CC BY
159
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2014 БИОЛОГИЯ Вып. 4
УДК 620.18:616-093/-098:579.842.11
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI
И. А. Мамонова, И. В. Бабушкина, Е. В. Гладкова
Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, 410002, Саратов, ул. Чернышевского, 148; [email protected]; 89873329458
Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам представляет в настоящее время серьезную проблему. В работе проведено изучение антибиотикочувствительности клинических штаммов микроорганизмов после воздействия наночастиц меди, никеля, титана и марганца. Наноча-стицы меди оказывают генотоксическое действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов, способствующее восстановлению чувствительности штаммов Escherichia coli к ряду бета-лактамных антибиотиков, в частности, к пенициллинам расширенного действия и ин-гибиторозащищенным пенициллинам, а также аминогликозидам (гентамицин). Воздействие наночастиц никеля, титана и марганца не приводило к статистически достоверным изменениям антибиотикочувствительности клинических штаммов Escherichia coli.
Ключевые слова: Escherichia coli; антибиотикорезистентность; наночастицы; медь; никель; титан; марганец.
В настоящее время устойчивость микроорганизмов к антибиотикам представляет серьезную проблему. Ежегодно в странах Европейского союза около 25 тыс. человек умирают от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами микроорганизмов [Draft guidelines..., 2010].
Основными генетическими механизмами формирования резистентности у микроорганизмов являются модификация собственных генов, кодирующих мишень действия антибиотиков в клетке, а также приобретение новых генетических элементов (плазмиды, транспозоны и др.). В последнее время наряду с поиском альтернативных антибактериальных средств актуален вопрос о разработке средств, препятствующих селекции антибиотико-резитстентных штаммов микроорганизмов, также способствующих повышению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
В ряде работ предложены способы повышения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам путем воздействия различных средств и химических препаратов, протеолитических бактериальных ферментов, ферментов животного происхождения [Средство для повышения чувствительности..., 2003, 2004, 2005].
В настоящее время в литературе описано 3 механизма антибактериального действия наночастиц металлов, один из которых заключается в поглощении клеткой ионов металлов, приводящих к на-
рушению репликации и разрушению молекулы ДНК. Генотоксическое действие наночастиц металлов может быть направлено не только на ДНК нуклеоида, но и на дополнительные внехромосом-ные генетические элементы бактериальной клетки, такие как R-плазмиды, несущие основную генетическую информацию о приобретенной устойчивости микроорганизмов. Такой механизм действия наночастиц металлов может привести к разрушению плазмидной ДНК бактериальной клетки и как следствие к восстановлению антибиотикочувстви-тельности микроорганизма [Kotra et al., 1999; Lok et al., 2006; Kim et al., 2007; 8, Quillan, 2010].
В связи с вышесказанным целью исследования явилось изучение антибиотикочувствительности клинических штаммов микроорганизмов до и после воздействия наночастиц металлов.
Материалы и методы
В работе использовали наночастицы переходной группы металлов: меди, никеля, титана и марганца (ТУ 1733-056-00209013-2008), синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала ФГУП РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элементо-органических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИИХТЭОС г. Москва). Наночастицы металлов характеризовались следующими физико-химическими свойствами: наночастицы меди - размер час-
© Мамонова И. А., Бабушкина И. В., Гладкова Е. В., 2014
104
тиц 75.71±3.11 нм, размер их агломератов - 114.6 нм, Z-потенциал - 34.7 мВ, в состав поверхности наночастиц меди входит 26.58% кислорода, 8.88% углерода, 9.44% железа и 55.11% меди; размеры наночастиц никеля - 80.51±2.21 нм, размеры агломератов 1145 нм, Z-потенциал - 3.51 мВ, в состав поверхности входит 7.72% кислорода, 12.29% серы, 15.84% бериллия и 64.15% никеля; размеры наночастиц титана - 42.86±2.21 нм, их агломератов - 1025 нм, Z-потенциал--13,9 мВ, в состав
поверхности входит 37.93% кислорода, 6.12% серы, 10.46% углерода и 45.49% титана; размер на-ночастиц марганца - 68.71±4.12 нм, их агломератов - 912.1 нм, Z-потенциал - 2.92 мВ, в состав поверхности входит 36.17% кислорода, 7.54% серы, 17.07% углерода и 39.22% марганца.
В исследовании использовали 20 штаммов Escherichia coli, выделенных от больных травмато-лого-ортопедического профиля с посттравматическими и послеоперационными осложнениями, находившихся на лечение ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России.
Изучение изменения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам после воздействия наночастиц металлов проводили по нижеизложенной методике.
Готовили взвеси наночастиц металлов путем их внесения в 0.9%-ный раствор хлорида натрия до достижения концентрации 0.01 мг/мл. Смешивали 850 мкл взвеси наночастиц металлов с 50 мкл 0.1%-ного раствора ЭДТА (рН 7.2-7.4) (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, СюН14О^2№2-2Н2О) (Панеко, Россия). В приготовленную смесь добавляли 100 мкл взвеси микроорганизмов.
В качестве контроля использовали 0.9%-ный раствор хлорида натрия и смесь 0.9%-ного раствора хлорида натрия и ЭДТА. В контрольные пробирки вносили 100 мкл взвеси микроорганизмов и инкубировали в термошейкере (Sky Line ST-3 (ELMI, Латвия)) при 150 об/мин. и температуре 37°С в течение 60 мин.; 100 мкл полученной биомассы высевали на агаризованную питательную среду и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. На следующей день просматривали чашки с выросшей культурой и определяли чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В исследовании использовали питательную среду Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson, США) и сенси-диски с антибиотиками (Becton Dickinson, США).
Для всех исследуемых штаммов микроорганизмов до и после воздействия наночастиц металлов определен условный коэффициент резистентности по следующей формуле
*=R,
ж
где К - коэффициент резистентности; R - количество антибиотиков, к которым исследуемый штамм резистентен (в том числе с промежуточной чувствительностью); N - общее число антибактериальных препаратов, принятых в исследование.
Показатели коэффициента позволяют судить об относительной интегральной резистентности штаммов микроорганизмов к используемым в исследовании антибактериальным препаратам. Полученные показатели варьируют от 0 до 1. Нулевой показатель означает отсутствие резистентности у исследуемых штаммов микроорганизмов, 1 - наличие устойчивости ко всем препаратам, принятым в исследование [Гостев, Науменко, Мартель, 2010].
Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0 [Реброва, 2006]. Взаимосвязь качественных признаков устанавливали путем выявления взаимной сопряженности. Для достижения поставленной цели рассчитан критерий X с поправкой Йетса на непрерывность. Интерпретация результатов основывалась на следующем:
- если р>0.05, то нулевую гипотезу об отсутствии различий между группами по частоте признаков не отвергают;
- если р<0.05, то следует отклонить нулевую гипотезу и принять альтернативную гипотезу о существовании различий между группами по частоте изучаемого признака.
Результаты
Формулы набираются в редакторе Microsoft Equation с выравниванием по центру и пробелами сверху и снизу по 6 пт (номер формулы, если формул несколько, выравнивается по правому краю колонки):
Все штаммы E. coli, включенные в работу, подлежали исследованию на чувствительность к 13 антибактериальным препаратам 3 классов. В результате проведенного исследования установлен высокий уровень резистентности штаммов E. coli к профильным антибиотикам. Анализ данных показал устойчивость 19 из 20 исследуемых штаммов к 5 и более антибактериальным препаратам.
Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам различных групп продемонстрирована на рисунке.
Как видно из рисунка, все исследуемые штаммы E. coli устойчивы к ингибиторозащищенному пенициллину (амоксициллин/клавуланату), 19 штаммов - к пенициллину расширенного сектра действия (ампициллину). Резистентность к цефа-лоспоринам определена у 17 штаммов микроорганизмов. Так, 17 штаммов оказались не чувствительными к цефазолину и цефтриаксону, 16 - к
цефепиму, 14 - к цефтазидиму, 13 - к цефотаксиму и цефоперазону. Кроме того, 1 из исследуемых штаммов обладал промежуточной чувствительностью к цефазолину, 1 - к цефотаксиму, 1 - к цефтазидиму, 2 - цефоперазону. Выявлена устойчивость штаммов E. coli к аминогликозидам (13
штаммов показали устойчивость к амикацину, 10 -к гентамицину). Наиболее высокая активность в отношении штаммов E. coli наблюдалась у карба-пенемов (13 штаммов чувствительны к имипенему и меропенему) и хинолонов (12 штаммов чувствительны к ципрофлоксацину).
Антибиотикорезистентность клинических штаммов Escherichia coli
Изучено влияние наночастиц меди, никеля, титана и марганца на антибиотиотикочувствитель-ность клинических штаммов E. coli. В исследование включены две контрольные группы микроорганизмов, не подвергавшихся воздействию нано-частиц металлов. В первой контрольной группе микроорганизмы инокулировали в 0.9%-ный раствор хлорида натрия, во второй - в 0.9%-ный раствор хлорида натрия с добавлением ЭДТА.
хлорида натрия с добавлением ЭДТА. Проведенный анализ результатов показал отсутствие статистически достоверных различий между контрольными группами исследования; в связи с этим сочли возможным объединить их в одну группу, и в дальнейшем показатели опытных групп сравнивали с усредненной цифрой. Полученные результаты представлены в таблице.
Устойчивость к антибиотикам клинических антибиотикорезистентных штаммов Escherichia coli
Количество штаммов, устойчивых к антибиотику
Антибиотик Контроль с 0.9% раствором хлорида натрия (n=20) Контроль с ЭДТА (n=20) Усредненный контроль НЧ меди (n=20) НЧ никеля (n=20) НЧ титана (n=20) НЧ марганца (n=20)
Ампициллин 19 19 X2I=0.53; pi=0.47 19 8 X22=11.40; P2=0.0007 18 X22=0; P2=1.0000 19 X22=0.53; P2=0.4682 19 X22=0.53; P2=0.4682
Амоксициллин/ клавуланат 20 20 Х21=0.0; pi=1.0000 20 11 X22=9.18; P2=0.0025 17 X22=1.44; P2=0.2299 20 X22=0; P2=1.0000 20 X22=0; P2=1.0000
Цефазолин 18 18 X2I=0.28; Р1=0.5982 18 18 X22=0.28; P2=0.5982 18 X22=0.28; P2=0.5982 17 X22=0; P2=1.0000 18 X22=0.28; P2=0.5982
Цефотаксим 14 14 X21=0.12; Р1=0.7301 14 13 X22=0; P2=1.0000 14 X22=0.12; P2=0.7301 14 X22=0.12; P2=0.7301 14 X22=0.12; P2=0.7301
Цефтриаксон 17 17 X21=0.20; P1=0.6579 17 17 X22=0.20; P2=0.6579 17 X22=0.20; P2=0.6579 17 X22=0.20; P2=0.6579 17 X2=0.20; P2=0.6579
Цефтазидим 15 15 X21=0.13; P1=0.7150 15 14 X22=0; P2=1.0000 15 X22=0.13; P2=0.7150 15 X22=0; P2=1.0000 15 X22=0; P2=1.0000
Цефоперазон 15 15 X21=0.13; P1=0.7150 15 15 X22=0.13; P2=0.7150 14 X22=0; P2=1 15 X22=0.13; P2=0.7150 15 X22=0.13; P2=0.715
Цефипим 16 16 X21=0.16; P1=0.6926 16 16 X22=0.16; P2=0.6926 16 X22=0.16; P2=0.6926 16 X22=0.16; P2=0.6926 16 X22=0.16; P2=0.6926
Окончание таблицы
Количество штаммов, устойчивых к антибиотику
Антибиотик Контроль с 0.9% раствором хлорида натрия (n=20) Контроль с ЭДТА (n=20) Усредненный контроль НЧ меди (n=20) НЧ никеля (n=20) НЧ титана (n=20) НЧ марганца (n=20)
Имипенем 7 7 Х21=0.14; Р1=0.7055 7 7 Х22=0.14; p2=0.7055 7 Х22=0.14; p2=0.7055 7 Х22=0.14; p2=0.7055 7 Х22=0.14; p2=0.7055
Меропенем 7 7 Х21=0.14; Р1=0.7055 7 7 Х22=0.14; p2=0.7055 7 Х22=0.14; p=0.7055 7 Х22=0.14; p2=0.7055 7 Х22=0.14; p2=0.7055
Гентамицин 10 10 Х21=0.10; р1=0.7518 10 0 Х22=10.80; р2=0.001 10 Х22=0.10; р2=0.7518 10 Х22=0.10; р2=0.7518 10 Х22=0.10; P=0.7518
Амикацин 13 13 Х21=0.11; p1=0.7403 13 12 Х22=0; p2=1.0000 11 Х22=0.10; p2=0.7469 13 Х22=0.11; p2=0.7403 13 Х22=0.11; p2=0.7403
Ципрофлокса-цин 8 8 Х21=0.11; p1=0.7403 8 6 Х22=0.11; p2=0.7403 7 Х22=0; p2=1.0000 8 Х22=0.11; p2=0.7403 8 Х22=0.11; p2=0.7403
Примечание. %2 - критерий с поправкой Йетса на непрерывность, р - показатель достоверности, %21p1 - по срав-
нению с группой контроля с 0.9%-ным раствором хлорида натрия, %22р2 - по сравнению с группой усредненного контроля, п - количество наблюдений.
В результате проведенных исследований обнаружены статистически значимые изменения чувствительности клинических штаммов микроорганизмов после воздействия суспензии наночастиц меди в концентрации 0.01 мг/мл в течение 30 мин. к ампициллину, амиксициллину/клавуланату и гентамицину. Как видно из таблицы, у 11 из 19 резистентных к ампициллину штаммов чувствительность восстановилась к ампициллину (Х2= 11.40; p= 0.0007), у 9 из 20 - к амиксициллину/клавуланату (х2= 9.18; p= 0.0025). Кроме того, отмечено восстановление чувствительности к ген-тамицину всех 10 изначально резистентных клинических штаммов E. coli (х2= 10.80; p= 0.001). Статистически достоверных изменений после воздействия наночастицами никеля, титана и марганца не обнаружено.
По результатам проведенных исследований рассчитан коэффициент резистентности клинических штаммов E. coli до и после воздействия нано-частиц металлов. Полученные результаты позволяют судить об относительной интегральной устойчивости штаммов микроорганизмов к включенным в исследование антибиотикам. В контрольной группе микроорганизмов коэффициент резистентности составил 0.69±0.04. После воздействия наночастиц меди отмечено статистически значимое (р<0.05) снижение показателя до 0.55±0.04, что говорит о повышении чувствительности микроорганизмов к ряду исследуемых препаратов. После воздействия наночастиц никеля, титана и марганца статистически значимых различий с контрольной группой микроорганизмов не наблюдалось. Коэффициент резистентности клинических штаммов E. coli после воздействия на-ночастиц никеля составил 0.63±0.04, титана -0.69±0.04, марганца - 0.69±0.04.
Заключение
В результате проведенного исследования установлено, что наночастицы меди способны восстанавливать чувствительность штаммов E. coli к некоторым бета-лактамным антибиотикам (ампициллину, амоксициллину/клавуланату) и аминогликозидам (гентамицину). Можно предположить, что наночастицы меди оказывают генотоксическое действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов,
способствующее восстановлению
чувствительности штаммов E. coli к протии-вомикробным препаратам. Гены, ответственные за формирование резистентности к антибактериальным препаратам этих групп, в основном локализованы на плазмидной ДНК. В связи с этим можно предположить, что действие наночастиц меди в данном случае направлено именно на R-плазмиды бактериальной клетки, несущие гены, ответственные за формирование устойчивости к антибиотикам данных групп.
Воздействие наночастиц никеля, титана и марганца в концентрации 0,01 мг/мл в течение 30 мин. не приводило к статистически достоверным изменениям антибиотикочувствительности клинических штаммов E. coli.
На основании полученных данных разработан Способ повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (патент РФ № 2529367, приор. от 19.04.2013 г.).
Библиографический список
Гостев В.В., Науменко З.С., Мартель И.И. Антибио-
тикорезистентность микрофлоры ран открытых
переломов (II сообщение) // Травматология и ортопедия России. 2010. Т. 55, № 1. С. 33-37.
Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica. М.: МедиаСфера, 2006. 312 с.
Средство для повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам / И.П. Корюкина, В.В. Сидоров, Ю.Н. Маслов [и др.]; заявитель и патентообладатель ЗАО «Усть-Качка»: пат. 2207863 Рос. Федерация, МПК7 А 61 В 33/00; заявл. 13.03.02; опубл. 10.07.03, Бюл. № 19. 3 с.
Средство для повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам / В.В. Сидоров, И.П. Корюкина, А.В. Туев [и др.]; заявитель и патентообладатель ЗАО «Усть-Качка»: пат. 2230563 Рос. Федерация, МПК7 А 61 К 35/08, А 61 Р 31/00; заявл. 10.02.03; опубл. 20.06.04, Бюл. № 17. 4 с.
Средство для повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам / В.В. Сидоров, И.П. Корюкина, Ю.Н. Маслов; заявитель и патентообладатель ЗАО «Усть-Качка»: пат. 2255746 Рос. Федерация, МПК7 А 61 К 35/08, А 61 Р 43/00; заявл. 08.01.04; опубл. 10.07.05, Бюл. № 19. 4 с.
Средство для повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам / И.П. Корюкина, И.В. Закачурина, Ю.Н. Мас-лов, А.Н. Макарян; заявитель и патентооблада-
тель ЗАО «Усть-Качка»: пат. 2246541 Рос. Федерация, МПК7 С 12 Q 1/04, C 12 Q 1/18, C12 N1/36, A 61 K 35/08; заявл. 16.04.03; опубл. 20.02.05, Бюл. № 5. 6 с.
Draft guidelines for risk analysis of foodborne antimicrobial resistance // Codex ad hoc intergovernmental task force on antimicrobial resistance: report of the fourth session, 18-22 october 2010 year [Электронный ресурс] // Codex Alimen-tarius Commission. Muju, Republic of Korea, 2010. P. 25-49. URL:
http: //www. codexalimentarius. net/ download/report/746/REP11_AMe.pdf (дата обращения: 25.01.2014)
Kim J.S. et al. Antimicrobial effects of silver nanopar-ticles // Nanomedicine. 2007. Р. 95-101.
Kotra L.P. et al. Dynamics of the lipopolysaccharide assembly on the surface of Escherichia coli // Journal of the American Chemical Society. 1999. 121. Р. 8707-8711.
Lok C.N. et al. Proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles // Journal of Proteome Research. 2006. 5. Р. 916-924.
Quillan J. Bacterial-Nanoparticle Interactions: Thesis for the degree of Doctor of Philosophy in Biological Sciences. Exeter, 2010. Р. 211.
Поступила в редакцию 16.09.2014
The influence of metal nanoparticles to antibiotic sensitivity of Escherichia coli
clinical strains
I. A. Mamonova, Junior Research Assistant
I. V. Babushkina, candidate of medicine, Senior Research Assistant
E. V. Gladkova, candidate of biology, Head of the Departament
Departament of Fundamental and Clinical Experimental Investigation Federal Government-Financed Institution "Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedics" of Ministry of Public Health of the Russian Federation. 148, Chernyshevsky street, Saratov, Russia, 410002; [email protected]; +79873329458
Microorganisms resistance to antibiotics is a serious problem in modern studies. We have studied antibiotic sensitivity of microorganisms clinical strains after copper, nickel, titanium and manganese nanoparticles influence. Copper nanoparticles have genotoxic influence on gram-negative microorganisms that enhances the recovery of E. coli strain sensitivity to the number of beta-lactamic antibiotics including penicillin of extended action, paralyzer-protected penicillin and aminoglycosides (gentamicin). The influence of nickel, titanium and manganese nanoparticles has not led to any statistically significant changes in antibiotic sensitivity of Es-cherichia coli clinical strains.
Key words: Escherichia coli; antibiotic resistance; nanoparticles, copper; nickel; titanium; manganese.
Мамонова Ирина Александровна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник отдела Бабушкина Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела Гладкова Екатерина Вячеславовна, кандидат биологических наук, руководитель отдела Отдел фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России
