CC BY
5
УДК 633.11: 579.64
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ КОБАЛЬТА НА ШТАММ BACILLUS CEREUS ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В
ОВОЩЕВОДСТВЕ
Чурилова Вероника Вячеславовна, аспирант кафедры химии, veronicka.churilova@yandex.ru Полищук Светлана Дмитриевна, д-р техн. наук, профессор кафедры химии, svpolishuk@mail.ru Чурилов Дмитрий Геннадьевич, канд. техн. наук, ст. преподаватель кафедры технологии металлов и ремонта машин, churilov.dmitry@yandex.ru
Назарова Анна Анатольевна, канд. биол. наук, доцент кафедры химии, nanocentr-apk@yandex.ru Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева
При определении целесообразности использования в сельскохозяйственной практике микробно-рас-тительных систем необходим комплексный подход по разработке способов повышения их эффективности за счет средств эндогенной (виды и сорта растений) и экзогенной (биопрепараты, регуляторы роста, макро- и микроудобрения) регуляции растительно-микробных взаимодействий при применении биологически активных веществ в конкретных условиях. Рассматривая наночастицы как основу образования композитов с природными биополимерами и бaктeриями, можно значительно повысить нормальное функционирование растительного организма, но для этого необходимо подобрать концентрации, размеры, структуру наночастиц, в среде которых бактерии будут обладать активностью. Наша цель - включить в эту схему наночастицы биогенных металлов. Воздействуя на генетический потенциал семян, с одной стороны, и активность микрофлоры, с другой, они должны повысить устойчивость растений к болезням и длительно улучшить состояние почвы. Это важно для тепличного хозяйства. Особенности возделывания овощей в защищенном грунте - большие расходы на создание микроклимата и огромное количество различных опасных для человека химических препаратов, ежегодная смена грунта во избежание накопления вредителей и болезней. Рентабельность производства в этих условиях может быть обеспечена лишь при использовании новейших достижений науки и техники и эффективной организации производства. Нами была разработана методика тестирования и отработана технология использования наноча-стиц биогенных металлов как биологически активных и экологически безопасных материалов. Изучена методика выделения штaмма Bacillus cereus. Установлено, что характер влияния наночастиц на рост клинических штаммов и выраженность антибактериального эффекта зависят от вида наночастиц, их концентрации, времени воздействия.
Ключевые слова: наночастицы, биологическая активность, бактерии, энергия прорастания, показатели роста семян огурца.
Введение ров в стимулировании развития растений. Наличие
Получение высококачественной экологически бактерицидной активности у нанопрепаратов -безопасной растениеводческой продукции, кото- важная особенность для борьбы с патогенными рая обеспечила бы необходимый уровень здоро- микроорганизмами, позволяющая разрабатывать вья человека, - основная задача биологического современные агротехнологии, способные обеспе-земледелия. В настоящее время ведущая роль от- чить повышение урожая, его качество, сохраняя водится длительной экологической (адаптивной) плодородие почвы [4,5] и улучшая ее фитосани-селекции растений, призванной способствовать тарное состояние, оказывая при этом антагони-на-иболее полному использованию биоклимати- стическое действие на фитопатогены. ческих ресурсов и мобилизации внутреннего био- Объекты и методы
логического потенциала растений. Реализация На базе «Наноцентра для АПК» при РГАТУ потенциала сортов и гибридов в значительной нами был произведен лабораторный опыт с ис-степени определяется организацией семеновод- пользованием наночастиц (НЧ) металлов и бакте-ства, сортовыми и посевными качествами семян. рии ВасП^ cereus на семенах посевного огурца Не менее важным компонентом решения пробле- сорта «Новинка».
мы являются биопрепараты на основе наночастиц Растение индетерминантное, сильнорослое, и микроорганизмов, позволяющие после одно- сильноплетистое, преимущественно женского кратной обработки семян более полно реализо- типа цветения. Лист зеленый, крупный. Зеленец вать генетический потенциал различных сортов короткий, цилиндрический, темно-зеленый с длин-и гибридов овощных культур, увеличить урожай- ными полосами и слабовыраженной пятнисто-ность (30-40%), биосинтез биологически активных стью, крупнобугорчатый, опушение черное, сред-полимеров (25-45%) и защитить растения [1,2,3]. ней плотности. Масса зеленца 90-120 г. Товарная В настоящее время следует осуществлять пе- урожайность 232-508 ц/га, на 20-64 ц/га выше реход к более прогрессивной системе - созданию стандартов Алексеич и Надежда. Выход товарной биопрепаратов на основе биологически активных продукции 78-97%. Сорт отличается способно-наночастиц и микроорганизмов. Особенность хи- стью к длительному периоду плодоношения даже мического взаимодействия наночастиц с жидкой в экстремальных условиях вегетации. Устойчив к средой является одним из определяющих факто- ложной мучнистой росе (пероноспороз).
© Чурилова В. В., Полищук С. Д., Чурилов Д. Г., Назарова А. А. 2017 г.
Трибуна молодых учёных
3
Bacillus cereus - подвижные (жгутиковые), спо-рообразующие, палочковидные бактерии, принадлежащие к роду Bacillus. Являются сапрофитами, широко распространены в природе и легко обнаруживаются в почве. Клетки имеют тенденцию располагаться в виде цепочек, от стабильности которых во многом зависит форма колонии - она сильно варьирует у различных штаммов. Образуют споры эллипсоидной формы, которые располагаются центрально, но не расширяют клетки.
В лабораторных условиях изучалось действие наночастиц кобальта, размером 25-35 нм. Для проявления биологической активности нанопорош-ки подвергали процессу диспергирования. Был применен способ диспергирования наночастиц в воде, а также проведен выбор оптимального режима, обеспечивающего получение стабильных коллоидных растворов для последующего контроля их качества. НЧ диспергировали в дистиллированной воде при помощи ультразвуковой обработки, продолжительность гомогенизации - до 10 минут, мощность - 300 Вт, частота - 23 кГц с помощью ультразвукового диспергатора Hielsher UIP1000hd (Hielscher Ultrasonics, Германия). Экспериментальная часть Для изучения влияния суспензий НЧ на витальные, метрические и весовые показатели семян огурца использовали:
1) контроль - гелеобразная (полисахаридная) культивационная среда без добавления наночастиц;
2) коллоидный раствор нанопорошка кобальта из расчета 0,01 г наночастиц на гектарную норму высева семян (Со 0,01);
3) коллоидный раствор нанопорошка кобаль-
та из расчета 0,1 г наночастиц на гектарную норму высева семян (Со 0,1);
4) коллоидный раствор нанопорошка кобальта из расчета 1,0 г наночастиц на гектарную норму высева семян (Со 1,0);
5) коллоидный раствор нанопорошка кобальта из расчета 10,0 г наночастиц на гектарную норму высева семян (Со 10,0).
При оценке воздействия НЧ на семена определяли всхожесть семян (%), энергию прорастания (%), линейные размеры надземных и подземных частей проростков в течении 10 дней в полисаха-ридной среде, содержащей коллоидный водный раствор НЧ кобальта разных концентраций. В каждом опыте оценивалось по 200 семян. Условия проращивания соответствовали требованиям методики ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур».
Эксперименты с Bacillus cereus проводили с учётом рекомендаций Роспотребнадзора. В качестве контроля использовали культуру Bacillus cereus, взвешенную в дистиллированной воде в концентрации 1 единица по Макфарланду, что соответствует примерно 3^107 КОЕ/см3. Смешивали 1,0 см3 взвеси 3^107 КОЕ/см3 и 1,0 см3 дистиллированной воды, получив концентрацию взвеси 5*106 КОЕ/см3. Затем из этой взвеси делали высев на питательный агар методом штриховой разводки, инкубировали при 370С 24 часа. Путем расчета по стандартной таблице вычисляли количество клеток Bacillus cereus.
Результаты
Витальные показатели семян огурца при взаимодействии с наночастицами кобальта различной концентрации показаны в таблице 1.
Таблица 1 - Энергия прорастания (на 3-и сутки) и всхожесть (на 7-е сутки) семян огурца при взаимодействии с наночастицами на гелеобразной культивационной среде
Варианты Контроль Со 0,01 Со 0,1 Со 1,0 Со 10,0
Энергия прорастания, % 92,0 92,0 94,0 98,0 90,0
Всхожесть, % 95,2 91,2 95,2 99,2 95,2
Практически все тестируемые концентрации нанопорошков способствовали увеличению энергии прорастания семян огурца в среднем на 2,2-6,5 %, а всхожесть - на 1,4-4,0% относительно контроля при концентрации нанопорошков 0,1-1,0 г на гектарную норму высева семян, которую можно принять как оптимальную
Таблица 2 - Метрические показатели проростков семян огурца (на 3-и сутки) и весовые показатели при взаимодействии с наночастицами на гелеобразной культивационной среде
Варианты Длина надз. части проростка, мм Длина подз. части проростка, мм Масса надземной части проростка, мг Масса подземной части проростка, мг
Контроль 25,5 42,8 18,7 3,1
Со 0,01 26,0 44,1 20,2 4,2
Со 0,10 27,5 44,9 21,8 3,8
Со 1,0 28,6 46,8 21,9 5,2
Со 10,0 28,1 45,3 21,0 4,9
Более сильное влияние на динамику роста проростков семян огурца оказали наночастицы кобальта при концентрации в культивационной среде 1,0 г на гектарную норму высева семян:
длина надземной части проростка относительно контроля выросла на 11,8%, длина подземной части проростков относительно контроля выросла на 10,9%.
Повышение концентрации наночастиц кобальта от 0,01 г/га до 1,0 г/га способствовало повышению массы как надземной (+17%), так и подземной частей (+67%) проростка огурца по сравнению с контролем. Развитие подземной части значительно превышало рост надземной. При концентрации наночастиц кобальта 1,0 г/га масса проростков (табл. 2) была максимальной, что доказывает высокую биологическую активность наночастиц кобальта. Следовательно, биологически активные наночастицы кобальта способствуют росту и развитию семян огурца, при этом наблюдается усиление развития корневой системы, что является необходимым условием для выживания и последующего роста огурца.
В эксперименте при изучении действия НЧ кобальта на штамм Bacillus cereus смешивали 1,0
см3 взвеси 3х108 КОЕ/см3 Bacillus cereus и коллоидный водный раствор НЧ кобальта в концентрациях 0,01г/га, 0,10 г/га, 1,0 г/га, 10 г/га в четырех пробирках в трёхкратной повторности.
Негативный эффект наночастиц кобальта по отношению к бактериям Bacillus cereus начинал проявляться в концентрации 1,0 г/га, в дальнейшем следовало изменение токсичности НЧ, достигавшее максимума при концентрации 10 г/га (табл. 3). Результаты экспериментов с исследованным видом бактерий согласуются с данными об антимикробной активности углеродных НЧ [6]. Неравномерная динамика изменения экотоксикологиче-ских свойств, описанная и для других НЧ [7], не позволила определить полулетальные и безопасные концентрации для Bacillus cereus.
Таблица 3 - Воздействие наночастиц кобальта на тест-объект Bacillus cereus
Концентрация НЧ, г/га 0 0,01 0,10 1,0 10,0
Число клеток бактерий / 1 см3 1х105 5х105 5х105 1х105 5х104
Далее приготовленные смеси наночастиц кобальта и бактерий Bacillus œreus переносили в чашки Петри с семенами огурца. В каждом опыте оценивалось по 200 семян при трехкратной повторности. Тестирование проводили в камере: в темноте, при 25ОС, в течение трех суток.
Таблица 4 - Метрические показатели проростков семян огурца (на 3-и сутки) и их весовые показатели при одновременном взаимодействии с наночастицами и бактериями Bacillus œreus при 250С
Варианты Длина надземной части проростка, мм Длина подземной части проростка, мм Масса надземной части проростка, мг Масса подземной части проростка, мг
Контроль 25,5 42,8 18,7 3,1
Со 0,01 и объект В. cereus 32,0 49,1 24,2 5,1
Со 0,10 и объект В. cereus 30,8 50,3 23,3 4,9
Со 1,0 и объект В. cereus 28,5 40.8 13,3 3,0
Со 10,0 и объект В. cereus 24,6 40.3 15,0 3,2
Присутствие тест-объекта Bacillus œreus значительно увеличило метрические показатели проростков семян огурца: при концентрации кобальта 0,01 г/га - на 25% (надземная часть) и на 14% (подземная часть); при концентрации Нч кобальта 0,10 г/га - на 17% (подземная часть) и на 20% (надземная часть).
Масса надземной части проростков при концентрации кобальта 0,01 г/га на 29 % выше контроля, при 0,1 г/га - на 24%. Масса подземной части проростков увеличилась на 64% (0,01 г/га) и на 58% (0,10 г/га) выше контроля. Эти изменения выше, чем в отсутствии Bacillus œreus в среде.
При более высоких концентрациях наночастиц кобальта (10г/га) в присутствии Bacillus œreus идет угнетение развития проростков семян огурца.
Выводы
1. Выявлена специфика экологического воздействия наночастиц кобальта размером 25-35 нм в интервале концентраций 0,01-10,0 г на гектарную норму высева семян, проявляющаяся в усилении
стимуляции роста вегетативных частей растений и прорастании семян огурца.
2. Экологическая оценка толерантности организмов Bacillus œreus к воздействию наночастиц кобальта выявила тенденцию к уменьшению при повышении концентраций НЧ кобальта. Показано, что безопасная для бактерий концентрация нано-частиц кобальта не превышает 10,0 г на гектарную норму высева.
3. Перспективы дальнейших исследований в предметной области связаны, прежде всего, с выявлением механизмов токсичности НЧ для формирования научных основ безопасного развития нанотехнологий.
Список литературы
1. Назарова, А.А. Нанотехнологии работают на урожай [Текст] / А.А. Назарова, С.Д. Полищук, В.В. Чурилова [и др.] // Картофель и овощи. - №2. -2017. - С.28-30.
2. Назарова, А.А. Физиологические, биохимические и продуктивные показатели пивоваренного
Трибуна молодых учёных
ячменя при использовании биологически активных наноматериалов [Текст] / А.А. Назарова, С.Д. По-лищук, В.В. Чурилова // Сахар. - №1. - 2017. -С.22-25.
3. Полищук, С.Д. Биологическая эффективность нанопорошков и коллоидов [Текст] / С.Д. По-лищук, А.А.Назарова [и др.] // Нанотехника. -2013. -№ 4. - С. 69.
4. Polishchuk, S.D. Physiological and biochemical grounding of different nanomaterials use when growing corn seeds [Text] / S.D. Polishchuk, A.A. Nazarova, N.V. Byshov [etc.] // Modern Applied Science. - 2017. - Т. 11. - № 1. - S. 195-203.
5. Чурилов, Д.Г. Особенности роста и развития кукурузы и подсолнечника при обработке семян наночастицами кобальта [Текст] / Д.Г. Чурилов, С.Д., Полищук, И.В. Бакунин [и др.].//Труды ГОСНИТИ. -2011. -№ 2. -Т. 107. - С. 46-48.
6. Kang S., Herzberg M., Rodrigues D.F., Elimelech M. Antibacterial Effects of Carbon Nanotubes: Size Does Matter! // Langmuir. - 2008. - 24 (13). - P. 6409-6413.
7. Nascarella M.A., Calabrese E.J. A method to evaluate hormesis in nanoparticle dose-responses // Dose-Response. - 2012. - 10:344-354.
INFLUENCE OF COBALT NANOPARTICLES ON BACILLUS CEREUS STRAIN TO BE USED IN
VEGECULTURE
Churilova, Veronika V., Aspirant of the of the Faculty of Chemistry, veronicka.churilova@yandex.ru
Polischuk, Svetlana D., Doctor of Technical Science, Full Professor of the of the Faculty of Chemistry, svpolishuk@mail.ru
Churilov, Dmitriy G., Candidate of Technical Science, senior teacher of chair of technology of metals and repair of machines, churilov.dmitry@yandex.ru
Nazarova, Anna A., Candidate of Biological Science, Associate Professor, Faculty of Chemistry, nanocentr-apk@yandex.ru
Ryazan State Agrotechnological University named after P.A. Kostychev
When determining the practicability of using some bacteria-plant systems in agriculture it is necessary to have a comprehensive approach to develop ways of increasing their efficiency by means of endogenous (plant species and varieties) and exogenous (biodrugs, growth regulators, macro- and micro-fertilizers) regulation of plant-microbial interactions when using biologically active substances in specific conditions. Considering nanoparticles as the basis of composites with natural biopolymers and bacteria, the normal functioning of the plant organism can be significantly increased, but it is necessary to select the concentrations, sizes, and structure of nanoparticles where bacteria will be active. Our goal is to include nanoparticles of biogenic metals in this scheme. Influencing the genetic potential of seeds on the one hand and the activity of micro flora on the other hand, they should increase the plants tolerance to diseases and improve the soil for a long time. This is important for a greenhouse farm. Peculiarities of growing vegetables in the protected ground are large expenses to create the microclimate, lots and lots of various dangerous for the person chemical preparations and annual ground change in order to avoid accumulation of pests and diseases. The profitability of production in these conditions can be ensured only by using the latest achievements of science and technology and the effective organization of production.
We developed a test procedure and perfected a technology of using nanoparticles of biogenic metals as biologically active and environmentally safe materials. The technique of isolating Bacillus cereus strain was studied. It is established that the nature of nanoparticles effect on the growth of clinical strains and the degree of the antibacterial effect depends on the type of nanoparticles, their concentration, and exposure time.
Key words: nanoparticles, biological activity, bacteria, germinating energy, parameters of cucumber seeds growth.
Literatura
1. Nazarova, A.A. Nanotekhnologii rabotayut na urozhaj [Tekst] /A.A. Nazarova, S.D. Polishhuk, V.V. Churilova [i dr.] // Kartofel' i ovoshhi. - № 2. - 2017. - S. 28-30.
2. Nazarova, A.A. Fiziologicheskie, biokhimicheskie i produktivnye pokazateli pivovarennogo yachmenya pri ispol'zovanii biologicheski aktivnykh nanomaterialov [Tekst]/A.A. Nazarova, S.D. Polishhuk, V.V. Churilova // Sahar. - № 1. - 2017. - S. 22-25.
3. Polishhuk, S.D. Biologicheskaya ehffektivnost' nanoporoshkov i kolloidov [Tekst]/ S.D. Polishhuk, A.A. Nazarova [i dr.]// Nanotekhnika. - 2013. -№ 4. - S. 69.
4. Polishchuk, S.D. Physiological and biochemical grounding of different nanomaterials use when growing corn seeds [Text] / S.D. Polishchuk, A.A. Nazarova, N.V. Byshov [etc.] // Modern Applied Science. - 2017. -Vol. 11. - № 1. - S. 195-203.
5. Churilov, D.G. Osobennosti rosta i razvitiya kukuruzy i podsolnechnika pri obrabotke semyan nanochasticzami kobal'ta [Tekst]/D.G. Churilov, S.D., Polishhuk, I.V. Bakunin [i dr.]// Trudy GOSNITI. -2011. - № 2. - T. 107. - S. 46-48.
6. Kang S., Herzberg M., Rodrigues D.F., Elimelech M. Antibacterial Effects of Carbon Nanotubes: Size Does Matter! // Langmuir. - 2008. - 24 (13). - P. 6409-6413.
7. Nascarella M.A., Calabrese E.J. A method to evaluate hormesis in nanoparticle dose-responses // Dose-Response. - 2012. - 10:344-354.
