CC BY
104
УДК 595.443-1.05:[628.394.17(262.81:665.6)]
Н. В. Козлова Астраханский государственный технический университет
ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ТОКСИКАНТОВ НА ОРГАНИЗМ СЕГОЛЕТКОВ СТЕРЛЯДИ
Введение
Одним из важнейших факторов риска для биологического разнообразия ВолгоКаспийского бассейна является загрязнение акватории моря нефтью и нефтепродуктами, а также другими органическими соединениями. Особую опасность оно представляет для мелководной части моря - Северного Каспия, где загрязнители нефти, по мнению специалистов, действуют на экосистему примерно в 100 раз сильнее, чем в остальной части моря.
Нефть, нефтепродукты, этаноламины относятся к ксенобиотикам, негативно воздействующим на морфологические, физиологические, генетические и биохимические показатели рыб [1-3]. Эти изменения влияют на рыб, сокращая их численность и воспроизводство. Химические соединения особенно губительны для гидробионтов на ранних стадиях их развития [4]. Накапливаясь в организме рыб, ксенобиотики делают рыбные ресурсы непригодными для использования их в пищу.
Цели и задачи исследований
Целью нашего исследования явилось изучение влияния сырой каспийской нефти, а также комплексного воздействия нефти и диэтаноламина (ДЭА) на жизнедеятельность некоторых осетровых рыб в раннем онтогенезе. Степень влияния химических веществ на рыб оценивали по некоторым физиолого-биохимическим показателям.
Материал и методика
В качестве объекта исследований были использованы сеголетки стерляди (Acipenser rutte-nus) массой 28 г и длиной 21 см. Сырая каспийская нефть была добыта с Хвалынского месторождения Северного Каспия, ДЭА доставлен с Астраханского газоперерабатывающего завода. Эксперименты по изучению токсического воздействия веществ на рыб проводили по общепринятым методам исследований [5-7].
Была выбрана следующая шкала концентраций химических веществ: I - 1 мг/л нефти; II - 10 мг/л нефти; III - 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА; IV - 100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА. Опыты проводили в двух повторностях, при постоянной аэрации воды, температуре +18 °С и кормлении живыми и искусственными кормами. Рыб контрольной группы содержали в воде без добавления химических веществ. Продолжительность опыта составила 60 суток. В процессе эксперимента проводили наблюдение за частотой дыхания, поведением и выживаемостью подопытного материала.
Для оценки влияния нефти и ДЭА на жизнедеятельность и метаболизм стерляди в периферической крови колориметрическим методом определяли количество гемоглобина [8]. Лейкоцитарную формулу микроскопического анализа и морфологии форменных элементов крови определяли по методам Ивановой, Житеневой и др. [9, 10]. Показатель коллоидной стабильности белков (лента Вельтмана) проводили по методике Салменкова и Малининой в модификации Кычанова и др. [11, 12], скорость перекисного окисления липидов (ПОЛ) в спинных мышцах рыб - по микрометоду Строева, Макаровой [13]. Полученный цифровой материал обработан статистически на компьютерной программе «STATIST 1 BAS».
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследований показали, что в растворах I-IV сеголетки стерляди проявляли большее, чем в контроле беспокойство, интенсивно двигались в толще воды. Рыба находилась, согласно теории Селье, в стадии экзальтации (тревоги). Двигательная активность рыб пришла в норму (стадия адаптации) на 4-е сутки от начала эксперимента. Первые признаки потери рав-
новесия, частое заглатывание воздуха с поверхности водоема были отмечены у подопытных рыб на 30-е сутки. На туловище сеголетков встречались кровоизлияния в области головного отдела и плавников, на всей поверхности тела присутствовало обильное количество слизи, что, вероятно, связано с защитными свойствами организма. Гибель рыбы была обнаружена только в конце эксперимента - к 60 суткам (табл. 1).
Таблица 1
Выживаемость сеголетков стерляди в эксперименте при воздействии токсикантов
Т оксикант Выживаемость, %
Контроль 100
1 мг/л нефти 75
10 мг/л нефти 60
10 мг/л нефти +10 мг/л ДЭА 70
100 мг/л нефти +100 мг/л ДЭА 50
В контроле сеголетки стерляди имели 100 % выживаемость и были без видимых внешних патологий.
В вариантах 1-ГУ в конце эксперимента наблюдали снижение массы стерляди (0+) в среднем на 5-7 г и отставание в росте на 1,5-3 см по сравнению с рыбами контрольной группы.
Количество гемоглобина в периферической крови рыб, содержавшихся в течение 30 суток в растворах с концентрацией нефти 1 и 10 мг/л, снижалось в 1,2 и 3,1 раза соответственно относительно контроля (табл. 2). При этом следует отметить, что при максимальной концентрации нефти по отношению к минимальной количество гемоглобина значительно уменьшилось - в 2,7 раза.
Таблица 2
Изменение количества гемоглобина в крови сеголетков стерляди под влиянием токсикантов
Т оксикант Экспозиция
30 суток 60 суток
Контроль 6,6 ± 0,1095 4,6 ± 0,1158
1 мг/л нефти 5,7 ± 0,3124 2,7 ± 0,2354*
10 мг/л нефти 2,1 ± 0,12409* 1,6 ± 0,1685*
10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА 5,9 ± 0,1690* 2,5 ± 0,1141*
100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА 1,9 ± 0,1356* 1,0 ± 0,1788*
* Величины, достоверно отличающиеся от соответствующих значений в контроле (р < 0,05).
В последующий период исследований (30-60-е сутки) содержание гемоглобина в крови сеголетков стерляди снижалось в 1,7 и 2,9 раза соответственно относительно контроля. Аналогично первой экспозиции (30 суток), отмечено снижение гемоглобина в 1,7 раза в крови подопытных рыб, содержавшихся в растворах с концентрацией нефти 10 мг/л по сравнению с растворами с концентрацией нефти 1 мг/л.
Исследования комплексного воздействия нефти и ДЭА (ГГГ и IV варианты опыта) в различных концентрациях выявили их однонаправленное действие - снижение среднего количества гемоглобина в крови сеголетков стерляди как относительно контроля в 1,1 и 3,5 раза, так и между опытами в 3,1 раза соответственно на 30-е сутки эксперимента.
Вышеперечисленные изменения среднего количества гемоглобина отмечены и в конце опыта (60-е сутки) при концентрации 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА и 100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА.
В обеих экспозициях комплексного воздействия раствора с концентрацией нефти 10 мг/л + + ДЭА 10 мг/л отмечалось значительное увеличение среднего содержания гемоглобина в крови рыб в 2,8 и 1,6 раза соответственно относительно варианта опыта с чистой нефтью той же дозы. В этом случае, возможно, ДЭА оказывает свое антисептическое свойство. Однако в максимальных дозах (100 мг/л) ДЭА проявляет себя как высокотоксичное вещество [14].
Исследования показали, что в зависимости от концентрации токсикантов, а также комплексного их воздействия процентное соотношение показателей белой крови имело разнонаправленный характер . Так, общее число нейтрофилов увеличилось в 1,1 раза в варианте опыта -с 10 мг/л нефти, что связано с повышением защитных сил организма.
В других случаях происходило снижение числа нейтрофилов в 2 раза в крови рыб, находившихся в растворах с концентрацией 1 мг/л нефти и 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА, и в 1,2 раза -в растворе с концентрацией 100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА по сравнению с контролем. Среди разновидностей нейтрофилов в вариантах опыта с минимальной дозой нефти и в двух вариантах комплексного воздействия нефти и ДЭА количество миелоцитов, метамиелоцитов и палочкоядерных нейтрофилов уменьшилось в 2-3 раза относительно контроля. Максимальное количество сегментоядерных нейтрофилов было отмечено в белой крови сеголетков, подвергавшихся максимальному совместному воздействию двух токсикантов.
Количество эозинофилов в крови у рыб резко изменялось при изменении условий обитания. В вариантах с 1 мг/л нефти и 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА в крови сеголетков стерляди наблюдалось увеличение эозинофилов в 1,3—1,7 раза по сравнению с контролем, а при максимальной дозе нефти и максимальной дозе совместного воздействия нефти с ДЭА развивалась эози-нофилопения. При комплексном воздействии на молодь стерляди 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА количество моноцитов белой крови снижалось на 19 % относительно контроля.
В вариантах эксперимента с концентрацией нефти 10 мг/л и 100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА в белой крови рыб наблюдалось увеличение количества содержания моноцитов на 48 и 11 % соответственно относительно контроля, что свидетельствует об усилении защитных сил организма. Лимфоциты являются самой представительной группой белых кровяных клеток у рыб. В варианте II (10 мг/л нефти) наблюдалось некоторое уменьшение количества лимфоцитов, что характеризует уровень развития неспецифических иммунных реакций, а в других вариантах -1 мг/л нефти, 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА и 100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА (I, III и IV) — увеличение числа лимфоцитов до 13 % по отношению к контролю. При оценке клеток белой крови в I, III и IV вариантах опыта наблюдали лимфоцитарный лейкоз, вызванный токсическим действием минимальной концентрации нефти и комплексного воздействия нефти и ДЭА.
Коллоидная стабильность белков (КСБ) сыворотки крови сеголетков, находившихся в течение 30 суток в максимальной концентрации нефти (10 мг/л) увеличилась в 1,7 раза относительно минимальной дозы (1 мг/л нефти) (рис.). Совместное действие нефти и ДЭА в различных концентрациях незначительно изменило КСБ подопытных сеголетков. Комплексное воздействие (10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА) на рыб показало возрастание в 16,5 раза КСБ сыворотки крови относительно той же концентрации действия чистой нефти. Коллоидная устойчивость сывороточных белков контрольного варианта была существенно выше таковой в !—^ вариантах.
30 суток
60 суток
30 суток
60 суток
Сыворотка крови
Мышцы
□ Контроль
□ 10 мг/л нефти
□ 100 мг/л нефти+100 мг/л ДЭА
□ 1 мг/л нефти
□ 10 мг/л нефти+10 мг/л ДЭА
Изменение КСБ в сыворотке крови и мышцах сеголетков стерляди под влиянием токсикантов
ед .опт.пл
0,09
0,08
0.07
0,06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
Заслуживают внимания данные анализа, которые свидетельствуют о зависимости КСБ от длительности экспозиции в эксперименте. Так, через 60 суток во всех вариантах результаты КСБ были выше, чем при 30-суточной экспозиции. Значительно увеличение данного показателя
в вариантах с минимальной и максимальной дозой нефти — в 40 и 27 раз соответственно. По мере увеличения времени соприкосновения рыб с токсикантами совместного воздействия и с различными их концентрациями (варианты III и IV) КСБ возрастает в 1,6 и 1,3 раза соответственно.
Таким образом, действие химических реагентов вызвало изменение метаболических показателей сыворотки крови. Особенностью этих изменений является количественная направленность КСБ сыворотки крови сеголетков стерляди — как по сравнению с контролем, так и в зависимости от времени воздействия поллютантов, их концентрации и совместного влияния. Изменения, наблюдаемые нами в свойствах сывороточных белков, позволяют отметить нарушение белоксинтезирующей функции печени экспериментальных рыб, подвергшихся воздействию данных химических веществ органического ряда.
Кроме того, обращает на себя внимание увеличение устойчивости водорастворимых белков в мышцах подопытных рыб при 30-суточной интоксикации нефтью (10 мг/л) и некоторое снижение ее при совместном воздействии нефти и ДЭА (10 мг/л) по отношению к контролю (рис. 1). Через 60 суток опыта устойчивость водорастворимых белков в мышцах рыб вариантов !—ГУ по мере увеличения дозы нефти возрастает на 12,5—16,5 %, и в растворах нефти с ДЭА (10 мг/л; 100 мг/л) на 6,3; 9,1 % соответственно относительно контроля. Однако следует отметить, что показатели КСБ мышечной ткани рыб, находившихся под воздействием сырой нефти, значительно выше, чем рыб, испытывавших комплексное влияние нефти и ДЭА. В связи с тем, что экспериментальные данные стабильности тканевых белков сеголетков стерляди получены впервые, необходимо высказать несколько предположений. Во-первых, повышение стабильности белков в мышечной ткани, видимо, связано с конформационной изменчивостью белковых молекул, что предотвращает деструкцию тканей [15]. Во-вторых, изменчивость симптомов интоксикации под влиянием различных доз нефти и ее совместного действия с ДЭА носит фазное развитие, поэтому характер кинетики устойчивости белков будет изменяться в зависимости от экспозиции. В-третьих, устойчивость сывороточных белков ниже тканевых на 30-е сутки экспозиции, в связи с их стереохимической разнокачественностью.
Таким образом, данные экспериментальных исследований по изучению действия нефти на сеголетков рыб выявили разнокачественность коллоидной устойчивости водорастворимых сывороточных и мышечных белков. Повышенную стабильность тканевых белков по сравнению с сывороточными на 30-е сутки эксперимента предварительно можно считать стабилизирующим фактором структурной организации мышечной ткани.
Исследования ПОЛ мышц сеголетков стерляди показали, что кинетика ПОЛ рыб зависит от экспозиции, дозы и характера воздействия токсикантов (табл. 3).
Таблица 3
Изменения показателей ПОЛ в мышцах сеголетков стерляди под влиянием токсикантов
Т оксикант Экспозиция
30 суток 60 суток
СпПОЛ** (нмоль/ч) АсПОЛ (нмоль/ч) МДА** (нмоль) СпПОЛ (нмоль/ч) АсПОЛ (нмоль/ч) МДА (нмоль)
Контроль 2,510 ± 0,287 5,49 ± 0,242 0,73 ± 0,170 2,35 ± 0,518 20,08 ± 0,530 0,91 ± 0,3021
1 мг/л нефти 8,000 ± 0,187* 23,69 ± 0,435* 1,93 ± 0,159* 10,04 ± 0,386* 29,03 ± 0,676* 2,22 ± 0,7071
10 мг/л нефти 1,880 ± 0,465 11,45 ± 0,353* 0,68 ± 0,176 0,31 ± 0,057* 1,57 ± 0,298* 0,1 ± 0,0244*
10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА 12,240 ± 0,353* 29,50 ± 0,660* 2,56 ± 0,353* 2,20 ± 0,628 11,14 ± 0,775* 0,71 ± 0,2519
100 мг/л нефти + 100 мг/л ДЭА 25,26 ± 0,670* 51,47 ± 0,411* 3,21 ± 0,483* 9,41 ± 0,659* 26,83 ± 0,6529* 1,80 ± 0,4827
* Величины, достоверно отличающиеся от соответствующих значений в контроле (р < 0,05). СпПОЛ — спонтанное ПОЛ; АсПОЛ — аскорбатзависимое ПОЛ; МДА — малондиальдегид.
Увеличение скорости ПОЛ в мышцах подопытных рыб, находившихся в растворе с концентрацией нефти 1 мг/л, на 30-е сутки эксперимента происходило при одновременном увеличении уровня МДА в 2,6 раза относительно контрольного варианта, что в целом служит косвен-
ным доказательством увеличения содержания и других продуктов ПОЛ. При максимальной концентрации нефти (10 мг/л) значения МДА были ниже контроля в 1,1 раза. Повышение дозы нефти с 1 до 10 мг/л уменьшало концентрацию МДА в мышцах почти в 3 раза. Отклонение СпПОЛ и АсПОЛ от контрольных значений свидетельствует о нарушении работы антиокисли-тельной системы организма рыб.
После 60-суточной интоксикации нефтью максимальной дозой (10 мг/л) у рыб обнаружено значительное снижение МДА — в 9,1 раза по отношению к контролю. При сравнении различных концентраций нефти оказалось, что количество МДА мышц сеголетков при концентрации нефти 10 мг/л в 22,2 раза ниже значений МДА мышц при минимальной концентрации нефти (1 мг/л). Изменения концентраций СпПОЛ и АсПОЛ аналогичны по направлению с показателями МДА.
Оценивая в конце эксперимента показатели МДА при концентрации нефти 10 мг/л и 10 мг/л нефти + 10 мг/л ДЭА, можно допустить, что даже в предлетальный период в организме рыб возможен адаптивный эффект.
Заключение
Таким образом, под влиянием нефти и комплексного воздействия нефти и ДЭА происходят значительные изменения физиолого-биохимических показателей сеголетков стерляди. Отмечено ухудшение гематологических показателей сеголетков стерляди в виде снижения количества гемоглобина. В зависимости от концентрации токсикантов, а также комплексного их воздействия процентное соотношение показателей белой крови имеет разнонаправленный характер.
При воздействии нефти и ДЭА на сеголетков наблюдается разнокачественность коллоидной устойчивости водорастворимых сывороточных и тканевых белков. Изменение КСБ сыворотки крови и мышц стерляди (0+) при действии нефти и ДЭА можно характеризовать как нарушение гомеостаза. Отклонение в характере процесса ПОЛ в мышцах сеголетков стерляди от контроля свидетельствует о токсическом воздействии нефти и комплексном влиянии нефти и ДЭА на ранние стадии развития осетровых рыб. Снижение количества показателя МДА у осетровых на ранних стадиях развития относительно контроля в конце опыта доказывает, что даже в предлетальный период в организме рыб возможен компенсаторный эффект. Угнетение плавательной способности рыб происходит, возможно, на фоне повышения антикислительной активности, косвенным доказательством которой является низкий уровень СпПОЛ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аббасов Р. Ю., Джавадова Л. А., Крючков В. И. Исследование влияния нефти из различных месторождений на сывороточные белки куринской белуги // I Междунар. конф. по проблемам Каспийского моря. — Баку, 1991. — С. 5—6.
2. Каниева Н. А. Физиологические механизмы адаптации рыб к влиянию каспийской нефти: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Астрахань, 2004. — 48 с.
3. Лукьяненко В. И. Общая ихтиотоксикология. — М.: Пищ. пром-сть, 1983. — 320 с.
4. Артюхова В. И., Носов В. Н. Особенности и пороги токсического воздействия нефтепродуктов на гидробионтов Каспийского моря // Теоретическая экология. — М.: МГУ, 1987. — С. 70—80.
5. Строганов Н. С. Методика определения токсичности водной среды. — М.: Наука, 1971. — С. 14—60.
6. Лесников Л. А. Методика оценки влияния воды из природных водоемов на Daphnia magna // Методики биологических исследований по водной токсикологии. — М.: Наука, 1971. — С. 157—168.
7. Лукьяненко В. И., Карпович Т. А. Биотестирование на рыбах // Метод. рекомендация. — Рыбинск,
1989. — С. 96.
8. Попов В. В., Собчук Б. А. // Лабораторное дело. — № 3. — Красноярск, 1957. — С. 19.
9. ИвановаН. Т. Атлас клеток крови рыб. — М.: Легкая и пищ. пром-сть, 1983. — 184 с.
10. Житенева Л. Д., Полтавцева Т. Г., Рудницкая О. А. Атлас нормальных и патологически измененных клеток крови рыб. — Ростов н/Д.: Кн. изд-во, 1989. — 112 с.
11. Салменков Е. А., Малинина Т. В. Применение электрофоретических методов в популяционногенетических исследованиях рыб // Типовые методики исследований продуктивности видов рыб в пределах их ареалов. — Вильнюс: Моколас, 1976. — С. 82—92.
12. Строев Е. А., Макарова В. Г. Практикум по биохимической химии. — М.: Высш. шк., 1986. — 230 с.
13. Кычанов В. М., Солохина Т. А., Югай Т. В. Взаимосвязь отдельных физиолого-биохимических пара-
метров с фертильностью самок осетровых рыб // Рыбохозяйственные исследования на Каспии. — Астрахань: КаспНИРХ, 2000. — С. 429—435.
14. Каниева Н. А. Морфофункциональные нарушения у карповых и осетровых рыб Волго-Каспийского бассейна при действии токсических агентов на примере диэтаноламина: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1992. - 24 с.
15. Кушнер В. П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. - Л.: Наука, 1977. - 274 с.
Статья поступила в редакцию 18.12.2006
THE INFLUENCE OF SOME CONTAMINANTS ON ONE-YEAR OLD ORGANISM OF STERLET
N. V. Kozlova
Experimental data of oil and diethanolamine influence on early stages of the development of sterlet (Acipenser ruttenus) is shown in the paper. External characters, behaviour, survival rate, hematologic characteristics, colloid stability of proteins of blood serum, muscle proteins, peroxide oxidation of lipids in muscles of the sturgeon fish are studied there. Specific compensatory opportunities of a fish organism under the influence of contaminants are also revealed.
