ВЛИЯНИЕ N-АДАМАНТОИЛ-α-АМИНОКИСЛОТ И N-(ПИРИДИН4-ИЛ)3-(1-АДАМАНТАНКАРБОКСАМИДО-ЭТИЛ)ИНДОЛА НА ИНДУЦИРОВАННУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ

Ермохин В.А.; Кленова Н.А.; Зарубин Ю.П.; Ширмаер Е.Ф.; Пурыгин П.П.

УДК547.583, 615.273

ВЛИЯНИЕ Л-АДАМАНТОИЛ-а-АМИНОКИСЛОТ И Л-(ПИРИДИН-4-ИЛ)- 3-(1-АДАМАНТАНКАРБОКСАМИДО-ЭТИЛ)ИНДОЛА НА ИНДУЦИРОВАННУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ

Самарский государственный университет

Поступила в редакцию 05.10.2010

Ж-(1-адамантоил)-В,Ь-гистидин уменьшает агрегацию тромбоцитов, индуцируемую серотонином на 41%. 3-(1-Адамантанкарбоксамидоэтил)индол усиливает серотонин-индуцированную агрегацию на 26%.

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, серотонин

Производные аминокислот, в частности ^-ацил-а-аминокислоты, вызывают постоянный интерес благодаря своему исключительно широкому спектру действия и чрезвычайно важной роли в жизнедеятельности клетки. Наличие в молекуле ацильного фрагмента придает этим соединениям гидрофобные свойства и позволяет проявлять поверхностно-активные и седативные свойства. Для лечения болезни Паркинсона известен лекарственный препарат допамантин ^-(1-адамантилкарбонил)-3,4-ди-гидро-ксифенилэтиламин [1]. Химия и сведения по фармакологической активности N-адамантоилированных пептидов изложены лишь в нескольких публикациях [2-4]. Ранее было показано, что объемный адамантильный заместитель оказывается необходимым для увеличения сродства соединений к 5-HT2-рецепторам тромбоцитов [5, 6]. В данной статье изучено влияние двух ^-адамантоил-а-аминокислот и производного триптамина на индуцированную серотонином агрегацию тромбоцитов.

Экспериментальная химическая

часть. В качестве объектов для N-адаман-тоилирования были выбраны две аминокислоты — В,Ь-гистидин 2а и В,Ь-триптофан 2б, которые декарбоксилируются в организме до

Ермохин Владимир Анатольевич, кандидат химических наук, инженер кафедры органической, биоорганической и медицинской химии. E-mail: ermochin@mail.ru

Кленова Наталья Анатольевна, доктор биологических наук, профессор кафедры биологической химии Зарубин Юрий Павлович, кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры органической, биоорганической и медицинской химии Ширмаер Екатерина Федоровна, студентка Пурыгин Петр Петрович, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой органической, биоорганической и медицинской химии

биогенных аминов, и один биогенный амин -2-(3-индолил)этиламин (триптамин) для исследования действия на серотониновые рецепторы тромбоцитов. Известно два основных способа синтеза К-ациламинокислот — ацили-рование аминокислот либо ацилирование их эфиров [7, 8]. Ацилирование аминокислот хло-рангидридами - один из наиболее распространенных методов для получения К-ацил-аминокислот. Он был положен в основу промышленного производства целой серии продуктов, например «медиаланов» — производных саркозина. Существуют различные модификации этого метода. Реакцию проводят в водных растворах, водно-органических смесях, содержащих 30-50% инертного водорастворимого органического растворителя и в системах двух несмешивающихся растворителей, одним из которых является вода. Следует отметить, что в последнем случае, например в системе вода-толуол, выход целевого продукта значительно снижается [7].

При исследовании кинетики ацилирова-ния а-аминокислот бензоилхлоридом в водных растворах показано [8], что аминогруппа изучаемых аминокислот обладает высокой реакционной способностью, которая определяется формой ее существования в растворе. Наиболее реакционноспособными являются формы, имеющие свободные аминогруппы

ВДСНЯСОО- (А) и ВДСИ^СООИ (В), при этом активность формы А выше. В воде реакции протекают медленно, в связи с чем увеличивается вероятность гидролиза амидной связи, особенно при нагревании.

Ацилирование Б,Ь-триптофана осуществляли 1-адамантоилхлоридом в присутствии триэтиламина при нагревании в течение 17 ч в среде абсолютного толуола. Выход составил

2032

37%. Нами установлено, что выход целевого продукта увеличивается при проведении реакции в водно-диоксановой среде. При адаман-тоилировании В,Ь-гистидина и В,Ь-трипто-фана в присутствии гидроксида натрия в среде диоксан/вода (1:1) найдено, что для повышения степени чистоты получаемого продукта

необходимо соблюдение ряда условий (рН=10, температура не выше 25 С, интенсивное перемешивание в процессе добавления 1-адамантоилхлорида). Для выделения чистых веществ реакционную массу упаривают, экстрагируют спиртом, отгоняют растворитель и осадок очищают флаш-хроматографией.

К' '

о

С1

СИ2-

кн2

I 2

я—СИ—соон 1а,б

№ОИ

диоксан; Н20

И б

кн б

СИ

о II

КН—с-

я—сн—соон 2 а, б

При ацилировании гистидина 1а и триптофана 1б по методу Шоттен-Баумана в вод-но-диоксановой среде выход продукта увеличился до 53%, время реакции сократилось до 2 ч. Синтез 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)

индола 4 осуществлялся взаимодействием триптамина 3 в толуоле в присутствии триэти-ламина с хлорангидридом 1-адамантанкарбо-новой кислоты по следующей схеме

о

^ + НК С1

1КН 4

+

3

При ацилировании 2-(3 -индолил) этила-мина 6 выход целевого продукта увеличивается по сравнению с триптофаном 3б. Это можно объяснить протонированием аминогруппы в В,Ь-триптофане 2б и дополнительным стерическим препятствием со стороны карбоксильной группы. В табл. 1 и 2 представлены время протекания реакций и данные ИК и ЯМР *Н спектров полученных соединений.

В ИК спектрах соединений наблюдаются полосы поглощения сильной интенсивности 2908-2847 см-1 и 1720-1654 см-1, соответствующие валентным колебаниям

связей С-И адамантанового ядра и С=о фрагмента амидных и карбоксильных групп. Также наблюдается поглощение у(К-Н) в области 3413-3217 см-1. В спектрах Н ЯМР наблюдаются три сигнала протонов каркаса адамантана в области 1.70-2.21 м.д., также присутствует сигнал протона у азота гетеро-цикла в области 8.40-8.88 м.д. (1Н). Полученные соединения исследованы на агрега-ционную активность в отношении тромбоцитов крови человека в присутствии серото-нина.

Таблица 1. Температуры плавления, время протекания реакций и выходы соединений 1 а, 1 б, 4

Название соединения Т.пл., Яг Время Вы

°С реакции, ход

ч %

2а ^-(1-адамантоил)-Б,Ь-гистидин 194-196 0,45* 2 55

2б ^-(1-адамантоил)-Б,Ь-триптофан 84-86 0,64* 2 53

17*** 37* * *

4 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индол 70 0,87** 5*** 57***

Примечание: * - этанол, ** - этилацетат, *** - данные при проведении реакции в толуоле в присутствии триэтиламина

2033

Таблица 2. Данные ИК и ЯМР ХН спектров для соединений 1а, 1 б и 4

Соединение ИК спектр, v, см-1 Спектр ЯМР 1Н, 8 (м.д., от ТМС); J, Гц

v(C-H) Ad v(N-H), v(C=O) HAd, HCH2 HAr(Het), HNH

1а 2904, 2847 3413, 1700, 1640 1.64 м (6H, CH2), 1.76 д (6H, CH2), 1.92 c (3H, CH), 2.92 м (2H, CH2), 3.99 к (8 Гц, 1H, CH) 6.59 с (1H, №t), 6.96 д (6 Гц, 1H, Het), 7.41 с (1H, NH), 8.43 c (1H, NH №t)

1б 2908, 2850 3394, 3317, 1720,1693, 1654 1.65 м (6H, CH2), 1.76 м (6H, CH2), 1.94 c (3H, CH), 2.80 с (2H, СН2), 4.15 м (1H, CH) 6.96 м (1H, Het ), 7.04 м (1H, Het), 7.10 с (1H, Het), 7.27 м (1H, Het), 7.45 м (1H, Het), 7.53 м (1H, NH), 8.40 c (1H, NH, Het)

4 2908, 2850 3413, 3217, 1693, 1640 1.65 м (6H, CH2), 1.76 м (6H, CH2), 1.94 c (3H, CH), 2.79 т (7,8 Гц, 2H, СН2) 3.30 к (7,8 Гц, 2H, СН2) 6.96 т (7,0 Гц, 1H, Het), 7.04 т (7,0 Гц, 1H, Het), 7.10 д (4 Гц, 1H, Het), 7.33 д (8 Гц, 1H, Het), 7.41 т (6 Гц, 1H, Het), 7.53 д (8 Гц, 1H, NH), 8.88 c (1H, NH Het)

Экспериментальная биологическая часть. Для выявления у исследуемых соединений синергетических свойств по отношению к серотониновым рецепторам нами проведены опыты с серотонином в качестве активатора агрегации. Для получения богатой тромбоцитами плазмы крови использовали свежеза-бранную донорскую кровь с 3,8% цитрата натрия в качестве антикоагулянта. Кровь центрифугировали при 250 g, 10 минут, полученную плазму стандартизировали по количеству тромбоцитов, внося физиологический раствор (рН 7,2) до получения оптической плотности (600 нм, 1 см) 0,5 ед. Агрегацию тромбоцитов в присутствии исследуемых соединений исследовали фотометрическим методом Борна, основанном на определении оптической плотности плазмы, обогащенной тромбоцитами. В качестве агрегирующего агента использовали серотонина креатининсульфат фирмы «Merck» в конечной концентрации 1-10- M. Интенсивность агрегации оценивали по падению оптической плотности (600 нм, 1 см, СФ-46) за 30 минут и выражали в у.е.=ДО.П.*1000.

Результаты исследований и их обсуждение. Определяли изменения агрегирующей активности тромбоцитов при воздействии на них синтезируемых соединений 1а, 1б, 4 и серотонина креатинисульфата. Для серотонина на мембране тромбоцитов существует два типа рецепторов - ионные каналы и рецепторы, сопряжённые с G-белками, поэтому, являясь их лигандом, он может индуцировать процессы агрегации тромбоцитов двумя путями. Влияние соединений на скорость агрегации тром-

боцитов может быть обусловлено их способностью усиливать сродство индуктора агрегации к рецепторам (синергисты) или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Кроме того, возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с ре-цепторной молекулой.

Показано что, ^-адамантоильное производное биогенного амина триптамина 4 проявляет свойства слабого синергиста, при введении карбоксильной группы эффект полностью пропадает для 1б, а замена индольного гетероцикла на имидазольный в N-(1-адамантоил)-В,Ь-гистидине 1а приводит к уменьшению агрегирующего эффекта серотонина на 38% (рис. 3 и табл. 3). Полученные результаты с добавлением исследуемых веществ при индукции агрегации тромбоцитов серотонином показали способность одного из соединений блокировать проведение сигнала через сопряженные с О-белками серотонино-вые рецепторы. Наиболее активное уменьшение серотонин-индуцируемой агрегации оказывает соединение 1а, в молекуле которого расстояние между атомом азота пиридина и атомом кислорода амидной группы соответствует 5,75 А, оно примерно такое же, как в молекуле серотонина (табл. 3). Это согласуется и с теоретическим предсказанием возможной антисеротонинэргической активности у данного соединения и является еще одним обоснованием того, что уменьшение агрегации, вероятно, связано с конкурентным блокированием серотониновых рецепторов.

2034

Таблица 3. Влияние производных адамантана на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

№ Структура соединений Интенсивность агрегации, усл. ед Характер действия

контроль опыт

1а £4 COOH g_cH_c„ N H 34,2±3,8 20,8±0,7* антагонист

1б i cooh /==4 H CH-CHrri} N H 27,8±1,9 24,3±1,0 не проявляет активности

4 J 0-л0 N H 33,03,4 46,0±0,9* слабый синергист

Примечание: * уровень достоверности Р<0,01

Таким образом, полученные экспериментальные данные подтверждают биологическую активность исследуемых соединений по отношению к тромбоцитам крови человека in vitro. Результаты наших исследований подтверждают известные литературные данные о том, что введение в молекулу производного высоколи-пофильного адамантильного радикала усиливает его взаимодействие с гидрофобными областями рецепторных молекул [1, 2], соединение 1б имеет подобную активность, препятствуя проведению сигнала активации серотони-ном.

Выводы: исследуемые производные адамантана оказывают различное действие на индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека, было найдено 2 соединения, проявляющих свойства антагониста и синергиста, при серотонин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека in vitro, что является следствием их способности влиять на функционирование тромбоцитарных рецепторов. Показано что наибольшая активность характерна для N-(1-адамантоил)-В,Ь-гистидина проявляющего свойства антагониста (увеличение на 38%). Эффект усиления агрегации в присутствии 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индола на 39%

предположительно обусловлен способностью данного производного увеличивать эффективность функционирования гликопротеиновых рецепторов на поверхности тромбоцитов. Механизм влияния данных производных адаман-тана на серотонин-индуцированную аггрега-цию требует дальнейшего изучения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Ковтун, В.Ю. Использование адамантанкарбо-новых кислот для модификации лекарственных средств и биологически активных соединений / В.Ю. Ковтун, В.М. Плахотник // Хим.-фарм. журн. 1987. Т. 28, № 8. С. 931-940.

2. Dok, Q. Synthesis and biological properties of en-hephalin-life peptides containing adamantylalanine in position 4 and 5 / Q. Dok, R. Schwyzer // Helv chim Acta. 1981. V. 64, №7. P. 2084-2089.

3. Pfeipfe, F.R. N-Acylation of thyrosine during peptide sinthesis / F.R. Pfeipfe, P.A. Chambers, E.E. Helbert et al. // J. Med. Chem. 1984. V. 27. P.325-341.

4. Данилин, А.А. Реакции C, N, O-алкилирования a-бромкетонами адамантанового ряда. / Дисс. канд. хим. наук. Самара. 2000. С. 89-93.

5. Fujio, M. N-[1-(2-Phenylethyl)pyrrolidin-3 -yl] -1-adamantanecarboxamides as novel 5-HT2 receptor antagonists / M. Fujio, T. Kuroita, Y. Sakai et al. // J. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2000. V. 10. P. 2457-2461.

2035

6. Bojarski, A.J. The influence of substitution at aromatic part of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline on in vitro and in vivo 5-HTia /5-Ht2a receptor activities of its 1-adamantoyloaminoalkyl derivatives / A.J. Bojarski, M.J. Mokrosz et al. // J. Bioorg. Med. Chem. 2002. V. 10. P. 87-95.

7. Михалкин, А.П. Получение, свойства, примене-

ние Л-ацил-а-аминокислот / А.П. Михалкин // Успехи химии. 1995. Т. 64, вып. 3. С. 275-280. 8. Акимова, А.А. Ациламинокислоты синтез и свойства / А.А. Акимова, О.И. Галахов // Изв. Вузов. Химия и химическая технология. 1987. Т. 30, № 6. С. 114-117.

INFLUENCE OF N-ADAMANTOIL-A-AMINO ACIDS AND N-(PYRIDINE-4-IL) - 3 (1-ADAMANTANCARBOXAMIDO-ETHYL) INDOL ON INDUCED AGGREGATION OF THROMBOCYTES

Samara State University

A-(1-adamantoil)-D,L-histidine reduces thrombocytes aggregation, induced by serotonin on 41%. 3 (1-adamantancarboxamidoethyl)indol strengthens serotonin-induced aggregation on 26%.

Key words: thrombocytes aggregation, serotonin

Vladimir Ermohin, Candidate of Chemistry, Engineer at the Department of Organic, Bioorganic and Medical Chemistry. E-mail: ermochin@mail.ru Nataliya Klenova, Doctor of Biology, Professor at the Biochemistry Department Yuriy Zarubin, Candidate of Chemistry, Senior Lecturer at the Department of Organic, Bioorganic and Medical Chemistry Ekaterina Shirmayer, Student

Petr Purygin, Doctor of Chemistry, Professor, Head of the Department of Organic, Bioorganic and Medical Chemistry

2036

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Ермохин В. А., Кленова Н. А., Зарубин Ю. П., Ширмаер Е. Ф., Пурыгин П. П.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Ермохин В. А., Кленова Н. А., Зарубин Ю. П., Ширмаер Е. Ф., Пурыгин П. П.

INFLUENCE OF N-ADAMANTOIL-A-AMINO ACIDS AND N(PYRIDINE-4-IL) 3 (1-ADAMANTANCARBOXAMIDO-ETHYL) INDOL ON INDUCED AGGREGATION OF THROMBOCYTES

Текст научной работы на тему «ВЛИЯНИЕ N-АДАМАНТОИЛ-α-АМИНОКИСЛОТ И N-(ПИРИДИН4-ИЛ)3-(1-АДАМАНТАНКАРБОКСАМИДО-ЭТИЛ)ИНДОЛА НА ИНДУЦИРОВАННУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ»