CC BY
71
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2014 БИОЛОГИЯ Вып. 2
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 579.620.3:57.085
ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ХРОНИЧЕСКОГО ОСТЕОМИЕЛИТА И ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
И. В. Бабушкина, И. А. Мамонова, Е. В. Гладкова
Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, Саратов, 410002, Саратов, ул. Чернышевского, 148; [email protected]; 89272233881
Проведено изучение спектра микроорганизмов, выделенных из инфицированных ран у пациентов с хроническим остеомиелитом длинных костей конечностей, определение их чувствительности к антибиотикам. Показано, что стафилококки являются ведущими возбудителями остеомиелита длинных костей конечностей, большинство представлено коагулазо-позитивными штаммами. Проведено изучение эффективности воздействия наночастиц меди на примере штаммов Staphylococcus aureus, доказан выраженный антибактериальный эффект суспензии наночастиц меди при применении их в низких концентрациях. Проведен анализ эффективности антибактериального действия наночастиц меди путем расчета коэффициента снижения количества микроорганизмов, а также процента редукции микроорганизмов.
Ключевые слова: остеомиелит; Staphylococcus aureus; антибиотикорезистентность; наночастицы меди.
Введение
Проблема лечения хронического остеомиелита длинных трубчатых костей является одной из самых трудных в гнойной ортопедии. Частота данного осложнения при оскольчатых переломах достигает 38%. Актуальность проблемы определяется еще и тем, что поражаются лица трудоспособного возраста, сроки восстановления весьма длительны, а инвалидность достигает 50% [Мамаев, 2008].
В микробном пейзаже раневого отделяемого пациентов с хроническим остеомиелитом длинных костей конечностей превалирующей является грамположительная кокковая флора, наибольший удельный вес в общей её структуре занимает Staphylococcus aureus [Гайдаш и др., 2000; Блатун, 2002; Науменко, Розова, 2003]. Важность проблемы стафилококковой инфекции обусловлена широким распространением метициллинрезистентных штаммов S. aureus (MRSА). У пациентов с инфекционными осложнениями костной ткани MRSA встречаются в 15-30% случаев [Науменко и др.,
2010]. Клинически важной особенностью метициллинрезистентных штаммов стафилококков является отсутствие чувствительности не только к /?-лак-тамным антибиотикам, но и ко многим другим
классам антибактериальных препаратов (макроли-дам, линкозамидам, аминогликозидам, тетрацикли-нам, хлорамфениколу, фторхинолону) [Страчун-ский, Белькова, Дехнич, 2005; Daum, 2007; Сабирова и др., 2010].
Быстрое формирование устойчивости микроорганизмов к антибиотикам диктует необходимость поиска новых, альтернативных антимикробных препаратов [Baker et al., 2005]. Антибактериальное действие наночастиц металлов определяется малым размером и развитой поверхностью, что обеспечивает их тесный контакт с клеточной мембраной микроорганизма [Morones et al., 2005].
Рядом авторов изучена антибактериальная активность наночастиц меди на музейных штаммах микроорганизмов [Wei et al., 2010; Stanila et al.,
2011]. Полученные данные по изучению антибактериальной активности наночастиц меди дали основания Американскому комитету по охране окружающей среды одобрить их регистрацию в качестве антимикробного агента для борьбы с болезнетворными микроорганизмами [Theivasanthi, Alagar, 2011].
Цель исследования - изучение спектра микроорганизмов, выделенных из инфицированных ран у пациентов с хроническим остеомиелитом длинных
О Бабушкина И. В., Мамонова И. А., Гладкова Е. В., 2014
52
трубчатых костей, определение их чувствительности к антибиотикам, изучение эффективности воздействия наночастиц меди на примере штаммов S.
aureus.
Материалы и методы
В исследование был включен материал от 123 пациентов с остеомиелитом длинных костей конечностей, проходивших лечение в ФГБУ «СарНИИ-ТО» Минздрава России в 2012 г. Всего изучено 176 штаммов.
Выделение и идентификацию микроорганизмов осуществляли по общепринятой методике (Приказ М3 СССР № 535).
Штаммы микроорганизмов выделяли из раневого отделяемого больных. Высев исследуемого материала производили на селективные и дифференциально-диагностические питательные среды. После окончания инкубации изучали морфологические, культуральные и тинкториальные свойства микроорганизмов.
Микроорганизмы идентифицировали на микробиологическом анализаторе BD BBL™ Crystal™ AutoReader (Becton Dickinson, США) с применением панелей Crystal™ Enteric/Nonfermenter ID Kit (Becton Dickinson, США), Crystal™ Gram-Positive ID Kit (Becton Dickinson, США). Для пробоподготовки использовался Densi-La-Meter (Pliva-Lachema Diagnostika, Чехия).
Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили дис-ко-диффузионным методом согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В исследовании использовали питательную среду Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson, США) и сен-си-диски антибиотиками (Becton Dickinson, США). Чувствительность к метициллину определяли с использованием набора «MeReSa Agar Base, MRSA Alert™» (HiMedia, Индия), в соответствии с инструкцией по применению.
В работе использовали высокодисперсные нано-порошки меди (ТУ 1733-056-00209013-2008), синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала ФГУП РФ «Государственный научно-иссле-довательский институт химии и технологии элементоорганических соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ГНИ-ИХТЭОС, г. Москва).
Определение антибактериальной активности наночастиц меди осуществляли следующим образом: с каждым выделенным штаммом микроорганизмов проведены серии экспериментов с взвесями наночастиц и изотоническим раствором NaCl, используемым для приготовления взвесей:
1-я серия - с изотоническим раствором NaCl в качестве контроля;
2-я серия - с взвесью наночастиц меди в концентрациях 0.01; 0.05; 0.1; 0.5; 1 мг/мл.
Изучение антибактериальной активности нано-частиц металлов проводили по нижеизложенной методике в соответствии с МУК 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза».
Конечная концентрация микроорганизмов составляла 30 000 КОЕ/мл.
Полученную взвесь инкубировали 30, 60, 90 и 120 мин. в термошейкере Sky Line ST-3 (ELMI, Латвия) при температуре 37°С и 100 об/мин. Затем по 100 мкл каждого образца высевали на чашки Петри с питательной средой Agar nutrient (Becton Dickinson, США) и помещали в термостат при 37°С на 24 ч. На следующий день производили подсчет выросших колоний.
Для оценки степени антимикробной активности нанопорошков металлов рассчитывали коэффициент снижения количества изучаемых микроорганизмов (R) [Афиногенова и др., 2010], а также процент редукции микроорганизмов (% редукции) [Тапаль-скийи др., 2012]:
R = logNK- logNT,
% редукции = 100 - NK х 100, где NK - количество микробных клеток контрольных образцов, NT - микробных клеток опытных образцов.
Статистическую обработку данных проводили, используя пакет программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей выполняли с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, коэффициентов асимметрии и эксцесса. Оценку различий меяеду выборками проводили с помощью t-критерия Стьюдента, так как распределение переменных соответствовало нормальному.
Различия считали статистически значимыми при р < 0.05, что соответствует требованиям, предъявляемым к медико-биологическим исследованиям.
Результаты и их обсуждение
При анализе состава возбудителей, выделенных из раневого отделяемого 123 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей, установлено, что микроорганизмы представлены в виде монокультуры - у 90 пациентов (73% общего числа), и как микробная ассоциация - у 33 пациентов (27%). Всего изучено 176 штаммов.
При анализе данных микробиологических исследований отделяемого ран пациентов с хроническим остеомиелитом в виде монокультуры преобладали штаммы Staphylococcus ssp. (82%), большинство из которых относились к коагулазо-позитивным (S. aureus - 61%), что отражено на рисунке.
Второй по частоте встречаемости были грамот -рицательные бактерии семейства Enterobacteraceae - 14%. Значительно реже этиологическими агентами являлись неферментирующие бактерии - 7,5%.
У 33 обследованных пациентов выявлено наличие микробных ассоциаций. В 67% случаев они были представлены S. aureus в совокупности с грамнегативными микроорганизмами различных таксономических групп. Наличие ассоциаций микроорганизмов в ранах может свидетельствовать о неэффективности предшествующей антибактериальной терапии.
Неферментирующие бактерии:.
S.epidermi-
dis;
21%
Этиологическая структура возбудителей хронического остеомиелита, представленных в виде монокультуры
Проведен анализ антибиотикограмм 107 клинических штаммов S. aureus. Изучена чувствительность микроорганизмов к 7 классам антибактериальных препаратов.
Отмечено, что у микроорганизмов в виде монокультуры и у представителей микробных ассоциаций чувствительность к антибиотикам существенно различается. У штаммов S. aureus, выделенных в виде монокультуры, отмечалась устойчивость к метицишшну в 68% случаев, определяющая устойчивость ко всем Р-лакгамным антибиотикам. У штаммов S. aureus, выделенных в составе микробных ассоциаций, метициллинрезистентность составила 87%.
В ходе исследования установлен высокий уро-
вень резистентности клинических штаммов S. aureus к хинолонам. Устойчивость к моксифлокса-цину выявлена у 35% штаммов, к ципрофлоксаци-ну - у 56% штаммов, левофлоксацину - у 48% штаммов.
Анализ результатов выявил наличие резистентности к линкомицину у 62% штаммов S aureus, к клиндамици-ну - у 44%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об устойчивости штаммов S. aureus к антибактериальным препаратам, относящимся к линкозами-дам, являющимся препаратами выбора при MRSA-ин-фекции. Среди штаммов стафилококков не было выявлено устойчивых к линезолиду, даптомицину и тигецикли-ну.
Таким образом, у большинства исследованных штаммов S. aureus наблюдается ассоциированная устойчивость к аминогликозидам, макролидам, линкозаминам и тетрациклинам.
Резистентность к большому спектру антибактериальных препаратов создает для штаммов S. aureus адаптивные преимущества к воздействию факторов окружающей среды, способствующие быстрому распространению в популяции.
Наночастицы меди проявляют выраженную биологическую активность, в том числе бактери-остатическое и бактерицидное действия. В проведенном исследовании изучена антибактериальная активность наночастиц меди in vitro на клинических метициллинрезистентных штаммах S. aureus, выделенных от больных с остеомиелитом длинных костей конечностей. Оценено антибактериальное действие суспензий наночастиц меди различной концентрации на 30 штаммах S. aureus при различной продолжительности воздействия.
Как видно из табл. 1, количество микроорганизмов, выросших на твердой питательной среде после воздействия суспензии наночастиц меди, во всех вариантах опыта ниже, чем в контроле. Проведенные исследования показали, что низкая концентрация наночастиц меди 0.01 мг/мл при воздействии в течение 60 мин. приводила к выраженному антибактериальному эффекту, количество выживших микроорганизмов составило 20.1±4.7% (р <
0.001). Дальнейшее увеличение времени инкубации концентрации вызывало полную гибель микроорганизмов при меньших экспозициях.
Таблица 1
Антибактериальное действие наночастиц меди на штаммы S. aureus
Время воздей- ствия, мин. Количество колоний на твердых питательных средах, М±ш
Контрольная группа, п=30 Опытные группы
0.01 мг/мл. п=30 0.05 мг/мл. п=30 0.1 мг/мл. п=30
30 986.3±21.5 497.3±27.1 р<0.001 209.1±7.3 р<0.001 Роста нет
60 931.5±32.1 187.5±18.0 р<0.001 15.1±5.4 р<0.001 Роста нет
90 894.5±98.7 69.2±9.5 р<0.001 Роста нет Роста нет
120 739.3±25.2 Роста нет Роста нет Роста нет
Примечание. М - среднее арифметическое значение; ш - среднеквадратическая ошибка; р - показатель достоверности различий опытной группы по сравнению с группой контроля; п - количество наблюдений.
Повышение концентрации суспензии наночастиц меди до 0.05 мг/мл приводило к усилению антибактериальной активности. Количество микроорганизмов при продолжительности воздействия 60 мин. составило 1.6±1.2% (р < 0.001). Дальнейшее увеличение времени инкубации и концентрации наночастиц вызывало полную элиминацию микроорганизмов.
Проведен анализ эффективности антибактери-
ального действия наночастиц меди в отношении клинических штаммов S. aureus путем расчета коэффициента снижения количества микроорганизмов (R), а также процента редукции микроорганизмов (% редукции). Воздействие наночастиц меди сопровождалось высокими показателями коэффициента редукции, в концентрации 0.1 мг/мл и в течение 60 мин. он составил 3.01±0.01 при 100% редукции микроорганизмов (табл. 2).
Таблица 2
Анализ антибактериальной активности наночастиц меди в отношении штаммов S. aureus
Экспозиция, мин. Изучаемые показатели; М±т Концентрация наночастиц меди
0.01 мг/мл, п=30 0.05 мг/мл, п=30 0.1 мг/мл, п=30
30 R 0.27±0.02 0.7±0.1 2.99±0.01
% редукции 49.6±3.7 79.4±4.3 100
60 R 0.69±0.02 1.8±0.2 2.96±0.02
% редукции 81.Ш.7 98.4±5.4 100
90 R 1.1±0.1 2.95±0.01 2.95±0.01
% редукции 92.3 100 100
120 R 2.86±0.1 2.86±0.01 2.86±0.01
% редукции 100 100 100
Примечание. М - среднее арифметическое значение; m - среднеквадратическая ошибка, п - количество наблюде-
Заключение
Основную роль в качестве этиологического фактора посттравматического остеомиелита длинных трубчатых костей играет грамположительная микрофлора, представленная в основном S. aureus, и, в меньшей степени, коагулазоотрицательными стафилококками. Анализируя антибиотикорезистентность выделенной микрофлоры, следует отметить особенности стафилококков, которые заключаются как в частоте их обнаружения в раневом отделяемом у пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей, так и в приобретенной устойчивости к антибактериальным препаратам различных групп.
Наночастицы металлов являются перспективными в плане создания нового класса антибактериальных средств. Механизм антибактериального действия наночастиц металлов до конца не изучен. Воздействие наночастиц металлов на бактериальную клетку приводит к нарушению синтеза АТФ и репликации ДНК, окислительному поврслсзснию клеточных структур активными формами кислорода, а также изменению проницаемости бактериальной мембраны [Amro et al., 2010; Quillan, 2010] .
Таким образом, изучен спектр микроорганизмов, выделенных из инфицированных ран у больных хроническим остеомиелитом длинных костей конечностей, установлено значительное преобладание штаммов S. aureus, выявлен высокий уровень резистентности к антибиотикам изученных штам-
мов. Доказан выраженный антибактериальный эффект суспензии наночастиц меди в отношении антибиотикорезистентных штаммов S. aureus при их применении в низких концентрациях.
Библиографический список
Афиногенова Г.Е. и др. Новый природный антисептик галенофиллипт для лечения стафилококковой локализованной инфекции в кожно-мышечной ране у белых мышей // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2010. Т. 12, № 2. С. 170-176.
Блатун Л.А. Современные возможности антимикробной терапии раневых инфекций мягких тканей и остеомиелита // Антибиотики и химиотерапия. 2002. Т. 47, № 9. С. 31-36.
Гайдаш И.С. и др. Микробиологический спектр условно-патогенных бактерий - возбудителей посттравматических остеомиелитов // Ортопедия, травматология и протезирование. 2000. № 2. С. 89-92.
Мамаев В.И. Чрескостный остеосинтез и возможности прогнозирования исходов лечения последствий переломов костей // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. 2008. Вып. 3. С. 27-29.
Науменко З.С., Розова Л.В. К видовому составу анаэробной и аэробной микрофлоры остеомие-литического очага // Гений ортопедии. 2003. №
1. С. 121-124.
Науменко З.С. и др. Сравнительная характеристика возбудителей хронического остеомиелита в зависимости от локализации гнойного процесса // Гений ортопедии. 2010. № 4. С. 55-58.
Сабирова Е.В. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Staphylococcus spp., выделенных в ожоговом центре в 2002-2008 гг. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2010. Т. 12, № 1. С. 77-81.
Страчунский Л.С., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничные MRSA - новая проблема анти-биотикорезистентности // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005. Т. 7, № 1. С. 32-46.
Тапалъский Д.В. и др. Биосовместимые композиционные антибактериальные покрытия с пролонгированным высвобождением наночастиц серебра // Современные проблемы инфекционной патологии человека. Минск, 2012. С. 246-253.
Amro N.A. et al. High-resolution atomic force microscopy studies of the Escherichia coli outer membrane: structural basis for permeability // Langmuir. 2010. Vol. 16. P. 2789-2796.
Baker C. et al. Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles // J. Nanosci Nanotechnol. 2005. № 5. P. 244-249.
Daum R.S. Shin and soft tissue infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus // N. Engl J Med. 2007. Vol. 357. P. 380-390.
Morones J.R. et al. The bactericidal effect of silver nanoparticles //Nanotechnology. 2005. Vol. 16, № 10. P. 2346-2353.
Quillan J. Bacterial-Nanoparticle Interactions: Thesis for the degree of Doctor of Philosophy in Biological Sciences. Exeter, 2010. 211 p.
Stanila A. et al. Antibacterial activity of copper and cobalt amino acids // Non Bot Horti Agrobo. 2011. Vol. 39. P. 124-129.
Theivasanthi Т., Alagar M. Studies of copper nanoparticles effects on microorganisms // Annals of Biological Research. 2011. № 2. P. 368.
Wei Y. et al. Synthesis of stable, low-dispersity copper nanoparticles and nanorods and their antifungal and catalytic properties // J Phys Chem C. 2010. Vol. 114. P. 15612-15616.
Поступила в редакцию 24.04.2014
Etiological role of chronic osteomyelitis agents and copper nanoparticles influence on clinical Staphylococcus aureus strains
I. V. Babushkina, candidate of medicine, Senior Research Assistant
I. A. Mamonova, Junior Research Assistant
E. V. Gladkova, candidate of biology, Head of the Departament
Departament of Fundamental and Clinical Experimental Investigation Federal Government-Financed Institution “Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedics” of Ministry of Public Health of the Russian Federation. 148, Chemyshevsky street, Saratov, Russia, 410002; [email protected]; 89272233881
The investigation of microorganisms spectrum secreted from infected wounds in patients with chronic osteomyelitis of extremities long bones is conducted as well as their antibiotic sensitivity determination. It is proved that staphylococcus is the leading agent of osteomyelitis of extremities long bones, the majority of them is presented by coagulase-positive strains. The research on copper nanoparticles efficiency is fulfilled on the basis of Staphylococcus aureus strains. The expressed antibacterial effect of copper nanoparticles suspension is shown while using it in low concentrations. This effect is calculated with the help of microorganisms quantity reduction ratio and their reduction percentage.
Key words: osteomyelitis; staphylococcus; antibiotic resistance; copper nanoparticles.
Бабушкина Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Мамонова Ирина Александровна, младший научный сотрудник
Гладкова Екатерина Вячеславовна, кандидат биологических наук, руководитель отдела Отдел фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России
