CC BY
26
УДК 615.1:[612.017.1:612.112.91
ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПЕПТИДА НЕЙРОТЕНЗИНА НА РАЗВИТИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА, ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ И
НЕЙТРОФИЛОВ
© Лазарев А.И., Солин А.В., Ляшев Ю.Д.
Кафедра патофизиологии; кафедра травматологии и ортопедии Курского государственного медицинского университета
Исследовано влияние нейротензина на развитие гуморального иммунного ответа, функциональную активность макрофагов и нейтрофилов у мышей. Установлено, что однократное (на 1 или 4 сутки после иммунизации) или многократное введение пептида в широком диапазоне доз (1 - 100 мкг на кг массы тела) оказывает стимулирующее влияние на содержание антителообразующих клеток в селезенке и фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. Однократное введение нейротензина оказывает угнетающее действие на адгезивную способность макрофагов, а многократное - стимулирует ее. Указанные эффекты связаны, по-видимому, с изменениями в континууме регуляторных пептидов, которые возникают при введении нейротензина.
Ключевые слова: нейротензин, макрофаги, нейтрофилы, гуморальный иммунный ответ.
THE INFLUENCE OF NEUROTENSIN NEUROPEPTIDE ON HUMORAL IMMUNE RESPONSE, FUNCTIONAL ACTIVITY OF MACROPHAGES AND NEUTROPHILS Lazarev A.I., Solin A. V., Lyashev Yu.D.
Pathophysiology Department; Department of Traumatology and Orthopedics of the Kursk State Medical University
Neurotensin effect on the development of humoral immune response, and functional activity of macrophages and neutrophils were investigated in mice. It has been established that single and repeated injections of peptide in different doses (1 -100 mcg per 1 kg of body weight) cause stimulatory effect on antibody-forming cells content in the spleen and phagocytic activity of the neutrophils of peripheral blood. A single injection of neurotensin inhibits the adhesion capability of macrophages, but repeated ones stimulate it. These effects are probably explained by the changes in the continuum of regulatory peptides after neurotensin injection.
Key words: neurotensin, macrophages, neutrophils, humoral immune response.
В настоящее время установлено, что ней-ропептид нейротензин обладает ярко выраженной полифункциональностью [12]. Показано, что ему присущ широкий спектр физиологических эффектов, в том числе анальгети-ческое действие, влияние на терморегуляцию [13], секрецию в кишечнике [8]. Особый интерес представляют данные о влиянии нейро-пептида на течение воспалительного процесса [5]. Доказана способность нейротензина стимулировать функциональную активность гранулоцитов [6]. Вызывают интерес факты о возможности совместной локализации нейро-тензина с другими нейротрансмиттерами, в первую очередь, с опиоидами [9]. Совместная локализация нейротензина с другими пепти-
дами обусловливает возможность их совместного выделения при активации.
В то же время остается недостаточно изученным влияние нейротензина на иммунный ответ и показатели неспецифической резистентности как в нормальных условиях, так при различных патологических состояниях.
Целью нашего исследования явилось изучение эффектов нейротензина на развитие гуморального иммунного ответа (ГИО), а также функциональную активность макрофагов (МФ) и нейтрофилов периферической крови у экспериментальных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использованы мыши линии СВА обоего пола. О выраженности ГИО судили по
количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке. Для иммунизации животных в качестве антигена использовали эритроциты барана (ЭБ). Через 5 суток после иммунизации мышей выводили из опыта. Число АОК к ЭБ определяли с использованием камер Конгейма [3]. Функциональную активность нейтрофилов (ФАН) оценивали традиционными методами [2] и определяли: фагоцитарный индекс (ФИ) - процентное содержание нейтрофилов, проявляющих фагоцитарную активность, фагоцитарное число (ФЧ) - количество поглощенных микроорганизмов в расчете на 1 фагоцитирующую клетку. При исследовании адгезивной способности перитонеальных МФ клетки культивировали в стеклянных чашках Петри в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа [3]. Затем неприлипшие клетки удалялись. Готовили препараты исходной взвеси перитонеальных МФ и взвеси неприлипших клеток, окрашивали по Романовскому-Гимзе. Определяли процентное содержание прилипающих и неприлипающих МФ.
Раствор нейротензина (фирма "Sigma", США) вводили подкожно однократно за 1 или 4 суток до исследования содержания АОК. При изучении влияния пептида на ФАН и адгезивную способность МФ препарат вводили подкожно однократно за 1 сутки до эксперимента.
При изучении влияния многократного введения нейротензина на исследуемые показатели (содержание АОК, ФАН и адгезивная способность МФ) препарат применяли подкожно ежедневно в течение 5 суток до эксперимента. И при однократном, и при многократном введении нейротензин вводили в дозах: 1, 3, 10, 30 и 100 мкг на кг массы тела. Результаты исследований обработаны статистически с использованием критерия Стью-дента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что введение нейротензина в первые сутки после иммунизации оказывает стимулирующее влияние на содержание АОК
в селезенке мышей при использовании пептида в дозах 1, 30 и 100 мкг на кг массы тела (табл. 1.). Наиболее выраженный эффект наблюдается при применении препарата в минимальной дозе - 1 мкг на кг (р<0,05). При введении пептида в дозах 3 и 10 мкг на кг также отмечается некоторое повышение числа АОК в селезенке мышей, однако эффект не является статистически достоверным (р>0,05).
В следующей серии экспериментов нейротензин вводили в тех же дозах на 4 сутки после иммунизации. Также установлено стимулирующее влияние пептида на выраженность ГИО (табл. 1). Увеличение содержания АОК отмечается при введении препарата в дозах 1, 3, 10 и 100 мкг на кг. Наиболее выраженный эффект показан при применении нейротензина в дозе 3 мкг на кг (р<0,05). При введении препарата в дозе 30 мкг на кг статистически достоверного увеличения содержания АОК в селезенке мышей не установлено (р>0,05).
Влияние нейротензина на состояние неспецифической резистентности оценивали по показателям адгезивной способности МФ брюшной полости и ФАН. Установлено, что при использовании нейротензина в дозе 30 мкг на кг массы тела отмечается снижение адгезивной способности макрофагов к стеклянной поверхности на 15,7% (р<0,05) (табл. 1). Введение препарата в дозах 1, 3, 10 и 100 мкг на кг не оказывает существенного влияния на адгезивную способность МФ.
В наших экспериментах установлено, что нейротензин при его введении во всех изучаемых дозах оказывает стимулирующее действие на ФАН (табл. 1). Наиболее выраженное усиление наблюдается при применении пептида в дозе 3 мкг на кг. Так, повышение ФИ составило 27,3% (р<0,01), ФЧ - 50% (р<0,01). Наименьшее стимулирующее влияние отмечено при использовании нейротен-зина в дозе 1 мкг на кг, но и оно было статистически достоверным: ФИ - на 11,6% (р<0,05), ФЧ - на 40,2% (р<0,01).
Показано стимулирующее влияние нейро-тензина на содержание АОК в селезенке мышей СВА при его подкожном введении в те-
Таблица 1
Влияние однократного введения нейротензина на содержание АОК в селезенке, функциональную активность нейтрофилов и адгезивную способность макрофагов (M±m)
Изучаемые показатели Группы животных Содержание АОК в селезенке (млн. на орган) Фагоцитарный индекс (%) Фагоцитарное число % содержания прилипающих МФ
Введение нейротензина за 4 дня до эксперимента Введение нейро-тензина за 1 день до эксперимента
Контрольная группа 10167,9±713,1 9132,7±1543,1 58,6±2,4 1,64±0,13 81,8±2,1
Получавшие нейротензин в дозе 1 мкг/кг 18375,0±1589,1* 13714,0±1209,7* 65,4±1,7* 2,30±0,11** 83,9±1,2
Получавшие нейротензин в дозе 3 мкг/кг 12720,5±955,9 15318,2±1403,2* 74,6±1,3** 2,46±0,14** 83,4±1,9
Получавшие нейротензин в дозе 10 мкг/кг 13063,0±1261,6 13487,0±1013,3* 67,6±2,0** 2,16±0,17** 74,6±3,2
Получавшие нейротензин в дозе 30 мкг/кг 17339,1±1654,6* 10246,5±1156,1 71,4±1,9** 2,31±0,11** 70,7±2,2*
Получавшие нейротензин в дозе 100 мкг/кг 15073,6±1106,4* 14580,1±1215,0* 70,8±1,7** 2,42±0,10** 76,0±3,0
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой;
** - р<0,01 в сравнении с контрольной группой.
чение 5 суток до проведения исследования. Наиболее выраженный эффект отмечается при использовании пептида в дозах 1 и 100 мкг на кг массы тела (р<0,01) (табл. 2). При введении нейротензина в дозах 3 и 10 мкг на кг массы тела стимулирующее влияние пептида выражено в меньшей степени (р<0,05). Применение исследуемого препарата в дозе 30 мкг на кг массы тела не оказывает существенного влияния на содержание АОК в селезенке.
В отличие от однократного введения применение пептида многократно вызывало усиление адгезивной способности МФ. Однако такое действие выражено только при использовании нейротензина в дозах 10 и 100 мкг на кг массы тела (табл. 2) (р<0,05). Введение препарата в дозах 1, 3, 30 мкг на кг массы тела не оказывает существенного влияния на адгезивную способность МФ.
В наших экспериментах показано стимулирующее действие нейротензина на ФАН при его многократном применении. Это проявляется как увеличением ФИ, так и повышением ФЧ, причем подъем последнего показателя более значительный и наблюдается при введении всех исследуемых доз препарата (табл. 2). Увеличение ФИ отмечено при применении пептида в дозах 10 и 100 мкг на кг массы тела.
Таким образом, нами установлено разнонаправленное влияние нейротензина при его однократном или многократном подкожном введении на показатели специфической и неспецифической резистентности. Анализ действия препарата на исследуемые показатели позволяет сделать вывод о дозозависимом характере его эффектов. Также показана зависимость выраженности действия пептида на ГИО от сроков и кратности введения. При
Таблица 2
Влияние многократного введения нейротензина на содержание АОК в селезенке, функциональную активность нейтрофилов и адгезивную способность макрофагов (M±m)
Изучаемые ^"\^показатели Группы животных Содержание АОК в селезенке (млн. на орган) Фагоцитарный индекс (%) Фагоцитарное число % содержания прилипающих МФ
Контрольная группа 11183,3±1053,3 58,0±2,3 1,61±0,10 82,1±1,3
Получавшие нейротензин в дозе 1 мкг/кг 19977,6±1876,2** 63,6±2,6 2,34±0,14** 81,6±1,0
Получавшие нейротензин в дозе 3 мкг/кг 17105,9±2230,2* 58,9±3,0 2,41±0,14** 81,9±0,9
Получавшие нейротензин в дозе 10 мкг/кг 15809,6±1253,5* 66,0±2,4* 2,64±0,14** 85,7±0,8*
Получавшие нейротензин в дозе 30 мкг/кг 8785,0±816,6 69,1±2,4 2,72±0,12** 81,8±0,9
Получавшие нейротензин в дозе 100 мкг/кг 19319,1±1557,4** 65,8±2,4* 2,45±0,21** 85,3±0,9*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой;
** - р<0,01 в сравнении с контрольной группой.
общей стимулирующей направленности эффекта как при однократном применении препарата на 1, так и на 4 сутки после иммунизации степень его влияния существенно различалась.
Показаны отличия однократного и многократного введения нейротензина на адгезивную способность МФ. Если однократное применение пептида угнетает исследованный показатель, то многократное - оказывает стимулирующий эффект. Эти данные позволяют говорить о зависимости влияния препарата от кратности его применения. Выраженное усиление ФАН показано нами как при однократном, так и многократном введении нейротен-зина в широком диапазоне доз.
В настоящее время сформулирована концепция о едином континууме регуляторных пептидов [1], составной частью которого является и нейротензин. Изменение активности одного из компонентов вызывает существенные сдвиги в системе в целом, которые по своей продолжительности значительно превосходят время полужизни отдельных пептидов. Именно с изменением функционального состояния регуляторного континуума в целом, связано, по нашему мнению, выражен-
ное влияние однократного применения ней-ротензина, поскольку устойчивость его к действию эндопептидаз невысока [7]. В этой связи представляют особый интерес данные о тесном взаимодействии исследуемого нейро-пептида с опиоидами [9].
Многочисленные исследования указывают на модулирующий характер действия ре-гуляторных пептидов. Нами также показано аналогичное влияние изучаемого нейропеп-тида, что подтверждается зависимостью его эффектов от кратности и сроков применения используемой дозы. Высказываются предположения о существовании нескольких типов рецепторов к нейротензину [10]. Именно взаимодействие с различными рецепторами может, по нашему мнению, служить объяснением дозозависимого характера эффектов пептида.
Нейротензин при периферическом введении практически не проникает через гемато-энцефалический барьер [4, 11] и характеризуется коротким периодом полужизни, длительность которого составляет от 2 до 6 минут [7], поэтому полученные нами эффекты связаны с его периферическим действием через специфические рецепторы, представлен-
ные в различных тканях. Вопрос о существовании рецепторов к нейротензину на имму-нокомпетентных клетках остается до конца не выясненным.
Следовательно, можно сделать заключение.
1. Введение нейротензина оказывает стимулирующее влияние на содержание АОК в селезенке мышей. Показана зависимость его эффектов от использованной дозы, сроков и кратности применения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность. - Биохимия. - 1986. - Т. 51, № 4. -С. 531-542.
2. Галанкин В.Н., Юнусходжаев Э.Х., Токмаков А.М. и др. Способ определения фагоцитарной активности полиморфноядерных ней-трофилов.- Архив патологии. - 1987. - Т. 49, № 6. - С. 77-79.
3. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.
4. Марьянович А.Т., Поляков Е.Л. Нейропептиды и гематоэнцефалический барьер.- Успехи фи-зиол. наук. - Т. 22, № 2. - С. 33-46.
5. Castagliuolo I., Wang C.C., Valenick L. et al. Neurotensin is a proinflammatory neuropeptide in colonic inflammation.- Journ. Clin. Invest. -1999. - Vol. 103, N 6. - P.96-104.
6. Godlewski A., Brzezinski P.M. The effecton neurotensin on granulocyte functions in vitro.- Folia Histochem. Cytobiol. - 1999. - Vol.37, N 2. - P. 121-131.
7. Holtom P.E., Wasuntarawat C., Moss S.H. et. al. A highly sensitive and selective radioimmunoassay for the measurement of neurotensin.- Journ. Neurosci. Methods. - 2000. - Vol. 100, N 1-2. -P. 151-156.
2. Нейротензин при однократном и многократном введении оказывает разнонаправленное влияние на адгезивную способность МФ, угнетение наблюдается при однократном применении в дозе 30 мкг на кг массы тела, а стимуляция - при многократном в дозах 10 и 100 мкг на кг массы тела.
3. Исследуемый пептид вызывает значительное повышение ФАН при его применении в широком диапазоне доз и различной кратности введения.
8. Riegler M., Castagliuolo I., Wang C. et al. Neurotensin stimulates Cl(-) secretion in human colonic mucosa in vitro: role of adenosine.- Gastroenterology. - 2000. - Vol. 119, N 2. - P. 348-357.
9. Stiller C.O., Gustafsson H., Fried K. et al. Opio-id-induced release of neurotensin in periaqueductal gray matter of freely moving rats. - brain Res. - 1997. - Vol. 774, N 1-2. - P. 149-158.
10. Tyler-McMahon B.M., Cusack B., Douglas C.L. et al. Evidence for additional neurotensin subtypes: neurotensin analogs that distinguish between neurotensin-mediated hypothermia and an-tinociception. - Brain Res. - 1998. - Vol. 792, N 2. - P. 246-252.
11. Tyler-McMahon B.M., Douglas C.L., Fauq A. et al. In vitro binding and CNS effects of novel neu-rotensin agonists that cross the blood-brain barrier. - Neuropharmacology. - 1999. - Vol. 38, N 7. - P. 1027-1034.
12. Tyler-McMahon B.M., Boules M., Richelson E. Neurotensin: peptide for the next millennium. -Regul. Pept.. - 2000. - Vol. 404, N 1-2. - P. 6978.
13. Tyler-McMahon B.M., Stewart J.A., Farinas F. et al. Highly potent neurotensin peptide analog that causes hypothermia and antinociception.- Eur. Journ. Pharmacy. - 2000. - Vol. 390, N 1-2. - P. 107-111.
