CC BY
33
ОЦЕНКА К В ТКАН.. „ И ИХ СВЯЗИ
НИИ онкол
ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии опухолей1
т____г____,—^^ы биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики2;
I. Усынин, к.м.н., старший научный сотрудник отделения общей онкологии1; доцент кафедры онкологии2; А. Юрмазов, врач отделения общей онкологии1; 1.В. Кондакова, д.м.н., профессор, зав. лабораторией биохимии опухолей1; лонимская, д.м.н., профессор кафедры онкологии3
онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра РАН, 5, пер. Кооперативный, Томск, 634009;
2Сибирский государственный медицинский университет, 2, ул. Московский тракт, Томск, 634050; 3Санкт-Петербургский государственный университет, Университетская набережная, 7-9, Санкт-Петербург, 199034
Цель исследования — оценить роль экспрессии компонентов AKT/mTOR-сигнального пути в молекулярных механизмах развития и прогрессирования рака почки.
Материалы и методы. Предметом исследования служила опухолевая и неизмененная ткань 34 больных светлоклеточным раком почки T1-3N0-1M0-1. Уровень мРНК PTEN, AKT, GSK-3beta, PDK1, c-RAF, mTOR, киназы p70 S6, 4E-BP1 был исследован методом ПЦР в реальном масштабе времени, а содержание изучаемых показателей определялось методом вестерн блоттинга.
Результаты. Установлено, что уровень мРНК AKT, фосфатазы PTEN и содержание соответствующих белков связаны с развитием гематогенного метастазирования. Увеличение содержания киназы АКТ при росте ее экспрессии сочетается со снижением уровня белка и количества мРНК фосфатазы PTEN. Показано, что особенности трансляции мРНК в опухолевой ткани также могут определять развитие заболевания. При проведении корреляционного анализа отмечено отсутствие прямых связей между уровнем экспрессии изучаемых компонентов и их белковых продуктов.
Заключение. Молекулярные механизмы опухолевой прогрессии при раке почки связаны с особенностями экспрессии компонентов и содержанием их белков. Уровни мРНК AKT, PTEN, 4E-BP1 и GSK-3beta ассоциированы с развитием метастатического процесса при раке почки.
Ключевые слова: рак почки; AKT/mTOR-сигнальный путь; экспрессия mTOR; фосфатаза PTEN; AKT; GSK-3beta; PDK1; c-RAF; киназа p70 S6; 4E-BP1.
Как цитировать: Spirina L.V., Usynin E.A., Yurmazov Z.A., Kondakova I.V., Slonimskaya E.M. Assessment of AKT/mTOR signaling pathway componentsin kidney cancers and their connection with metastases. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 74-81, https:// doi.org/10.17691/stm2019.11.4.08
English
Assessment of AKT/mTOR Signaling Pathway Components in Kidney Cancers and Their Connection with Metastases
L.V. Spirina, MD, DSc, Associate Professor, Leading Researcher, Laboratory of Tumor Biochemistry1; Professor, Department of Biochemistry and Molecular Biology with a Course of Clinical Laboratory Diagnostics2; E.A. Usynin, MD, PhD, Senior Researcher, Department of General Oncology1; Associate Professor, Department of Oncology2;
Z.A. Yurmazov, Physician, Department of General Oncology1;
I.V. Kondakova, MD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of Tumor Biochemistry1;
E.M. Slonimskaya, MD, DSc, Professor, Department of Oncology3
Для контактов: Спирина Людмила Викторовна, e-mail: spirinalv@oncology.tomsk.ru /////////////////////^^^^
74 СТМ J 2019 J том 11 J №4 Л.В. Спирина, Е.А. Усынин, З.А. Юрмазов, И.В. Кондакова, Е.М. Слонимская
1Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, 5 Kooperativny St., Tomsk, 634009, Russia;
2Siberian State Medical University, 2 Moskovsky trakt, Tomsk, 634050, Russia;
3Saint Petersburg State University, 7-9 Universitetskaya naberezhnaya, Saint Petersburg, 199034, Russia
The aim of the study was to assess gene expression of the AKT/mTOR signaling pathway components in the molecular mechanisms of kidney cancer development and progression.
Material and Methods. The subject of the study was a tumor and non-transformed tissue of 34 patients with clear cell kidney cancer T1-3N0-1M0-1. The mRNA level of PTEN, AKT, GSK-3beta, PDK1, c-RAF, mTOR, p70 S6 kinase, 4E-BP1 was studied by real-time PCR, the content of the parameters studied was determined by Western blotting.
Results. The AKT, PTEN mRNA levels, and the protein content were associated with the development of hematogenous metastasis. The increase of AKT content and expression is associated with the decrease in mRNA and protein level of PTEN phosphatase. The specificity of mRNA translation in the tumor tissue has been shown to determine the development of the disease as well. The correlation analysis did not find direct relationship between the level of expression of the studied genes and their protein products.
Conclusion. Molecular mechanisms of tumor progression are associated with gene expression and protein content. The change in AKT, PTEN, 4E-BP1, and GSK-3beta mRNA levels has been found to lead to the development of a metastatic process in kidney cancer.
Key words: kidney cancer; AKT/mTOR signaling pathway; mTOR; PTEN phosphatase; AKT; GSK-3beta; PDK1; c-RAF; p70 S6 kinase; 4E-BP1.
Введение
Фосфатидилинозитол-3-киназный AKT/mTOR-сиг-нальный путь (PI3K/AKT/mTOR) активируется под влиянием многих ростовых факторов и осуществляет регуляцию процессов деления клетки и ее апоптоза. Его составляющие участвуют в молекулярных механизмах развития и прогрессирования рака почки и являются мишенями для таргетной терапии заболевания [1, 2]. Они представлены фосфоинозитид-3-кина-зой (PI3K), киназами AKT и mTOR, однако, учитывая значимость последних, каскад часто называют AKT/ mTOR. Активация протеинкиназы AKT происходит при действии PDK1 (pyruvate dehydrogenase kinase) и ферментативного комплекса mTORC2, в который входят, помимо mTOR, также mLST8 (mammalian lethal with Sec13 protein 8), известный как GpL (G-protein p-subunit-like protein); rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR); mSinl (mammalian stress-activated protein kinase (SAPK)-interacting protein 1); protor (protein observed with rictor) [3].
Субстратами киназы AKT являются множество белков, участвующих в процессах роста, пролиферации клеток и апоптозе. В качестве ключевых рассматриваются c-RAF (serine/threonine-protein kinase) и фермент обмена гликогена GSK-3beta (glycogen synthase kinase-3beta) [4, 5]. AKT также играет существенную роль в активации рапамицин-чувстви-тельного комплекса mTORCI, состоящего из mTOR, raptor (regulatory-associated protein of TOR), mLST8 и PRAS40 (proline-rich PKB/AKT substrate 40 kDa) [6].
Протеинкиназа mTOR, как было описано выше, существует в клетке в качестве субъединицы внутриклеточных мультимолекулярных сигнальных комплексов mTORCI и mTORC2 [7]. Важнейшими субстратами mTOR в комплексе mTORCI являются киназа p70 S6 (киназа рибосомального белка S6) и 4E-BP1 (инициирующий фактор 4E связывающий протеин 1) [8-10],
которые служат ключевыми регуляторами трансляции мРНК и стимулируют биосинтез белков.
Активность AKT-сигнального пути находится под контролем фосфатазы PTEN [11]. Она катализирует отщепление фосфатной группы в положении 3D-инозитольного кольца фосфатидилинозитол-3-фос-фатов, тормозя передачу сигнала по PI3K/AKT/mTOR-сигнальному пути. К белковым субстратам PTEN относится также фосфатаза PHLPP (PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase), которая катализирует отщепление фосфатной группы по положению Ser473 в молекуле AKT. Повышение активности этого фермента приводит к активации апоптоза и замедлению пролиферации клеток опухолей, что позволяет отнести его к значимым белкам-онкосупрессорам [12]. Известно, что транскрипционный фактор HIF-1 также может стимулировать активность протеинкиназы mTOR [5].
Активация данного сигнального пути показана при различных видах опухолевых заболеваний [13]. Однако в отношении опухолей почек данные весьма противоречивы. Так, по мнению D.A. Almatore и соавт. [14], только в 40% опухолевых клеток при раке почки выявляется активация AKT/mTOR-сигнального каскада. Известны факты, свидетельствующие о том, что в ткани светлоклеточной опухоли почки наблюдается выраженная гиперэкспрессия AKT-сигнального пути с увеличением содержания его компонентов [15-17]. В ткани рака почки они могут иметь различные значения в зависимости от размера первичной опухоли и наличия гематогенных метастазов заболевания [18, 19]. При этом уровень экспрессии изучаемых метаболитов и их связь с содержанием белковых компонентов в ткани светло-клеточного рака почки практически не изучались.
Большинство исследователей придерживаются той точки зрения, что в онкогенезе большое значение имеет соотношение уровня экспрессии компонентов и содержания соответствующих белков, что определяет биологические особенности опухолевого роста и
прогноза заболевания [20]. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии компонентов АКТ-сигнального пути, субстратов mTOR и содержания их белковых продуктов в ткани рака почки в зависимости от распространенности опухолевого процесса.
Материалы и методы
В исследование включено 34 больных светлокле-точным раком почки Т1-:^0-1М0-1 (средний возраст — 57,6±2,2 года). В зависимости от размера первичной опухоли пациенты распределились следующим образом: у 10 больных новообразование соответствовало Т1, у 14 — Т2 и у 10 — Т3. Локализованная форма заболевания (Т1-3^М0) выявлена у 24 пациентов, диссеминированная — у 10. Объемы диагностики и лечения больных раком почки соответствовали рекомендуемым алгоритмам по диагностике и лечению злокачественных новообразований, утвержденным Министерством здравоохранения РФ.
Проведение данной работы одобрено Этическим комитетом НИИ онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра РАН. Все процедуры с вовлечением больных были выполнены в соответствии с протоколом Хельсинкской декларации по правам человека (2013). Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Материалом для изучения являлись образцы опухолевой и гистологически не измененной ткани, находящиеся на расстоянии не менее 1 см от границы опухо-
Таблица 1
Последовательность праймеров проб исследованных компонентов
Компоненты Ампликон, п.н. Последовательность
4E-BP1 NM 004095.3 244 F 5 '-CAGCCCTTTCTCCCTCACT-3' R 5 '-TTCCCAAGCACATCAACCT-3'
AKT1 NM 001014431.1 181 F 5 -CGAGGACGCCAAGGAGA-3' R 5 -GTCATCTTGGTCAGGTGGTGT-3'
с-RAF NM 002880.3 152 F 5 '-TGGTGTGTCCTGCTCCCT-3' R 5 '-ACTGCCTGCTACCTTACTTCCT-3'
GSK-3beta NM 001146156.1 267 F 5 -AGACAAGGACGGCAGCAA-3' R 5 -TGGAGTAGAAGAAATAACGCAAT-3'
70S kinase alpha NM 001272042.1 244 F 5 -CAGCACAGCAAATCCTCAGA-3' R 5 -ACACATCTCCCTCTCCACCTT-3'
mTOR NM 004958.3 160 F 5 -CCAAAGGCAACAAGCGAT-3' R 5 -TTCACCAAACCGTCTCCAA-3'
PDK1 NM 001278549.1 187 F 5 -TCACCAGGACAGCCAATACA-3' R 5 -CTCCTCGGTCACTCATCTTCA-3'
GAPDH NM_001256799.2 138 F 5 -GGAAGTCAGGTGGAGCGA-3' R 5 -GCAACAATATCCACTTTACCAGA-3'
Примечание: NM — номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); F — прямой праймер; R — обратный праймер.
лей. Для проведения вестерн блоттинга после забора образцы тканей замораживали и хранили при -80°С. Для выделения мРНК и определения уровня относительной экспрессии образцы тканей помещали в раствор RNAlater (Ambion, США) и после 24-часовой инкубации при +4°С сохраняли при температуре -80°С.
Определение уровня экспрессии компонентов AKT/mTOR-сигнального пути
Выделение РНК. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Германия). Для определения количества выделенной РНК на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США) оценивали ее концентрацию и чистоту выделения. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл. Оценку чистоты выделенной РНК осуществляли путем подсчета отношения поглощения на длинах волн 260, 280 и 230 нм. Отношение А260/А280 составляло от 1,95 до 2,05; отношение А260/А230 — от 1,90 до 2,31. Целостность РНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies). RIN (RNA integrity number) — показатель, разработанный для выявления ошибок в оценке качества РНК, составил 5,6-7,8.
Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Уровень экспрессии компонента оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР RT-qPCR в режиме реального времени с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCy-cler (Bio-Rad Laboratories, США). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) со случайными гексануклеотидными прай-мерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставили в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific), 300 нмоль прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК.
Двухшаговая программа амплификации включала: 1 цикл — 94°С, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов: 1-й шаг — 94°С, 10 с и 2-й шаг — 20 с — при температуре 60°С. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) (табл. 1).
В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии GAPDH.
Определение содержания компонентов AKT/mTOR-сигнального пути Получение гомогенатов. Заморо-
женную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорида натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10 000 g и 4оС.
Электрофорез. Электрофорез проводили по Laemmli в 13% полиакриламидном геле.
Вестерн блоттинг. После электрофореза осуществляли перенос полипептидов на PVDF-мембрану (Immobylon; Millipore, США). Иммунодетекцию проводили с антителами к phospho-PTEN (Ser380), AKT (pan), phospho-AKT (T308), phospho-GSK-3beta (Ser9), phospho-PDK1 (Ser241), phospho-c-RAF (Ser259), m-TOR, phospho-mTOR (Ser2448), phospho-p70 S6 киназе (Ser371), phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (Cell Signaling, США). Затем мембрану подвергали обработке системой хемилюминесцентной детекции ECL (GE Healthcare, Великобритания). Плотность полос оценивали с помощью компьютерной программы ImageJ. Стандартизацию проводили относительно ß-актина. Результаты выражали в процентах от содержания показателей в неизмененной ткани.
Статистика. Статистическую обработку результатов выполняли с применением пакета программ Statistica 8.0. Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок, результаты представлены как M (медиана) с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Результаты экспрессии генов представлены как средняя ± ошибка средней (M±m). Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Непараметрический медианный тест и тест ANOVA Краскела-Уоллиса были использованы для сравнения двух и более независимых выборок. Наличие связи между изучаемыми показателями исследовали с использованием корреляционного анализа, для оценки силы связи между переменными рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).
Результаты и обсуждение
Проведенное исследование показало отсутствие значимых различий в экспрессии компонентов PTEN, AKT, GSK-3beta, PDK1, c-RAF в зависимости от размера первичной опухоли у больных раком почки (табл. 2). Подобное явление зафиксировано и для уровня мРНК протеинкиназы mTOR. При этом выявлен факт усиления экспрессии киназы 70 S6 в 4,2 раза у больных с размером опухоли, соответствующей T2N0M0, по сравнению с опухолью T1N0M0, и выраженное увеличение уровня мРНК ингибитора транскрипции 4E-BP1 в 8,3 раза у пациентов с размером опухоли T3N0Mqui по сравнению с опухолью Т^0М0. Однако проведение медианного теста и теста ANOVA Краскела-Уоллиса не подтвердило статистической значимости этих различий.
При изучении экспрессии данных показателей у больных с наличием и отсутствием признаков гематогенного метастазирования выявлено нарастание уровня мРНК киназы AKT и отвечающей за ее фосфо-рилирование протеинкиназы PDK1 в 7,4 и 1,87 раза соответственно. Также отмечено снижение экспрессии гена, регулирующего синтез гликогена GSK-3beta, в 2,2 раза в ткани опухоли при метастатическом раке почки по сравнению с локализованной формой заболевания (табл. 3). Описанные выше изменения сопровождались
Таблица 2
Относительная экспрессия компонентов AKT/mTOR-сигнального пути у больных раком почки в зависимости от размера первичной опухоли, усл. ед. (M±m)
Компоненты Стадия заболевания
T1NqMq (n=10) T2N0M0-1 (n=14) T3N0M0-1 (n=10)
Компоненты AKT/mTOR-сигнального пути
PTEN 13,4±7,5 2,4±1,1 41,1±15,0
AKT 20,1±12,5 7,2±4,4 2,5±0,8
GSK-3beta 40,7±17,0 54,7±32,5 9,5±0,9
PDK1 18,5±5,1 25,3±9,7 13,0±3,5
c-RAF 29,9±16,4 2,4±0,9 13,1±3,5
Протеинкиназа mTOR и ее субстраты
mTOR 49,1±26,0 9,0±3,4 5,6±2,8
Киназа p70 S6 8,3±2,7 35,1±14,4* 2,4±0,9
4E-BP1 7,5±4,1 10,0±4,8 62,1±26,6**
* — статистически значимые различия значений по сравнению с группой больных со стадией Т^0М0 (р<0,05); ** — по сравнению с группой больных со стадией Т2^М0-1 (р<0,05).
Таблица 3
Относительная экспрессия компонентов AKT/mTOR-сигнального пути у больных с локализованным и диссеминированным раком почки, усл. ед. (М±т)
Компоненты Локализованный рак почки (n=24) Диссеминированный рак почки (n=10)
Компоненты AKT/mTOR-сигнального пути
PTEN 22,45±9,40 8,34±6,70*
AKT 9,84±4,76 72,97±40,12*
GSK-3beta 27,65±9,71 12,4±3,8*
PDK1 16,13±3,19 30,2±17,3*
c-RAF 24,01±8,33 41,13±10,83
Протеинкиназа mTOR и ее субстраты
mTOR 20,68±9,91 54,83±23,09
Киназа p70 S6 31,98±12,82 32,60±17,22
4E-BP1 12,15±5,40 33,32±11,05*
* — статистически значимые различия значений по сравнению с локализованным раком почки (р<0,05).
Таблица 4
Содержание АКТ/тТО^сигнального пути у больных раком почки в зависимости от размера первичной опухоли, % (Ме [01; Q3])
Компоненты Стадия заболевания
T1NoMo (n=10) T2N0M0-1 (n=14) T3N0M0-1 (n=10)
Компоненты AKT/m-TOR сигнального пути
Phospho-PTEN 104,8 [67,9; 165,3] 110,3 [67,4; 194,4] 83,3 [55,3; 105,0]
AKT (pan) 170,0 [98,6; 142,9] 168,4 [113,7; 224,1] 284,5 [79,6; 447,8]
Phospho-AKT (T308) 125,3 [73,2; 150,4] 134,1 [83,1; 210,9] 127,8 [101,0; 114,0]
Phospho-AKT (S473) 120,3 [73,2; 150,4] 139,1 [93,1; 200,9] 137,8 [106,0; 124,0]
Phospho-GSK-3beta 186,8 [116,7; 267,5] 151,5 [100,1; 227,0] 107,5 [78,5; 107,3]
Phospho-PDKI 177,7 [116,7; 167,6] 150,9 [54,2; 170,2] 95,6 [76,0; 119,2]
Phospho-c-RAF 126,3 [78,0; 162,0] 164,0 [18,1; 234,5] 286,9 [247,0; 311,1]*
Протеинкиназа mTOR и ее субстраты
mTOR 179,9 [68,8; 193,0] 211,0 [154,5; 260,4] 124,2 [50,7; 194,1]
Phospho-mTOR (Ser2448) 257,1 [106,4; 318,9] 123,0 [50,0; 164,7] 108,8 [72,6; 181,7]*
Phospho-p70 S6 киназа 106,8 [66,7; 95,0] 101,1 [67,5; 117,7] 102,6 [31,2; 195,5]
Phospho-4E-BP1 107,1 [63,1; 136,6] 141,1 [71,8; 151,8] 266,7 [105,5; 489,9]
* — статистически значимые различия значений по сравнению с группой больных Т^0М0, р<0,05.
Таблица 5
Содержание АКТ/тТО^сигнального пути у больных с локализованным и диссеминированным раком почки, % (Ме [01; 03])
Компоненты Локализованный рак почки (n=24) Диссеминированный рак почки (n=10)
Компоненты AKT/mTOR-сигнального пути
Phospho-PTEN 99,7 [70,4; 139,2] 55,3 [55,2; 57,0]*
AKT (pan) 139,9 [110,7; 229,4] 160,4 [112,3; 175,4]
Phospho-AKT (T308) 105,1 [76,1; 156,6] 73,1 [55,9; 84,7]*
Phospho-AKT (S473) 118,6 [93,2; 164,1] 85,2 [53,4; 106,7]*
Phospho-GSK-3beta 156,1 [106,8; 250,5] 147,5 [97,4; 196,9]
Phospho-PDK1 132,0 [102,4; 168,0] 119,2 [111,7; 132,6]
Phospho-c-RAF 157,1 [102,9; 240,8] 146,4 [75,8; 164,9]
Протеинкиназа mTOR и ее субстраты
mTOR 158,6 [90,4; 218,0] 129,4 [78,8; 138,4]
Phospho-mTOR (Ser2448) 128,1 [93,0; 205,6] 108,1 [81,7; 160,4]
Phospho-p70 S6 киназа 93,6 [67,1; 117,8] 101,9 [39,0; 173,7]
Phospho-4E-BP1 131,0 [78,1; 188,7] 128,0 [105,4; 136,8]
* — статистически значимые различия значений по сравнению с локализованным раком почки.
уменьшением экспрессии РТЕМ уровень мРНК фос-фатазы был значимо ниже у больных при наличии отдаленных метастазов заболевания по сравнению с
аналогичным показателем при локализованном процессе.
Известен факт, что активация AKT/mTOR-сигнального пути в опухоли почки, связанного с дефектом гена фон Гиппеля-Линдау, сопровождается снижением активности киназы GSK-3beta на фоне уменьшения количества убиквитин-лигазы E3 (белок фон Гиппеля-Линдау) [21]. Также имеются данные о том, что уровень экспрессии этого показателя связан с безрецидивной выживаемостью больных раком молочной железы [22, 23]. В связи с этим становится понятным, что именно сниженный уровень экспрессии мРНК киназы GSK-3beta при развитии метастатической формы заболевания сопряжен с прогрессированием рака почки.
Следует особо отметить тот факт, что показатель экспрессии 4E-BP1 также был ассоциирован с развитием гематогенных метастазов. Его экспрессия оказалась увеличенной в 2,7 раза у больных с диссеминиро-ванным раком почки по сравнению с локализованной формой заболевания (см. табл. 3). По всей вероятности, этот показатель является наиболее информативным в отношении предсказания неблагоприятного исхода заболевания как вследствие увеличения размеров первичной опухоли, так и за счет ее диссеми-нации. Другими словами, экспрессия фактора 4E-BP1 может являться показателем, сопряженным с агрессивным ростом опухоли, что подтверждено и в литературе [8, 24].
При анализе содержания компонентов AKT/mTOR-сигнального пути у больных раком почки отмечено, что по мере увеличения размеров опухоли наблюдается повышение уровня экспрессии c-RAF и снижение — phospho-mTOR (табл. 4). Развитие отдаленного мета-стазирования сопровождалось значимым снижением содержания фосфатазы PTEN, phospho-AKT (T308) и phospho-AKT (S473) в опухолевой ткани (табл. 5).
Обращает на себя внимание динамика изменения уровня экспрессии AKT и его белкового продукта, которые были получены при проведении исследования. На рис. 1 представлены данные, характеризующие экспрессию и содержание протеинкиназ AKT — phospho-AKT (T308) и phospho-AKT (S473) — у больных с локализованным и диссеминированным раком почки. Выявлено, что экспрессия AKT нарастала по мере прогрессирования заболевания у больных с наличием гематогенных метастазов, а содержание протеин-киназы при этом снижалось. Эти изменения сопровождались повышением экспрессии протеинкиназы
140 120 100 80 60 10 20 О
М0 М1
а
Phospho-AKT (T308) Ph ospho-AKT (S473)
rf
—1—
— —
М0 М1 М0 М1
б
Рис. 1. Экспрессия и содержание протеинкиназы AKT в ткани опухоли почки:
М0 — у больных с локализованным раком почки; М1 — с диссеминированным раком почки: а — экспрессия AKT, результаты выражены в условных единицах (ось ординат); б — содержание phospho-AKT (T308) и phospho-AKT (S473), результаты выражены в процентах от содержания показателей в неизмененной ткани (ось ординат)
PDK1, участвующей в активации исследуемой протеинкиназы АКТ Можно полагать, что уровень мРНК PDK1 при развитии метастазов заболевания является дополнительным доказательством роли AKT/mTOR-сигнального пути в прогрессировании рака почки.
На рис. 2 показаны изменения фосфатазы PTEN на уровнях мРНК и соответствующего белка, где снижение экспрессии компонента сопровождалось уменьшением содержания фосфатазы. Прогрессирование рака почки, как известно, связано с функциональной неполноценностью PTEN, что приводит к более выраженной активации AKT/mTOR-сигнального пути [2, 6]. Доказательством этому служит полученный и подтвержденный нами факт роста экспрессии протеин-киназы AKT по мере развития диссеминированного процесса. При этом зафиксировано снижение содержания активированных форм AKT — phospho-AKT (T308) и phospho-AKT (S473), которое позволяет предположить, что высокая активность данного сигнального каскада в условиях неполноценности фосфатазы PTEN осуществляется за счет небольшого количества фермента и приводит к снижению его фосфорилиро-ванных форм.
Выявленные разнонаправленные изменения экспрессии киназы AKT и ее белковых продуктов согласуются с нашими ранее полученными данными относительно транскрипционных и ростовых факторов (HIF-1, HIF-2, VEGF, CAIX) [15, 18], которые также подтверждены и другими авторами [25]. Интересно отметить, что только для белка-онкосупрессора PTEN динамика изменений была сходной как на уровне мРНК, так и на уровне белка, однако это не было подтверждено статистически при проведении корреляционного анализа. В основе таких несоответствий могут лежать изменения процессов синтеза и деградации мРНК, нарушение процессов трансляции, а также активация процессов посттрансляционной модификации белков [26].
Рис. 2. Экспрессия и содержание фосфатазы PTEN в ткани опухоли почки:
М0 — у больных с локализованным раком; М1 — у больных с диссеминированным раком; а — экспрессия РТЕЫ, результаты выражены в условных единицах (ось ординат); б — содержание РТЕЫ, результаты выражены в процентах от содержания показателей в неизмененной ткани (ось ординат)
Заключение
Проведенное исследование выявило наличие сопряженности между экспрессией компонентов AKT/ mTOR-сигнального пути, содержанием их белковых продуктов и развитием прогрессирования заболевания. Изменение уровня мРНК и содержания соответствующего белкового продукта показано для AKT, фосфатазы PTEN, 4E-BP1 и GSK-3beta. Полученные нами данные свидетельствуют, что при раке почки необходим комплексный подход к его изучению: как на уровне мРНК, так и при анализе содержания соответствующих белковых продуктов. Результаты проведенного исследования расширяют представления об особенностях онкогенеза при раке почки, а также служат фундаментальной основой для определения риска, сопряженного с развитием генерализации опухолевого процесса.
Финансирование исследования. Работа выполнена по заданию НИИ онкологии Томского научного медицинского центра Российской академии наук.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература/References
1. Spirina L.V., Usynin E.A., Kondakova I.V., Yurmazov Z.A., Slonimskaya E.M. Effect of target therapy on the content of transcription and growth factors, protein kinase TOR, and activity of intracellular proteases in patients with metastatic renal cell carcinoma. Bull Exp Biol Med 2016; 160(6): 798-801, https://doi.org/10.1007/s10517-016-3313-6.
2. Hager M., Haufe H., Alinger B., Kolbitsch C. pS6 expression in normal renal parenchyma, primary renal cell carcinomas and their metastases. Pathol Oncol Res 2012; 18(2): 277-283, https://doi.org/10.1007/s12253-011-9439-y.
3. Hudson C.C., Liu M., Chiang G.G., Otterness D.M., Loomis D.C., Kaper F., Giaccia A.J., Abraham R.T. Regulation of hypoxia-inducible factor 1a expression and function by the mammalian target of rapamycin. Mol Cell Biol 2002; 22(20): 7004-7014, https://doi.org/10.1128/mcb.22.20.7004-7014.2002.
4. Pópulo H., Lopes J.M., Soares P. The mTOR signalling pathway in human cancer. Int J Mol Sci 2012; 13(2): 18861918, https://doi.org/10.3390/ijms13021886.
5. Li J., Lu Y., Akbani R., Ju Z., Roebuck P.L., Liu W., Yang J.Y., Broom B.M., Verhaak R.G., Kane D.W., Wakefield C., Weinstein J.N., Mills G.B., Liang H. TCPA: a resource for cancer functional proteomics data. Nat Methods 2013; 10(11): 1046-1047, https://doi.org/10.1038/nmeth.2650.
6. Gao T., Furnari F., Newton A.C. PHLPP: a phosphatase that directly dephosphorylates Akt, promotes apoptosis, and suppresses tumor growth. Mol Cell 2005; 18(1): 13-24, https:// doi.org/10.1016/j.molcel.2005.03.008.
7. Nishikawa M., Miyake H., Harada K., Fujisawa M. Expression of molecular markers associated with the mammalian target of rapamycin pathway in nonmetastatic renal cell carcinoma: effect on prognostic outcomes following radical nephrectomy. Urol Oncol 2014; 32(1): 15-21, https:// doi.org/10.1016/j.urolonc.2013.07.014.
8. Dodd K.M., Yang J., Shen M.H., Sampson J.R., Tee A.R. mTORCI drives HIF-1a and VEGF-A signalling via multiple mechanisms involving 4E-BP1, S6K1 and STAT3. Oncogene 2015; 34(17): 2239-2250, https://doi.org/10.1038/ onc.2014.164.
9. Figlin R.A., Kaufmann I., Brechbiel J. Targeting PI3K and mTORC2 in metastatic renal cell carcinoma: new strategies for overcoming resistance to VEGFR and mTORC1 inhibitors. Int J Cancer 2013; 133(4): 788-796, https://doi. org/10.1002/ijc.28023.
10. Oeckinghaus A., Postler T.S., Rao P., Schmitt H., Schmitt V., Grinberg-Bleyer Y., Kühn L.I., Gruber C.W., Lienhard G.E., Ghosh S. кВ-Ras proteins regulate both NF-кВ-dependent inflammation and Ral-dependent proliferation. Cell Rep 2014; 8(6): 1793-1807, https://doi.org/10.1016/j. celrep.2014.08.015.
11. Thangavelu K., Pan C.Q., Karlberg T., Balaji G., Uttamchandani M., Suresh V., Schüler H., Low B.C., Sivaraman J. Structural basis for the allosteric inhibitory mechanism of human kidney-type glutaminase (KGA) and its regulation by Raf-Mek-Erk signaling in cancer cell metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109(20): 7705-7710, https:// doi.org/10.1073/pnas.1116573109.
12. Gerlinger M., Rowan A.J., Horswell S., Math M., Larkin J., Endesfelder D., Gronroos E., Martinez P., Matthews N., Stewart A., Tarpey P., Varela I., Phillimore B., Begum S., McDonald N.Q., Butler A., Jones D., Raine K., Latimer C., Santos C.R., Nohadani M., Eklund A.C., Spencer-Dene B., Clark G., Pickering L., Stamp G., Gore M., Szallasi Z., Downward J., Futreal P.A., Swanton C. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012; 366(10): 883-892, https://doi. org/10.1056/nejmoa1113205.
13. Quintayo M.A., Munro A.F., Thomas J., Kunkler I.H., Jack W., Kerr G.R., Dixon J.M., Chetty U., Bartlett J.M. GSK3ß and cyclin D1 expression predicts outcome in early breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2012; 136(1): 161168, https://doi.org/10.1007/s10549-012-2229-8.
14. Almatore D.A., Tesla J.R. Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer. Oncogene 2005; 24(50): 7455-7464, https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209085.
15. Спирина Л.В., Усынин Е.А., Кондакова И.В., Юрма-зов З.А., Слонимская Е.М., Колегова Е.С. Активация AKT сигнального пути и уровень субстратов m-TOR в опухоли больных раком почки, связь с распространенностью злокачественного процесса. Вопросы онкологии 2016; 62(3): 490-494. Spirina L.V., Usynin E.A., Kondakova I.V., Yurmazov Z.A., Slonimskaya E.M., Kolegova E.S. Activation of AKT of signaling pathway and the level of mTOR substrates in tumor of patients with kidney cancer, connection with prevalence of malignancy. Voprosy onkologii 2016; 62(3): 490-494.
16. Darwish O.M., Kapur P., Youssef R.F., Bagrodia A., Belsante M., Alhalabi F., Sagalowsky A.I., Lotan Y., Margulis V. Cumulative number of altered biomarkers in mammalian target of rapamycin pathway is an independent predictor of outcome in patients with clear cell renal cell carcinoma. Urology 2013; 81(3): 581-586, https://doi.org/10.1016/j.urology.2012.11.030.
17. Lidgren A., Bergh A., Grankvist K., Lindh G., Ljungberg B. Hypoxia-inducible factor-1a mRNA and protein levels in renal cell carcinoma. J Cancer Mol 2008; 4(5): 153-157.
18. Юрмазов З.А., Усынин Е.А., Кондакова И.В., Слонимская Е.М., Спирина Л.В. Связь молекулярных пара-
метров опухоли с эффективностью лечения пазопанибом у больных диссеминированным раком почки. Молекулярная медицина 2015; 6: 61-66. Yurmazov Z.A., Usynin E.A., Kondakova I.V., Slonimskaya E.M., Spirina L.V. Association of cancer molecular parameters with effectiveness of pazopanib treatment in advanced kidney cancer patients. Molekulyarnaya meditsina 2015; 6: 61-66.
19. Akbani R., Ng P.K., Werner H.M., Shahmoradgoli M., Zhang F., Ju Z., Liu W., Yang J.Y., Yoshihara K., Li J., Ling S., Seviour E.G., Ram P.T., Minna J.D., Diao L., Tong P., Heymach J.V., Hill S.M., Dondelinger F., Städler N., Byers L.A., Meric-Bernstam F., Weinstein J.N., Broom B.M., Verhaak R.G., Liang H., Mukherjee S., Lu Y., Mills G.B. A pan-cancer proteomic perspective on The Cancer Genome Atlas. Nat Commun 2014; 5: 3887, https://doi.org/10.1038/ ncomms4887.
20. Lolkema M.P., Mans D.A., Ulfman L.H., Volpi S., Voest E.E., Giles R.H. Allele-specific regulation of primary cilia function by the von Hippel-Lindau tumor suppressor. Eur J Hum Genet 2008; 16(1): 73-78, https://doi.org/10.1038/ sj.ejhg.5201930.
21. Mendoza M.C., Er E.E., Blenis J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. Trends Biochem Sci 2011; 36(6): 320-328, https://doi.org/10.1016/j. tibs.2011.03.006.
22. Schultz L., Chaux A., Albadine R., Hicks J., Kim J.J.,
De Marzo A.M., Allaf M.E., Carducci M.A., Rodriguez R., Hammers H.J., Argani P., Reuter V.E., Netto G.J. Immunoexpression status and prognostic value of mTOR and hypoxia-induced pathway members in primary and metastatic clear cell renal cell carcinomas. Am J Surg Pathol 2011; 35(10): 1549-1556, https://doi.org/10.1097/pas.0b013e31822895e5.
23. Yu S., Hou Q., Sun H., Liu J., Li J. Upregulation of C-C chemokine receptor type 7 expression by membrane-associated prostaglandin E synthase-1/prostaglandin E2 requires glycogen synthase kinase 3ß-mediated signal transduction in colon cancer cells. Mol Med Rep 2015; 12(5): 7169-7175, https://doi.org/10.3892/mmr.2015.4290.
24. Greenbaum D., Colangelo C., Williams K., Gerstein M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biol 2003; 4(9): 117, https://doi. org/10.1186/gb-2003-4-9-117.
25. Han G., Zhao W., Song X., Kwok-Shing Ng P., Karam J.A., Jonasch E., Mills G.B., Zhao Z., Ding Z., Jia P. Unique protein expression signatures of survival time in kidney renal clear cell carcinoma through a pan-cancer screening. BMC Genomics 2017; 18(Suppl 6): 678, https://doi. org/10.1186/s12864-017-4026-6.
26. Guo H., German P., Bai S., Barnes S., Guo W., Qi X., Lou H., Liang J., Jonasch E., Mills G.B., Ding Z. The PI3K/AKT Pathway and Renal Cell Carcinoma. J Genet Genomics 2015; 42(7): 343-353, https://doi.org/10.1016/jJgg.2015.03.003.
