ВЛИЯНИЕ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ТЕРАПИИ НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ В ТКАНИ ЖЕЛУДКА

Спирина Л.В.; Августинович А.В.; Афанасьев С.Г.; Волков М.Ю.

DOI: 10.18027/2224-5057-2020-10-29-34

Цитирование: Спирина Л. В., Августинович А. В., Афанасьев С. Г., Волков М. Ю. Влияние неоадъювантной терапии на экспрессию молекулярных маркеров в ткани желудка. Злокачественные опухоли. 2020;10(1): 29-34

ВЛИЯНИЕ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ТЕРАПИИ НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ В ТКАНИ ЖЕЛУДКА

Л.В. Спирина1, 2, А. В. Августинович1, С. Г. Афанасьев1, М. Ю. Волков1

1. Научно-исследовательский институт онкологии, ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», Томск, Россия

2. ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск, Россия

Резюме: Рак желудка (РЖ) остается одной из ведущих причин смерти от злокачественных новообразований. Известно, что его патогенез представляет собой многоступенчатый и гетерогенный процесс с широким спектром генетических изменений. Среди ведущих механизмов выделяют нарушение регуляции важнейших сигнальных путей клетки, что определяет нарушения клеточного цикла, дифференцировки клеток, процессов репарации ДНК, апоптоза и ведет к развитию злокачественной опухоли.

Цель работы: исследование экспрессии компонентов AKT/m-TOR сигнального пути и AMPK в ткани опухоли у больных раком желудка на фоне химиотерапии по схеме FLOT.

Материалы и методы. В исследование было включено 24 больных раком желудка. Пациенты получали комбинированное лечение, включающее неоадъювантную химиотерапию по схеме FLOT, хирургическое вмешательство. Материалом исследования была нормальная и опухолевая ткань, полученная при проведении диагностической гастроскопии у пациентов. Уровень мРНК изучаемых показателей определялся методом ПЦР в реальном времени.

Результаты и их обсуждение. Значимые изменения происходили при исследовании уровня показателей после лечения. Отмечено, что на фоне неадъювантной терапии происходит снижение экспрессии 4EBP1 в 2,2 раза по сравнению с его уровнем до начала лечения. При этом эффект лечения был связан с комплексом показателей, позволяющих предсказывать его еще до начала комбинированной терапии. Отмечено снижение экспрессии 4EBP, mTOR и AMPK по мере уменьшения эффекта терапии в группах пациентов с полной регрессией, частичной регрессией, стабилизацией и прогрессированием заболевания.

Заключение. Снижение экспрессии 4EBP1 выявлено в ткани рака желудка под влиянием неоадъювантной терапии. Молекулярные маркеры, способные предсказывать развитие резистентности к противоопухолевой терапии, связаны с особенностями AKT/mTOR сигнального пути. Изначально высокая экспрессия AMPK, mTOR и 4EBP1 является ключевым событием, опосредующим развитие эффекта неоадъювантной терапии при раке желудка.

Ключевые слова: рак желудка, молекулярные маркеры, неоадъювантная терапия

ВВЕДЕНИЕ

Рак желудка (РЖ) остается одной из ведущих причин смерти от злокачественных новообразований. Известно, что его патогенез представляет собой многоступенчатый и гетерогенный процесс с широким спектром генетических изменений [1]. Среди ведущих механизмов выделяют дисрегуляцию важнейших сигнальных путей клетки, что определяет нарушения клеточного цикла, дифференцировки клеток, процессов репарации ДНК, апоптоза и ведет к развитию опухоли [2,3].

Белковый и энергетический обмен являются ключевыми механизмами, определяющими жизнеспособность клетки, в том числе и опухолевой, и связаны с 5'АМФ-ак-

тивируемой протеинкиназой (АМРК) и серин/треониновой протеинкиназой тТОк [3,4]. Выявлены неоднозначные данные о роли АМРК в онкогенезе. Известно, что активация данной протеинкиназы может сопровождаться развитием противоопухолевого эффекта [5]. Также имеются сведения, что АМРК связана с развитием резистентности к химиоте-рапевтическому лечению при РЖ [6]. Роль киназы тТОк в онкогенезе разнообразна. Она интегрирует различные сигнальные пути, в том числе АКТ/тТОк, которые активируются под влиянием ростовых факторов и митогенов [7].

Среди молекулярных механизмов развития РЖ сигнальный путь АКТ/тТОк занимает особое значение. Стоит отметить, что он представляет собой универсальный внутриклеточный каскад, влияющим на все процессы

онкогенеза [2,8]. Показано, что в ткани опухоли желудка наблюдается увеличение экспрессии всех компонентов данного каскада, за исключением mTOR и AKT, уровни которых снижались на фоне роста фосфатазы PTEN [9].

В настоящее время имеются скудные сведения о маркерах, способных предсказывать эффект неоадъювантной терапии при РЖ. В частности, известно, что уровень экспрессии гена AKT может прогнозировать эффект химиотерапии при РЖ [10,11]. Полагают, что в этом участвует комплекс молекулярных показателей, например, компоненты AKT/mTOR сигнального каскада [12,13], формирующие чувствительность к лечению и непосредственно связанные с аутофагией [6].

Полагают, что изменение изучаемых молекулярных маркеров представляют собой наиболее универсальный подход для оценки эффективности терапии опухолей различного происхождения [13]. Известно, что эффект химиотерапии на основе 5-фторурацила и цисплатина связан с изменением экспрессионных профилей компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов и маркеров ауто-фагии [8, 14]. В целом влияние неоадъювантной терапии на экспрессию компонентов AKT/m-TOR сигнального пути и AMPK не изучена.

ЦЕЛЬ

Цель работы заключалась в исследовании экспрессии компонентов AKT/m-TOR сигнального пути и AMPK в ткани опухоли у больных РЖ на фоне химиотерапии по схеме FLOT.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование было включено 24 больных раком желудка, получавших 3 курса химиотерапии по схеме FLOT (доцетаксел-50 мг/м2, в/в, капельно 1 день, оксалиплатин 85 мг/м2 2-часовая в/в инфузия в 1-день, фолинат кальция (лейковорин) 200 мг/м2 2-часовая в\в инфузия в 1-й, 5-фторурацил 2400 мг/м2 в/в 46-48-часовая инфузия в 1-й день. Оценка эффективности комбинированного лечения больных местнораспространённым РЖ проводилась по шкале RECIST. Полная регрессия отмечена у 3 пациентов, частичная регрессия опухоли была выявлена 6 пациентов, стабилизация — у 11 и прогрессирование — у 4. Материалом исследования была нормальная и опухолевая ткань, полученная при проведении диагностической гастроскопии у пациентов после оперативного лечения; образцы после забора замораживались и хранились при t-800C.

Проведение данной работы одобрено этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ. Все процедуры с вовлечением больных были проведены в соответствии с Протоколом Хельсинской декларации по правам человека (1964 г.) Все больные подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК

РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany). Для оценки количества выделенной РНК на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделенной РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1,95-2,05; А260/А230 = 1,90-2,31. Целостность РНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA). RIN составил 5,6-7,8.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCycler (Bio-Rad, USA). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора OT m-MuLV-RH (БиоЛабмикс, Россия) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставили в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (БиоЛабмикс, Россия), 300 нМ прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК. 4E-BP1: F 5'- CAGCCCTTTCTCCCTCACT-3', R 5'-TTCCCAAGCACATCAACCT-3';

AKT1: F 5'-CGAGGACGCCAAGGAGA-3',

R 5'-GTCATCTTGGTCAGGTGGTGT-3'; С-RAF: F 5'- TGGTGTGTCCTGCTCCCT-3',

R 5'-ACTGCCTGCTACCTTACTTCCT-3'; GSK3b: F 5'- AGACAAGGACGGCAGCAA-3',

R 5'-TGGAGTAGAAGAAATAACGCAAT-3';

70S kinase alpha: F 5'-CAGCACAGCAAATCCTCAGA-3', R 5'-ACACATCTCCCTCTCCACCTT-3'; m-TOR: F 5'-CCAAAGGCAACAAGCGAT-3', R 5'-TTCACCAAACCGTCTCCAA-3';

PDK1: F 5'-TCACCAGGACAGCCAATACA-3', R 5'-CTCCTCGGTCACTCATCTTCA-3';

VHL: F 5'-GGCAGGCGAATCTCTTGA-3',

R 5'-CTATTTCCTTTACTCAGCACCATT-3' AMPK: F 5'- AAGATGTCCATTGGATGCACT-3', R 5'-TGAGGTGTTGAGGAACCAGAT-3'; GAPDH: F 5'-GGAAGTCAGGTGGAGCGA-3',

R 5'-GCAACAATATCCACTTTACCAGA-3'.

Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл — 94 °С, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов — 1 шаг 94 °С, 10 сек и 2 шаг 20 сек — при температуре 60 °С. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih. gov/nuccore).

В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase), уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводили по 2ДДО: по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену-рефери фермента GAPDH.

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 8.0. Проверку нормальности проводили с помощью с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Результаты определения экспрессии генов представлены как Me (Q1; Q3). Значимость различий оценивали по критерию Манна-Уитни, при исследовании более 2 групп использовали непараметрический дисперсионный анализ (Kruskal-Wallis test, Median Test). Различия считали значимыми при р < 0,05. Корреляционный анализ проводился с помощью непараметрического критерия Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ранее проведенных исследованиях отмечены изменения экспрессии AKT/mTOR сигнального каскада, связанные с распространенностью РЖ. Отмечено увеличение экспрессии всех компонентов данного каскада, за исключением mTOR и AKT, которые снижались на фоне роста фосфатазы PTEN [9].

При исследовании уровня показателей после проведенной неоадъювантной терапии выявлено снижение экспрессии 4EBP1 в 2,2 раза в ткани опухоли.

Отмечены ассоциации между молекулярными параметрами в опухоли, характеризующие биологическое поведение опухоли.Так, выявлены многочисленные корреляции между киназой AMPK, PTEN (r = 0,39; p < 0,05), mTOR (r = 0,37, p < 0,05), 70S 6 киназой (r = 0,54; p < 0,05). При этом экспрессия киназы c-RAF имела ассоциацию с PDK (r = 0,50; p < 0,05), а 70S 6 киназа имела отрицательную ассоциацию с AKT (r =-0,37; p < 0,05).

Таблица 1. Влияние неоадъювантной терапии на экспрессию компонентов AKT/mTOR сигнального пути и АМРК опухоли желудка

Примечание: * — значимость различий по сравнению с показателем до лечения, р <0,05;

При исследовании изучаемых показателей в зависимости от эффекта лечения отмечено изменение экспрессии 4EBP, mTOR, AMPK по мере уменьшения эффекта терапии в группах пациентов с полной регрессией, частичной регрессией, стабилизацией и прогрессированием заболевания (табл. 2). Наиболее высокий уровень мРНК показателей представлен у пациентов с полной регрессией.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования показано влияние неоадъювантной терапии на молекулярные маркеры при раке желудка. Известно, что уровень mTOR ассоциирован с экспрессией его субстратов — 70S 6 киназы и 4EBP1 и AMPK [4]. Так, снижение экспрессии гена 4EBP1 является отражением эффекта противоопухолевой терапии при изменении уровня мРНК гена mTOR. При этом существующие взаимодействия между молекулярными маркерами, вероятно, опосредуют биологические особенности опухоли, которые и определяют развитие ин-вазивного потенциала опухоли.

При проведении корреляционного анализа были выявлены ассоциации между изучаемыми молекулярными маркерами, свидетельствующие о влиянии АМРК на состояние основных компонентов изучаемого внутриклеточного каскада. Известно, что активация AMPK может сопровождаться фосфорилированием mTOR, p70S6K и 4E-BP1, способствуя снижению интенсивности основных процессов онкогенеза в культуре клеток РЖ [5]. Также выявлено, что развитие резистентности при РЖ связано с активацией АМРК и ингибированием компонентов AKT/ mTOR сигнального каскада [6,14].

В настоящее имеются единичные неоднозначные сведения о связи молекулярных маркеров с эффектом неоадъювантной терапии. Полагают, что резистентность к лечению связана с развитием аутофагии, что происходит с участием основных компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов [3]. В проведенном исследовании выявлено, что экспрессия 4EBP1, AMPK и mTOR связана с эффективностью проведенной химиотерапии. Показано, что изначально высокие уровни экспрессии 4EBP, mTOR, AMPK ассоциированы с регрессией опухоли и ее чувствительностью к неоадъювантной терапии. Вероятно, это объясняется их ролью в формировании биологического поведения опухоли, что подтверждается ранее представленными данными [5,6].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неоадъювантная терапия при РЖ влияет на уровень экспрессии гена 4EBP1 в опухоли. Выявлены молекулярные маркеры, ассоциированные с эффектом лечения и развитием резистентности. Высокая экспрессия AMPK, mTOR и 4EBP1 в опухоли до начала лечения опосредует эффект при комбинированной терапии РЖ и связана с регрессией опухоли.

Показатель, Усл. ЕД. До лечения После лечения

PDK 1,54 (0,35; 6,89) 1,25 (0,06; 9,49)

AKT 0,99 (0,21; 2,21) 1,95 (1,58; 76,00)

c-RAF 6,77 (1,27; 29,60) 15,07 (6,57; 120,76)

GSK-3ß 1,95 (0,30; 16,84) 1,12 (0,02 2,29)

PTEN 2,13 (0,20; 9,78) 7,18 (0,00 29,82)

mTOR 0,99 (0,19; 1,62) 4,74 (0,15 6,83)

4EBP1 3,1 (0,45; 56,87) 1,41 (0,48 15,62) *

70s 6 киназа 3,92 (0,54; 15,40) 8,02 (0,26; 32,66)

АМРК 1,45 (0,11; 7,95) 11,10 (0,07; 65,38)

Таблица 2. Экспрессия компонентов AKT/mTOR сигнального пути и АМРК в ткани опухоли желудка до лечения в зависимости от эффективности терапии

Показатель, Усл. ЕД. Полная регрессия Частичная регрессия Стабилизация Прогрессирование

PDK 0,07 (0,06; 0,09) 0,86 (0,01; 5,17) 3,15 (0,30; 7,11) 14,18 (1,64; 25,72)