех пятиминутных отмывок в растворе 0,2% Tween 20 в фосфатном буфере к препаратам клеток наносили раствор козьих анти-кроличьих и анти-мышиных антител (1:500), конъюгированных с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Life Technologies, UK) и инкубировали 45 мин при 37°C в темноте. Клетки отмывали от раствора антител три раза по 5 мин. 0,2% раствором Tween 20. После высушивания, на слайд наносили по 20 мкл антивыгорающего раствора с красителем DAPI (Life Technologies, UK). Препараты анализировали с помощью инвертированного флюоресцентного микроскопа Axio Observer A1 (Carl Zeiss, Germany) и программного обеспечения Zen 2011.
Дифференцировка в хондроциты, остеобласты и адипоциты
Для дифференцировки в хондроциты, клетки были ресуспендированы в дифференцировочной среде состоящей из среды ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 1% раствора инсулина-трансфе-рина-селенита, 100 цМ аскорбат-2-фосфата, 10-7
М дексаметазона и 10 нг/мл TGF-P1 в концентрации 1,25 х 106 клеток/мл. Чтобы создать хондро-генные микрошарики, в каждую V-образную лунку 96 луночного полипропиленнового планшета (Phenix, Hayward, CA), наносили по 2,5 х 105 клеток затем центрифугировали при 500 g, и переносили в СО2-инкубатор при 37°C, и 5% CO2. Смену среды проводили 3 раза в неделю. На 21-й день диффе-ренцировки, образовавшиеся микрошарики были собраны и зафиксированы в 4% растворе пара-формальдегида (рН 7,2). Образцы были помещены в парафин, нарезаны на микротоме и обработаны для окрашивания гематоксилин-эозином или тоу-одиновым синим.
Для остеогенной дифференцировки клеток использовали индукционную среду, содержащую 10-7 М дексаметазона, 10 мМ в - глицерол-фосфа-та и 50 мкМ аскорбат-2- фосфата. Культивирование проводили в течение 3 недель после чего, клетки окрашивали ализариновым красным S.
Дифференцировку в адипоциты проводили путем их культивирования в индукционной среде, содержащей 10-6 М дексаметазона 0,5 мкМ 3-изо-бутил-1-метилксантина и 10 нг/мл инсулина в течение 3 недель. По окончании культивирования, клетки окрашивали красителем Oil Red O.
Тест на пролиферацию
МСК и двигательные нейроны крысы рассеивали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Corning Costar, США) по 5х103 клеток на лунку и инкубировали 16 часов в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Для двигательных нейронов спинного мозга крысы лунки 96-луночного планшета предварительно были обработаны поли^-лизином. Затем удаляли среду из лунок с помощью аспиратора и заменяли ее на полную питательную среду с добавлением различных концентраций рекомбинантного BDNF и хондроитиназы АВС. В контрольные лунки добавляли просто полную питательную среду. После добавления к клеткам различных концентраций BDNF и хондроитиназы АВС, проводили инкубирование в течение 72 часов в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Пролиферацию клеток определяли окрашиванием при добавлении 10 мкл красителя Alamar Blue (Invitrogen, США) в течение 4 часов. Оптическую плотность измеряли при длине волны 570 нм на спектрофотометре для планшетов (Biorad 670, Франция). Уровень пролиферации рассчитывали по формуле:
ИП (%) = Оптическая плотность в экспериментальных лунках х ю0 Оптическая плотность в контрольных лунках
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты статистической обработки экспериментальных данных представлены в виде графиков с указанием величины среднего квадратичного отклонения.
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№1 (46), 2017
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследования были получены и охарактеризованы первичные культуры МСК костного мозга крыс, которые обладали высокой адгезивностью, способностью формировать фибробластоподобные колонии и мультилинейной дифференцировкой в адипоциты, хондроциты и остеобласты (рис. 1).
Рисунок 1 - Характеристики МСК костного мозга крысы. А - Морфология МСК крысы. Окрашивание кристаллическим фиолетовым. В - МСК способны быстро пролиферировать и образовывать колонии. С - Дифференцировка МСК в адипоциты. Видны крупные вакуоли окрашенные красителем Oil Red. D - Дифференцировка МСК в остеобласты. Видны отложения кальция в клетках в результате окрашивания ализариновым красным. Е - Дифференцировка МСК в хондроциты. МСК формируют хондрогенновый микрошарик. Окрашивание гематоксилин-эозином
DAPI CD73 i CD73/DAPI «» 0
DAPI CD90 CD90/DAPI
DAPI CD105 CD105/DAPI
Рисунок 2 - Иммунофенотипирование МСК крысы
Более того, они экспрессировали характерные для этого типа клеток маркеры СЭ73, СЭ90 и СЭ105, что указывает на их мультипотентные свойства (рис. 2). Параллельно с получением МСК костного мозга
была получена первичная культура двигательных нейронов, которые были выделены из спинного мозга новорожденных крысят. Неонатальные нейроны спинного мозга обладают высоким проли-феративным потенциалом, и тем самым, служат в качестве клеток-мишеней при изучении действия определенных факторов биологической или химической природы.
В связи с этим, было проведено изучение влияния нейротрофического фактора головного мозга BDNF и хондроитиназы АВС на пролиферативную активность двигательных нейронов и МСК костного мозга крыс. В этом эксперименте использовали следующие концентрации BDNF (40, 80, 100 нг/мл) и хондроитиназы ABC (2, 5, 10, 50 Ед./мл). После добавления к клеткам различных концентраций BDNF и хондротиназы АВС, проводили инкубирование в течение 72 часов в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. В результате было обнаружено, что добавление рекомбинантного BDNF к МСК оказывало до-зозависимый эффект на пролиферацию этих клеток (рис. 3).
Рисунок 3 - Влияние рекомбинантного ВЭЫР на пролиферацию МСК и двигательных нейронов крысы
Наибольшая пролиферативная активность наблюдалась при концентрации 100 нг/мл. Аналогичные результаты были получены и с двигательными нейронами спинного мозга крыс. Как видно на рисунке 3, культивирование двигательных нейронов с ВЭЫР также приводило к повышению роста этих клеток. Наибольший эффект был обнаружен при добавлении 100 нг/мл рекомбинантного ВЭЫР. Это также хорошо видно по высокой плотности культивированных нейронов как это показано на рисунке 4.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что ВЭЫР может использоваться для стимуляции роста поврежденных нейронов спинного мозга и ускорения регенерации за счет активации МСК, которые в свою очередь сами могут продуцировать данный нейротрофический фактор.
6
80 нг/мл
Рисунок 4 - Рост двигательных нейронов крысы после добавления различных концентраций рекомбинантного BDNF
Рисунок 5 - Влияние хондроитиназы АВС на пролиферацию МСК и двигательных нейронов крысы
Параллельно, с изучением эффектов BDNF были проведены эксперименты по влиянию хондроитиназы АВС на пролиферацию МСК костного мозга и двигательные нейроны крыс. Результаты, представленные на рисунке 5 показывают, что хондроитиназа АВС не оказывает существенного эффекта на пролиферативную активность МСК костного мозга. Однако культивирование двигательных нейронов с хондроитиназой АВС приводило к повышению пролиферации этих клеток. При этом следует отметить, что эффект был дозозависимым, начиная от 2 до 10 Ед./мл. Напротив, обработка клеток более высокими дозами (50 Ед./мл) хондро-итиназой АВС не вызывала существенных изменений в росте двигательных нейронов, по сравнению с контролем. Эти результаты согласуются с данными полученными ранее Gu и коллегами, которые показали, что обработка нейрональных прогениторных клеток различными дозами хондроитиназой АВС (0,05 до 5 Ед./мл) приводит к повышению пролиферации клеток [13]. При использовании высокой дозе хондроитиназы АВС (50 Ед./мл), достоверных
изменений в пролиферации нейрональных клеток обнаружено не было.
Следующей задачей нашей работы было изучить влияние рекомбинантного BDNF на нейро-нальную дифференцировку МСК крысы. Для изучения данного исследования МСК крысы рассеяли в 6-луночный культуральный планшет (1x105 на лунку) и культивировали в среде а-МЕМ с 15% ЭТС в течение 2 суток. За 24 часа до индукции поменяли среду на предифференцировочную, состоящую из среды а-МЕМ, 15% ЭТС и 1мМ |3-меркаптоэтанола. Через сутки клетки культивировали в среде DMEM/ F12 содержащей 5мМ в-меркаптоэтанола и 100 нг/ мл рекомбинантного BDNF. Через 3 суток после индукции клетки анализировались с помощью микроскопии и иммуноцитохимии. Результаты анализа представлены на рисунках 6 и 7. Было обнаружено, что добавление 100 нг/мл BDNF вызывает дифференцировку в нейрональном направлении. Это хорошо видно по изменению морфологии МСК, которые приобрели нейроно-подобную морфологию с характерными длинными отростками, как видно на рисунке 6.
Рисунок 6 - Влияние BDNF на нейрональную дифференцировку МСК костного мозга крыс. Стрелки указывают на отростки нейроно-подобных клеток
Более того, иммуноцитохимический анализ показал, что клетки после обработки нейротрофи-ческим фактором BDNF экспрессировали маркер нейрональных клеток Nestin и (маркер нейрональных клеток) и МАР2 (маркер зрелых нейронов), что характерно для нейрональных прогениторных клеток (рис. 7).
Фазовый контраст
Рисунок 7 - Иммуноцитохимический анализ нейроно-подобных клеток образовавшиеся после дифференцировки МСК в присутствии BDNF. Двойное
иммуноокрашиание: использовали кроличьи анти-крысинные антитела к NeuN (1:100) и мышиные анти-крысинные антитела к МАР2 (1:100)
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№1 (46), 2017
Выводы
По результатам проведенного исследования было установлено, что добавление рекомбинан-тного BDNF к МСК и двигательным нейронам оказывало дозозависимый стимулирующий эффект на пролиферацию этих клеток. Кроме этого, было обнаружено, что BDNF способен индуцировать МСК в нейроно-подобные клетки экспрессирующие не-стин (маркер нейрональных прогениторных клеток)
и МАР2 (маркер зрелых нейронов). Результаты про-лиферативного теста показали, что хондроитиназа АВС вызывала повышение роста двигательных нейронов, но не МСК крыс.
Таким образом, мы считаем, что полученные данные, могут быть основой для разработки новых комбинированных подходов для более эффективной регенерации и восстановления функций поврежденного спинного мозга.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Schwab M.E., Bartholdi D. Degeneration and regeneration of axons in the lesioned spinal cord // Physiol Rev. - 1996 Apr. - Vol. 76(2). - P. 319-70.
2. Tator H. Strategies for recovery and regeneration after brain and spinal cord injury // Injury Prevention. - 2002. - № 8 - P. iv33-iv36.
3. Ikeda O., Murakami M., Ino H., et al. Effects of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on compression-induced spinal cord injury: BDNF attenuates downregulation of superoxide dismutase expression and promotes up-regulation of myelin basic protein expression / J. Neuropathol. Exp. Neurol.
— 2002. - Vol. 61. — P. 142-153.
4. Jakeman L.B., Wei P., Guan Z., Stokes B.T. Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury //'Exp. Neurol. — 1998. — Vol. 154. -P. 170-184.
5. Koda M., Murakami M., Ino H., et al. Brain-derived neurotrophic factor suppresses delayed apoptosis of oligodendrocytes after spinal cord injury in rats / J. Neurotrauma. - 2002. - Vol. 19. - P. 777-785.
6. Ma Y.T., Hsieh T., Forbes M.E., et al. BDNF injected into the superior colliculus reduces developmental retinal ganglion cell death / J. Neurosci.
- 1998. - Vol. 18. - P. 2097-2107.
7. Tom V.J., Sandrow-Feinberg H.R., Miller K., Domitrovich C., Bouyer J., Zhukareva V., Klaw M.C., Lemay M.A., Houle J.D. Exogenous BDNF enhances the integration of chronically injured axons that regenerate through a peripheral nerve grafted into a chondroitinase-treated spinal cord injury site // Exp Neurol. - 2013. - № 239 - P. 91-100.
8. Gu W.L., Fu S.L., Wang Y.X., Li Y., Lu H.Z., Xu X.M., Lu P.H. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate the growth, differentiation and migration of multipotent neural precursor cells through the integrin
signaling pathway // BMC Neurosci. - 2009. - Vol. 10.
- P 128.
9. Parr A.M., Tator C.H., Keating A. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury. // Bone Marrow Transplant. - 2007. - №40(7) - P. 609-19.
10.Seo J.H., Cho S.R. Neurorestoration induced by mesenchymal stem cells: potential therapeutic mechanisms for clinical trials // Yonsei Med J. - 2012. -№53(6) - P. 1059-67.
11.Vawda R., Fehlings M.G. Mesenchymal cells in the treatment of spinal cord injury: current & future perspectives // Curr Stem Cell Res Ther. - 2013. - № 8(1) - P. 25-38.
12.Fehlings M.G., Vawda R. Cellular treatments for spinal cord injury: the time is right for clinical trials // Neurotherapeutics. - 2011. - №8(4) - P. 704-20.
13.Tom V.J., Sandrow-Feinberg H.R., Miller K., Domitrovich C., Bouyer J., Zhukareva V., Klaw M.C., Lemay M.A, Houle J.D. Exogenous BDNF enhances the integration of chronically injured axons that regenerate through a peripheral nerve grafted into a chondroitinase-treated spinal cord injury site // Exp Neurol. - 2013. - №239 - P. 91-100.
14. Tom V.J., Sandrow-Feinberg H.R., Miller K., Santi L., Connors T., Lemay M.A, Houle J.D. Combining peripheral nerve grafts and chondroitinase promotes functional axonal regeneration in the chronically injured spinal cord // J Neurosci. - 2009. - №29(47) - P. 14881-90.
15.Cheng C.H., Lin C.T., Lee M.J., Tsai M.J., Huang W.H., Huang M.C., Lin Y.L., Chen C.J., Huang W.C., Cheng H. Local Delivery of High-Dose Chondroitinase ABC in the Sub-Acute Stage Promotes Axonal Outgrowth and Functional Recovery after Complete Spinal Cord Transection // PLoS One. - 2015. - №10(9)
- P. e0138705.
ТТЙ1НДЕМЕ
В.Б. Огай1, Ш.Е. Байдосова1, Е.А. Ли1, Т.Т. Керимбаев (м.г.д.)2, В.Г. Алейников2, Н.Т. Алдиярова (м.г.д.)2, С.К. Акшулаков (м.г.д.)2
1 «¥лттык биотехнология орталыш» КР Б€М FK РМК, Астана, Казакстан
2 «¥лттык нейрохирургия орталыш» АК КР ДСМ, Астана, Казакстан
МЕЗЕНХИМАЛДЫ БАГАНАЛЫ ЖАСУШАЛАРДЬЩ КЫЗМЕТТ1К БЕЛСЕНД1Л1Г1НЕ ЖЭНЕ ЕГЕУКУЙРЫКТАРДЫЩ КОЗГАУЫШ НЕЙРОНДАРЫНА BDNF НЕЙРОТРОФТЫ ФАКТОРЫНЫЦ ЖЭНЕ ABC ХОНДРОИТИНАЗАНЫК ЭСЕР1
Зерттеу жумыстыц максаты мезенхималды баFаналы жасушалардыц (МБЖ) кызметтк белсен-дiлiгiне жэне егеукуйрыктардыц козFауыш ней-рондарына BDNF нейротрофты факторы жэне ABC хондроитиназаныц эсерiн зерттеу болып табылады. K1озFауыш нейрондарыныц жэне егеукуйрыктардыц МБЖ-ныц кызметтiк белсендiлiгiн пролиферативтi, морфологиялык жэне иммунохимиялык талдаулар аркылы етюзген. Зерттеу нэтижесiнде BDNF МБЖ-ныц сонымен катар козFауыш нейрондарыныц про-лиферативтi белсендiлiгiн арттыратыны аныкталды. Сонымен бiрге, BDNF жасушалардыц пролифе-рациясына мелшер байланысты эсерi бар екен аныкталды. Сонымен катар BDNF МБЖ-ныц нейро-
налды баFытында езгеруге ыкпал ететiнi керсетiлдi. АВС хондроитиназаны МБЖ^а косканда керiсiн-ше пролифертивтi белсендттне эсер етпейтiнi аныкталды. KозFауыш нейрондарымен АВС хондроитиназаны бiрге косып есiргенде жасушалардыц пролиферациясы арттырылатыны керсеттдК Сонымен бiрге, эсерi 2-ден бастап 10-Fа дейiн Бiрл./мл мелшерЫде байланысты болды.
Сонымен, алынFан нэтижелер бойынша BDNF пен АВС хондроитиназа МБЖ^а жэне жулын KозFауыш нейрондарыныц кызметтiк белсендiлiгiне ынтыландырушы эсерi бар екен керсетiлдi.
Негiзгi сездер: BDNF, АВС хондроитиназа, мезенхималды баFаналы жасушалар, козFауыш нейрондар.
SUMMARY
V.B. Ogay1, Sh.E. Baidosova1, Y.A. Li1, T.T. Kerimbaev (D.Med.Sci.)2, V.G. Aleynikov2, N.T. Aldiyarova (D.Med.Sci.)2, S.K. Akshulakov (D.Med.Sci.)2
1RSE «National Center for Biotechnology», Astana, Republic of Kazakhstan
2 JSC «National Centre for Neurosurgery», Astana, Republic of Kazakhstan
EFFECT OF BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR AND CHONDROITINASE ABC ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF RAT MESENCHYMAL STEM CELLS AND MOTOR NEURONS
The aim of this study was to investigate the effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and chondroitinase ABC on the functional activity of motor neurons and rat mesenchymal stem cells (MSCs). Functional activity of motor neurons and MSCs has been examined using the proliferative, morphological, and immunocytochemical analysis. Results of this study showed that BDNF increased both proliferative activity of MSCs and motor neurons. In this case, dose-dependent effect of BDNF on the proliferation of these cells was found. Moreover, it was observed that BDNF is able to induce MSC differentiation into
neuronal direction. The addition of chondroitinase ABC to MSC culture had no effect on proliferative activity. In contrast, cultivation of motor neurons together with chondroitinase ABC resulted in increasing of cell proliferation. In this case the effect was dose-dependent ranging from 2 to 10 U/ml.
Thus, these data showed that BDNF and chondroitinase ABC have stimulating effect on the functional activity of spinal cord motor neurons and MSCs.
Keywords: BDNF, chondroitinase ABC, mesenchymal stem cells, motor neurons.
