CC BY
18
УДК 57.089.22
влияние ^(4-мЕтил-3-хлорфЕнил)-2-АцЕтокси-3,5-дихлорбешамида на половозрелых и ювЕнильных
осоБЕй O. FELINEUS В условиях IN VITRO и IN VIVO
Дамира Фуатовна АВГУСТИНОВИЧ1, Галина Борисовна ВИШНИВЕЦКАЯ1, Дарья Сергеевна ПИРОЖКОВА1, Михаил Александрович ЦЫГАНОВ1,2, Валентин Андреевич ВАВИЛИН3, Мария Юрьевна ПАХАРУКОВА1, Александр Геннадьевич ШИЛОВ1, Владимир Геннадьевич ДУДАРЕВ4, Вячеслав Алексеевич МОРДВИНОВ1,3
1 Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10
2 Новосибирский государственный университет 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2
3 НИИ молекулярной биологии и биофизики 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2/12
4 Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Минздрава России 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14
Цель работы - определить антигельминтные свойства нового вещества из класса салициланилидов, N-^-метил-3-хлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамида (надината), при воздействии на трематоду O. felineus в условиях in vitro in vivo. Материал и методы. В условиях in vivo оценивали действие вещества на ювенильные формы паразита у мышей инбредной линии C57BL/6, на взрослых описторхов у сирийских хомячков (Mesocricetus auratus). В экспериментах in vitro чувствительность взрослых и ювенильных гельминтов оценивали по значениям полуэффективной (IC50) и эффективной (IC95) концентрации надината, обусловливающего их обездвиженность. Результаты и их обсуждение. В экспериментах in vitro установлена высокая чувствительность взрослых гельминтов к данному веществу, но еще более выраженный обездвиживающий эффект надинат оказывал на ювенильных описторхов. В исследованиях in vivo антигельминтного действия надината на взрослых червей O. felineus не установлено. Однако ювенильные особи паразита, как и в условиях in vitro, оказались чувствительными к введению этого вещества. Высказано предположение о возможных протекторных антигельминтных свойствах исследуемого соединения.
Ключевые слова: O. felineus, антигельминтик, хомячки, мыши, эффекты in vitro и in vivo.
Августинович Д.Ф. - д.б.н., доцент, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов, e-mail: avgust@bionet.nsc.ru
Вишнивецкая Г.Б. - научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов, e-mail: wishn@bionet.nsc.ru
Пирожкова Д.С. - инженер лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов, e-mail: pirozhkova@bionet.nsc.ru
Цыганов М.А. - инженер научно-образовательного отдела ИЦиГ СО РАН, аспирант НГУ, e-mail: tsyganov@bionet.nsc.ru
Вавилин В.А. - д.м.н., проф., зав. лабораторией метаболизма лекарств и фармакокинетики, e-mail: drugsmet@niimbb.ru
Пахарукова М.Ю. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов, e-mail: pakharukova@bionet.nsc.ru
Шилов А.Г. - старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов, e-mail: shilov@bionet.nsc.ru
Дударев В.Г. - к.х.н., старший преподаватель кафедры химической технологии лекарственных веществ, e-mail: vladimir. dudarev@pharminnotech.com
Мордвинов В.А. - д.б.н., зав. лабораторией молекулярных механизмов патологических процессов ИЦиГ СО РАН, врио директора НИИМББ СО РАМН, e-mail: mordvin@bionet.nsc.ru
Описторхоз - серьезное заболевание млекопитающих животных и человека, вызываемое представителями семейства Opisthorchiidae -Opisthorchis viverrini и О. felineus. На всей территории Российской Федерации и в странах Западной Европы распространен вид О. felineus, с максимальной выраженностью в Обь-Иртышском регионе [24]. Различают острую и хроническую стадию заболевания в соответствии с наличием в гепатобилиарной системе и поджелудочной железе ювенильных (незрелых) марит паразита или взрослых особей, продуцирующих яйца, соответственно. Острая стадия описторхоза начинается сразу после внедрения метацеркарий О. felineus в организм млекопитающих в результате употребления в пищу сырой или недостаточно обработанной термически рыбы семейства карповых. Выявить эту стадию сложно, поскольку ее симптоматические проявления маскируются под признаки других заболеваний, прежде всего, острых респираторных (повышение температуры тела, озноб, лихорадка и боли в правом подреберье). Иногда острая стадия протекает бессимптомно, и диагностировать ее можно только при наличии эозинофилии. Коварство хронической стадии описторхоза связано не только с тем, что страдает гепатобилиарная система и поджелудочная железа, но и с тем, что в патологический процесс вовлекаются другие органы и системы хозяина, которые не имеют непосредственного контакта с паразитами [2, 4, 16]. При этом есть и другие исследования, в которых находят положительное влияние инфицирования О. felineus на организм хозяина [22]. Авторы обнаружили, что у людей в возрасте от 20 до 60 лет и более присутствие в организме паразитов снижает содержание холестерина в крови и тем самым оказывает анти-атеросклеротический эффект. Однако полагаем, что высокий патогенный потенциал паразитов О. felineus, в том числе канцерогенный [23], обусловливает необходимость поиска эффективных средств для лечения этого заболевания.
Описторхоз успешно моделируют на золотистых хомячках (Mesocricetus auratus). Однако в организме хомячков созревание описторхов до зрелых форм происходит очень быстро, и уже через 2 недели в гепатобилиарной системе обнаруживаются взрослые формы марит О. felineus [1]. Ювенильные особи паразита длительно сохраняются при моделировании описторхоза на мышах инбредной линии C57BL/6 [1, 16] Через две [1] и четыре-шесть недель после инфицирования мышей в желчных протоках печени и желчном пузыре обнаруживаются особи с хорошо развитыми ветвями кишечника, но при отсутствии половых органов и, следовательно, яйцепродукции.
Поэтому мыши являются удобными животными для исследования процессов, связанных с острой стадией описторхоза.
До настоящего времени основным терапевтическим средством против описторхоза является антигельминтный препарат широкого спектра действия - празиквантел. Механизм его действия связан с повышением проницаемости клеточных мембран для ионов кальция, что вызывает сокращение мускулатуры паразитов, переходящее в спастический паралич. Однако ведется постоянный поиск новых лекарственных средств, более совершенных и эффективных антигельминтиков, поскольку празиквантел обладает множеством побочных эффектов, обусловленных, прежде всего, индуцированием воспалительных реакций в организме в ответ на мертвых червей, приводящим к развитию окислительного и нитрозирую-щего стресса [26]. Кроме того, празиквантел может оказывать негативное влияние на кишечник и нервную систему (дезориентации, галлюцинации). Помимо празиквантела в качестве анти-гельминтных препаратов применяют вещества из химической группы «салициланилиды», например, клозантел, никлозамид, оксиклозанид, ра-фоксанид [6]. Этот класс антигельминтиков был открыт в 60-х годах. XX века при поиске биоцид-ных свойств у фенольных соединений (фенолы, бифенолы, тиофенолы и др.), применявшихся в качестве антимикробных и фунгицидных средств [6]. В настоящее время галогенированные сали-циланилиды рассматриваются как перспективные субстанции для лечения трематодозов различной локализации [3, 6].
В 2010 г. в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии синтезировано новое химическое соединение из класса салициланилидов - ^(4-метил-3-хлорфе-нил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамид (шифр -МСТ-02), получившее название «надинат» [12], которое в дальнейшем прошло новую разработку [7] (рис. 1). Считается, что введение атомов галогенов повышает липофильность салицила-нилидов, в результате чего достигается высокая эффективность агента в отношении как поло-
С1
Рис. 1. Структурная формула Ы-(4-метил-3-хлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамида (надината)
возрелых, так и ювенильных гельминтов [3]. Показано, что надинат обладает широким спектром активности не только в отношении цестод, но и нематод пищеварительного тракта. Основные исследования этого вещества выполнены на крысах и мышах, и в меньшей степени - на других млекопитающих [8]. Продемонстрированы антигель-минтные свойства надината на модели гименоле-пидоза и показана его 100%-я эффективность у мышей в дозе 500 мг/кг [5, 12, 14]. Исследование действия надината в отношении печеночного паразита O. felineus до настоящего времени не проводилось.
Поскольку известно, что эффективность химиотерапии во многом определяется не только особенностями хозяина паразита и влиянием внешней среды, но также циклом развития гельминта [6, 15, 25, 28], была поставлена задача определить эффективность действия МСТ-02 у двух представителей хозяина трематоды O. felineus -у сирийских хомячков, у которых происходит ускоренное созревание мариты паразита [1], а также у мышей инбредной линии C57BL/6, у которых ювенильная форма O. felineus сохраняется длительное время. Кроме того, предполагалось исследовать зависимость действия МСТ-02 от жизненного цикла гельминта O. felineus в экспериментах in vitro.
материал и методы
В работе использованы половозрелые самцы сирийских хомячков (Mesocricetus auratus) и мыши инбредной линии C57BL/6, полученные в ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН (RFMEFI61914X0005 и RFMEFI61914X0010). Во время проведения экспериментов животных содержали в стандартных конвенциональных условиях: при световом режиме 12 : 12 ч (свет : темнота), температуре воздуха 23-24 °С, наличии гранулированного корма и воды ad libitum. Хомячки были помещены индивидуально в клетки размером 36 х 23 х 12 см, в эти же клетки клали брусочки лиственных пород дерева размером 2 х 4 см, необходимые для стачивания зубов у животных. Мышей содержали группами по 3-6 животных в аналогичных клетках, в комнатах, отдаленных от комнат с хомячками. Длительность инфицирования хомячков была 6 мес. Мышей использовали в работах in vivo, длительность инфицирования составляла не более 1 мес.
Метацеркарий O. felineus получали из инфицированных язей, выловленных из реки Обь Новосибирской области, методом, описанным ранее [10]. После определения жизнеспособности ме-
тацеркарий под световым микроскопом каждому хомячку или мыши вводили по 100 особей вну-трижелудочно с помощью специализированных зондов (Braintree Scientific, Inc., США).
Все эксперименты выполняли согласно директивам Совета Европейского союза от 24 ноября 1986 г. (86/609/EEC), а также согласно заключению Комиссии по биоэтике Института цитологии и генетики СО РАН (№ 25 от 12 декабря 2014 г.).
^(4-метил-3-хлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамид (надинат) синтезирован в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (шифр - МСТ-02) [12]. В исследованиях in vitro препарат растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) (Sigma-Aldrich, США). В работах in vivo все концентрации препарата готовили на 2%-м водном растворе кукурузного крахмала (далее по тексту -«растворитель»). Сухой препарат тщательно гомогенизировали в растворителе до получения однородной суспензии непосредственно перед введением животным.
Для изучения эффектов надината in vitro половозрелых особей O. felineus выделяли из желчных протоков печени и желчного пузыря хомячков через 3 мес. после инфицирования ме-тацеркариями. Червей тщательно промывали в стерильном физиологическом растворе, визуально оценивали их состояние и подвижность и распределяли по 5-7 подвижных неповрежденных особей в лунку 12-луночного стерильного куль-турального планшета (Corning®Costar®, Sigma-Aldrich), содержащую 1 мл среды RPMI 1640 с L-глутамином (LifeTechnologies, США) при добавлении 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина В и 1 % глюкозы. Планшет с червями помещали в СО2-инкубатор (37 °С, 5 % СО2). Через сутки, после 5-кратного промывания червей инкубационной средой, в контрольные лунки добавляли 990 мкл среды и 10 мкл ДМСО. В опытные лунки с червями добавляли 10 мкл раствора МСТ-02 в ДМСО, так, чтобы конечная концентрация ДМСО в лунке была 1 %, а МСТ-02 - в диапазоне концентраций от 0,005 до 10 мкМ. На каждую концентрацию использовали 5-7 гельминтов в двух повторах (2 лунки). После добавления препаратов планшет с гельминтами вновь помещали в СО2-инкубатор. На следующие сутки под микроскопом (Axiovert 40CFL, Carl Zeiss, Германия) при 10-50-кратном увеличении оценивали подвижность особей в каждой лунке по общепринятому методу [20] с использованием 4-балльной шкалы: 1 - неподвижные, 2 - слабые движения ротовой присоски, 3 - слабо выраженные волнообразные движения всего тела червя,
4 - активные движения червя. Полученные значения степени подавления веществом МСТ-02 подвижности червей использовали для вычисления полуэффективной (IC50) и эффективной (IC95) концентраций.
Для оценки подвижности ювенильных особей O. felineus на фоне введения препарата МСТ-02 использовали метацеркарии, тщательно отмытые стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим антибиотики (100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Метацеркарии переносили в культуральный планшет по 30-60 на лунку, добавляли 0,25%-й раствор трипсина с 0,03 % ЭДТА в буфере Дульбекко (DPBS/ Планшет помещали в СО2-инкубатор на 15-30 мин для стимуляции выхода личинок из цист. Затем, после 5-кратного промывания ювенильных червей инкубационной средой, в лунки добавляли ДМСО (конечная концентрация 1 %) (контроль) или раствор МСТ-02 в нужной концентрации (опыт). Для вычисления IC50 и IC95 использовали диапазон концентраций от 0,01 до 0,1 мкМ. Планшет помещали в С02-инкубатор, через 24 ч оценивали степень подвижности личинок, используя 4-балльную шкалу, и рассчитывали эффективные дозы препарата так, как описано выше для половозрелых особей.
В исследованиях in vivo через 5 мес. после инфицирования хомячков метацеркариями O. felineus всех животных разделили на 3 группы (по 8 животных в каждой). Животным первой группы (контроль) однократно вводили растворитель, второй - малую дозу (125 мг/кг), третьей -большую дозу (500 мг/кг) препарата МСТ-02. В первую неделю после введения препарата ежедневно измеряли суточное потребление пищи, а также определяли прирост массы тела за неделю и рассчитывали метаболический параметр как отношение прироста массы тела за неделю (г) к общему потреблению пищи (г) за неделю согласно М. Razzoli et al. [27]. Через 21 день после введения препарата оценивали количество взрослых особей O. felineus в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе хомячков. Червей извлекали после эвтаназии хомячков с помощью CO2. Описторхов тщательно промывали в физиологическом растворе для дальнейшей оценки их подвижности через 2 ч после содержания в СО2-инкубаторе. Кроме того, у каждого хомячка определяли массу печени в пересчете на 1 г массы тела животного.
Состояние хомячков оценивали не только по потреблению пищи, но и по поведению в тесте «открытое поле», используемом для оценки эффектов вводимых препаратов на двигательную, исследовательскую активности грызунов,
а также на состояние тревожности [17]. Существуют различные модификации поля [19]. В своих экспериментах мы использовали поле размером 80 х 80 см, расчерченное на 25 квадратов (16 х 16 см). Поведение животных оценивали через 2 ч после введения МСТ-02. За 5 мин до тестирования каждого хомячка приносили в тестовую комнату для активации и адаптации к новым условиям, затем помещали в центр поля и регистрировали поведение в течение 5 мин с помощью специальной видеокамеры (стандарт GigE Vision). После видеозаписи поведения каждого животного поле тщательно промывали и высушивали салфетками. Дальнейший анализ поведения проводили с помощью программы «Observer 7.1» (Noldus Information Technology, Голландия). У животных фиксировали число пересеченных квадратов, время и число вставаний на задние лапы (стойки), число и время грумингов.
Для исследования влияния МСТ-02 на ювенильных особей O. felineus выбрана доза 500 мг/кг, которая, согласно литературным данным, была ниже полуэффективной острой токсической дозы при пероральном введении мышам [8, 9]. Интактных мышей делили на 2 группы, животным одной группы вводили растворитель (контроль, 8 мышей), животным второй группы -МСТ-02 (10 мышей). Инъекцию МСТ-02 осуществляли через 14-15 ч после инфицирования мышей обеих групп личинками O. felineus. Через 1 мес. после этого оценивали прирост массы тела у мышей обеих групп, животных декапитировали и выделяли печень с желчным пузырем, в которых определяли количество ювенильных особей паразита.
Все полученные данные представлены как M ± SEM, где M - среднее арифметическое значение, SEM - ошибка среднего. В зависимости от нормальности распределения признаков был использован либо параметрический (ANOVA), либо непараметрический (Kruskal-Wallis ANOVA) однофакторный дисперсионный анализ. При параметрическом дисперсионном анализе последующее сравнение групп проводили с помощью метода группирования выборок с наименее значимой разницей (LSD-критерий). Различия считались статистически значимыми при p < 0,05 и на уровне тенденции при 0,05 < p < 0.1. Для вычисления IC50 и IC95 исследуемого препарата МСТ-02 в работах in vitro использовали программу CompuSyn v.1.0 (ComboSyn, Inc, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование влияния МСТ-02 на половозрелых червей in vitro показало заметный обездвиживающий эффект. Полуэффективная кон-
Интактные
1% ДМСО
1 мкМ МСТ-02
10 мкМ МСТ-02
Рис. 2. Морфологические изменения у ювенильных особей Opisthorchis /еНпеш' через 2 (а—г) и 24 ч (д-з) после воздействия МСТ-02
центрации вещества (1С50) составила 0,21 мкМ (77,7 нг/мл), эффективная (1С95) - 0,377 мкМ (140 нг/мл). Еще более значительный эффект препарат оказывал на ювенильных червей: 1С50 -12,3 нМ (4,58 нг/мл), а 1С95 - 60 нМ (22,2 нг/мл). Ювенильные особи О. felineus, находившиеся в течение 2 ч в среде, содержащей ДМСО, не отличались от интактных по внешнему виду (рис. 2, а, б) и степени подвижности (интактные - 3,2 балла, ДМСО - 3,4 по 4-балльной шкале). Под влиянием МСТ-02 в концентрациях 1 и 10 мкМ у ювенильных описторхов практически полностью исчезала способность двигаться (соответственно 1,9 и 1,0 балла). Кроме того, под действием препарата у ювенильных особей были увеличены размеры экскреторного пузыря (рис. 2, в, г). Спустя 24 ч подвижность интактных и подверженных действию ДМСО описторхов снизилась незначительно (2,8 и 2,6 балла соответственно), выраженных морфологических изменений также не обнаружено (рис. 3, д, е). Препарат МСТ-02 в концентрациях 1 и 10 мкМ приводил к полному обездвиживанию и гибели большей части ювенильных описторхов. Наблюдалось значительное увеличение экскреторного пузыря и появление пузырей на поверхности тегумента описторхов (рис. 2, ж, з).
Следует отметить, что празиквантел, в отличие от МСТ-2, оказывал больший повреждающий эффект на взрослых особей О. felineus, чем на ювенильных [25]. Для других паразитов, например для фасциолы (Fasciola hepatica), установлена большая чувствительность неполовозрелых особей к антигельминтику диамфенетиду [15],
его влияние было более существенным у неполовозрелых фасциол, начиная с однодневного возраста и кончая 6-недельными, но не у 9-не-дельных фасциол [28]. Таким образом, у разных паразитов обнаруживается разная чувствительность к антигельминтным препаратам, обусловленная стадией развития паразита.
По полученным результатам in vitro можно сделать вывод, что МСТ-02 хорошо зарекомендовал себя в качестве потенциального антигель-минтного препарата в отношении O. felineus как у взрослых, так и, особенно, у ювенильных особей этого паразита. Причем его антигельминтный потенциал был даже выше, чем у празикванте-ла - общепринятого препарата для лечения опи-сторхоза у человека и животных. Полуэффективная концентрация празиквантела, вызывающая обездвиженность взрослых особей паразита, составляет 0,14 мкг/мл для O. felineus [25] и 0,16 мкг/мл для O. viverrivi [20]. Поэтому было продолжено исследование МСТ-02 по влиянию на половозрелых и ювенильных особей O. felineus в условиях in vivo.
Известно, что при исследованиях эффектов антигельминтных препаратов важно учитывать не только их непосредственное действие на гельминта, но и влияние на организм хозяина паразита [13]. При эффективном действии веществ на паразитов окончательный вывод об их пригодности можно сделать из результатов, выявляющих устойчивость хозяина к возможному токсическому действию исследуемых агентов. Празиквантел считается основным эффективным средством в борьбе с трематодозами, однако всегда учитыва-
ют его негативный эффект на хозяина, связанный с инициацией различных патологий в печени, вплоть до холангиокарциномы [18].
Исследование эффектов МСТ-02 на ювениль-ных особей O. felineus проведено на мышах, для которых ранее установлена 100%-я противогиме-нолепидозная активность при дозе 500 мг/кг [5], не вызывающей токсического эффекта у животных [8, 9]. В наших исследованиях установлено противоописторхозное действие МСТ-02 в этой дозе у мышей (Ha 18) = 5,19, p = 0,023). Препарат, введенный через 14-15 ч после инфицирования животных метацеркариями O. felineus, статистически значимо снижал количество паразитов в желчных протоках печени, оцениваемое через месяц после введения (33,13 ± 2,75 у мышей с введением растворителя и 26,50 ± 3,03 у мышей с введением МСТ-02). Причем из 10 мышей, получавших препарат, лишь у одной было обнаружено 50 червей в желчных протоках печени, у остальных 9 животных это число было меньше 30 (23,9 ± 1,72). С учетом этого различия между экспериментальными группами представляются еще более выраженными (H(118) = 8,16, p = 0,004). При этом прирост массы тела за месяц был приблизительно одинаковым у мышей с введением растворителя (4,29 ± 0,45) и МСТ-02 (3,71 ± 0,35), в результате чего через месяц после введения веществ животные не различались по массе тела (H 18) = 0,20, p = 0,657). Следовательно, при отсутствии видимого негативного влияния МСТ-02 на состояние мышей, оцениваемое по приросту массы тела, вещество оказывало заметное анти-гельминтное действие на стадии неполовозрелых особей паразита. Полученный результат считаем важным, поскольку он свидетельствует о возможном превентивном антигельминтном эффекте МСТ-02. Сведения о протекторном действии ан-тигельминтных препаратов у человека и животных в настоящее время отсутствуют.
Далее мы исследовали эффекты МСТ-02 на взрослых особей O. felineus в условиях in vivo. Для этого были выбраны хомячки, на которых успешно моделируют хронический описторхоз, а половозрелые особи паразита обнаруживаются уже через 2 недели после инфицирования животных [1]. Учитывая отсутствие предварительных данных по воздействию этого вещества на хомячков, были выбраны 2 дозы МСТ-02 - 500 и 125 мг/кг, возможные негативные эффекты которых на состояние хозяина паразита оценивали по суточному потреблению пищи в течение 7 дней, приросту массы тела животных за этот период, метаболическому параметру, поведению хомячков в тесте «открытое поле» сразу после введения вещества, относительной массе печени и ее внешнему виду при вскрытии животных.
21 1-
S
S
н
я ,
о _1
о 1 я
S -2 4
¡Я
№ о О —Í-
X
D
—5 Н
F(2,21) - 3,71 р = 0,042
Рис. 3. Изменение массы тела у хомячков через неделю после введения МСТ-02. Здесь и на рис. 4 белые столбики - животные с введением растворителя (контроль), серые столбики - животные с введением 125 мг/кг МСТ-02, черные столбики - животные с введением 500 мг/кг МСТ-02; обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия от соответствующих показателей: * - контроля, # - животных с введением 125 мг/кг МСТ-02
Установлено, что через 7 дней после введения МСТ-02 масса тела хомячков уменьшилась (рис. 3). Причем в наибольшей степени это снижение было у животных, которым вводили большую дозу МСТ-02.
Суточное измерение потребления пищи хомячками показало, что в первый день животные обеих групп с введением препарата уменьшали потребление гранул, наиболее выражено это было в группе животных с введением большей дозы вещества (рис. 4). Причем животные этой группы сохраняли сниженное потребление пищи на второй и третий день эксперимента. К четвертым суткам потребление пищи хомячками с введением МСТ-02 нормализовалось и не отличалось от потребления в контрольной группе. Установлено, что у хомячков с дозой 500 мг/кг на 7 день потребление пищи повышалось как по сравнению с контрольными животными, так и по сравнению с хомячками, которым вводили меньшую дозу вещества. Это можно рассматривать как компенсаторную реакцию организма, направленную на нормализацию потерянной массы тела в первые дни после введения вещества МСТ-02.
Установлены существенные различия между хомячками сравниваемых групп по метаболическому параметру ^221) = 3,58, р = 0,046). При этом хомячки с высокой дозой МСТ-02 статистически значимо отличались низким уровнем этого показателя от контрольных животных (р = 0,016) и заметно сниженным уровнем (р = 0,096) - от хомячков с меньшей дозой МСТ-02.
Относительная масса печени у хомячков всех трех групп не различалась и составляла у кон-
0,50,4-
0,3-
0,20,1-
0
День
Р(2,21)
гЬ
*
т
■
Рис. 4. Суточное потребление пищи хомячками в течение недели
Рис. 5. Внешний вид печени хомячков с введением растворителя (а), 125 мг/кг МСТ-02 (б) и 500 мг/кг МСТ-02 (в)
троля, животных с введением 125 и 500 мг/кг МСТ-02 (соответственно 0,53 ± 0,02, 0,54 ± 0,02 и 0,53 ± 0,01 г/г; F(2,21) = 0,14, р = 0,871). На фотографиях печени (рис. 5), выделенной из хомячков сравниваемых трех групп, видны сильно расширенные протоки, которые наблюдаются всегда при вскрытии хомячков с хроническим экспериментальным описторхозом [23]. Во всех долях печени были заметны крупные вкрапления белого и черного содержимого.
Как показало исследование поведения хомячков в тесте «открытое поле» (см. таблицу), через 2 ч после введения соединения оцениваемые параметры не изменялись. Животные не различались по исследовательской активности - числу и длительности стоек, двигательной активности - числу пересеченных квадратов, а также по
смещенной активности - числу и длительности грумингов.
Таким образом, учитывая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что большая доза вещества МСТ-02 (500 мг/кг) оказывает заметный негативный эффект на состояние хозяина паразита О. felineus, особенно в первые дни после введения. Животные теряют в весе, у них снижен аппетит и метаболический коэффициент. Хотя при этом параметры поведения в тесте, отражающем двигательную, исследовательскую и смещенную активности, не изменены. Введение МСТ-02 не усугубляет состояние печени, если учитывать ее относительную массу и внешний вид, но и не улучшает, как это видно на фотографиях. Однако окончательный вывод о влиянии МСТ-02 на печень животных можно делать на
Таблица
Параметры поведения хомячков в тесте «открытое поле» через 2 ч после введения МСТ-02
Параметр поведения Растворитель 125 мг/кг 500 мг/кг
Число грумингов 0,9 ± 0,23 0,6 ± 0,26 1,4 ± 0,46
Длительность грумингов, с 2,5 ± 0,82 2,6 ± 1,32 3,5 ± 1,25
Число стоек 7,0 ± 2,56 10,4 ± 3,61 7,6 ± 1,89
Длительность стоек, с 24,8 ± 6,31 36,9 ± 17,42 23,6 ± 5,39
Число пересеченных квадратов 45,5 ± 7,67 52,0 ± 14,72 42,0 ± 5,49
основании дальнейших гистологических и молекулярных исследований.
Учитывая значительный антигельминтный эффект МСТ-02 на половозрелых особей O. feli-neus, полученный in vitro, превосходящий даже эффект празиквантела, предполагалось получить положительный результат и в условиях in vivo. Но, как показал подсчет числа опистор-хов, выделенных из желчных протоков печени, оно было приблизительно одинаковым у сравниваемых экспериментальных групп животных. В контрольной группе хомячков было
32.0 ± 1,96 описторхов, в группах с введением 125 и 500 мг/кг - соответственно 30,4 ± 3,71 и
37.1 ± 4,08 (F(2,21) = 1,09, p = 0,255). Незначительное количество описторхов (1-5 особей) обнаруживалось в поджелудочной железе некоторых хомячков, в контрольной группе таких животных было 2, в группе с дозой МСТ-02 125 мг/кг -4 и в группе с дозой 500 мг/кг - 2. В среднем содержание описторхов в поджелудочной железе было приблизительно одинаковым (F(121) = 1,01, p = 0,381). Следовательно, при инфицировании хомячкам 100 метацеркарий на животное приблизительно 30-40 % взрослых особей O. felineus содержатся в желчных протоках печени и желчном пузыре и существенно меньшее количество - в поджелудочной железе. И эти соотношения были равными для всех исследуемых групп животных. При дальнейшей оценке активности описторхов, выделенных их желчных протоков печени хомячков, не установлено различий между группами. Через 2 ч после выделения из хомячков подвижность червей была достаточно высокой, и процент подвижных особей, оцененный по 4-бальной шкале, в каждой группе был приблизительно одинаковым (58,0 ± 6,60 % -контроль; 53,3 ± 12,12 % - доза 125 мг/кг; 56,7 ± 5,27 % - доза 50 мг/кг; F(2,21) = 0,08, p = 0,925). Таким образом, выраженного анти-гельминтного эффекта МСТ-02 в отношении половозрелых особей O. felineus у животных с хроническим описторхозом не обнаружено.
В настоящее время предполагается, что действие салициланилидов направлено на разобщение процессов окислительного фосфорили-рования у гельминтов, снижение уровня АТФ, ингибирование активности ферментов, участвующих в цикле трикарбоновых кислот [3]. Учитывая выраженный эффект МСТ-02 на ювенильных особей O. felineus как в условиях in vitro, так и in vivo, можно предположить, что несовершенная ферментная система цикла Кребса на этой стадии развития паразита является чувствительной мишенью для действия салициланилидов. И, следовательно, МСТ-02 является перспектив-
ным антигельминтным агентом в превентивной терапии острой стадии описторхоза. Однако на стадии хронического описторхоза, когда взрослые особи паразита имеют сформированные ферментные системы, антигельминтное действие вещества МСТ-02 малоэффективно. А, учитывая разные результаты влияния МСТ-02 на взрослых особей O. felineus, антигельминтного - в условиях in vitro и неэффективного - в условиях in vivo, можно предположить, что при неблагоприятных условиях существования паразита в организме хозяина, обусловленных токсическим действием химических соединений, для своего выживания он использует питательные вещества, имеющиеся в организме хозяина. Так, показано, что плоские черви могут питаться кровью хозяина [21] и влиять на липидный метаболизм в его организме [22]. Активное использование гликогена и липи-дов хозяина происходит уже на промежуточной стадии развития O. felineus, при паразитировании в пищеварительной железе моллюсков [11].
заключение
Таким образом, в проведенном исследовании обнаружены антигельминтные свойства нового вещества из класса салициланилидов - N-^-метил-3-хлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамида (шифр МСТ-02) на модели экспериментального описторхоза, индуцированного инвазией личинок O. felineus. Выявлена большая эффективность препарата у ювенильных особей паразита как в условиях in vitro, так и in vivo. Препарат действовал на взрослых червей в условиях in vitro, причем более эффективно, чем общепринятый антигельминтик празиквантел. Однако в условиях in vivo действие МСТ-02 на взрослых червей O. felineus оказалось неэффективным.
благодарности
Работа выполнена в рамках бюджетного проекта ФИЦ ИЦиГ СО РАН (№ 0324-2016-0002) и Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 17-04-00790).
список литературы
1. Августинович Д.Ф., Орловская И.А., Топоркова Л.Б. и др. Экспериментальный описторхоз: исследование состава форменных элементов крови, гемопоэза и стартл-рефлекса у лабораторных животных // Вавил. журн. генетики и селекции. 2016. 20. (2). 155-164.
2. Ахмедов В.А., Критевич М.А. Хронический описторхоз как полиорганная патология // Вестн. НГУ. Сер. Биол., клин. мед. 2009. 7. (1). 118-121.
3. Буренина Э.А. Влияние антигельминтных препаратов на ферментные системы плоских паразитических червей // Паразитология. 2007. 41. (2). 112-125.
4. Бычков В.Г., Соловьев Г.С., Соловьева О.Г. и др. Некоторые итоги изучения описторхоза // Науч. мед. вестн. Югры. 2014. (1-2). 31-33.
5. Гицу Г.А., Сафарова А.Я., Михайлицын Ф.С. и др. Сравнительная оценка противогименолепидоз-ной активности рядов хлор- и бромпроизводных са-лициланилидов // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2015. (1). 42-43.
6. Джафаров М.Х. Эволюция химиотерапии гельминтозов животных и человека (обзор) // С.-х. биол. 2013. (4). 26-44.
7. Дударев В.Г., Фридман И.А., Малахова А.Ю. и др. Антигельминтик надинат (МСТ-02), полученный новым способом, и его противогименолепидоз-ная активность // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2016. (2). 34-37.
8. Козлов С.А. Антигельминтная эффективность новых отечественных препаратов митранокс и надинат при мониезиозе и нематодозах овец и их фар-макотоксикологические свойства: автореф. дис. ... канд. ветерин. наук. М., 2016.
9. Козлов С.А., МусаевМ.Б., Михайлицын Ф.С. и др. Изучение острой токсичности антигельминтика надината // Рос. паразитол. журн. 2013. (2). 120-123.
10. Львова М.Н., Дужак Т.Г., Центалович Ю.П. и др. Секретом мариты печеночного сосальщика Opisthorchis felineus // Паразитология. 2014. 48. (3). 169-184.
11. Маниковская Н.С., Сумбаев Е.А. Функциональная морфология взаимоотношений в системе «паразит-хозяин» на разных стадиях онтогенеза гепатотрематод // Мед. в Кузбассе. 2010. (1). 39-41.
12. Михайлицын Ф.С., Гицу Г.А., Севбо Д.П. и др. Противогименолепидозная активность соединения МСТ-02 // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2010. (1). 47-48.
13. Начева Л.В., Нестерок Ю.А. Микроморфологические исследования органов и тканей хозяина при описторхозе после воздействия антигельмин-тиков растительного и синтетического происхождения // Рос. паразитол. журн. 2012. (2). 101-104.
14. Трусов С.Н., Севбо Д.П., Бурякина А.В. и др. Поиск оригинальных доступных и эффективных антигельминтных средств в ряду салициланилидов и пути снижения их токсичности // Здоровье - основа человеческого потенциала: пробл. и пути их решения. 2010. 5. (1). 378-383.
15. Anderson H.R., Fairweather I. Fasciola hepatica: ultrastructural changes to the tegument of juvenile flukes following incubation in vitro with the deacetylated (amine) metabolite of diamphenethide // Int. J. Parasitol. 2010. 25. (3). 319-333.
16. Avgustinovich D.F., Marenina M.K., Zhanae-va S.Y. et al. Combined effects of social stress and liver fluke infection in a mouse model // Brain Behav. Immun. 2016. 53. 262-272.
17. Belzung C., Griebel G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review // Behav. Brain Res. 2001. 125. 141-149.
18. Boonmars T., Srirach P., Kaewsamut B. et al. Apoptosis-related gene expression in hamster opisthorchiasis post praziquantel treatment // Parasitol. Res. 2008. 102. (3). 447-455.
19. Dulawa S.C., Grandy D.K., Low M.J. et al. Dopamine D4 receptor-knock-out mice exhibit reduced exploration of novel stimuli // J. Neusci. 1999. 19. (21). 9550-9556.
20. Keiser J., Adelfio R., Vargas M. et al. Activity of tribendimidine and praziquantel combination therapy against the liver fluke Opisthorchis viverrini in vitro and in vivo // J. Helminthol. 2013. 87. 252-256.
21. Lvova M., Zhukova M., Kiseleva E. et al. Hemozoin is a product of heme detoxification in the gut of the most medically important species of the family Opisthorchiidae // Int. J. Parasitol. 2016. 46. (3). 147-156.
22. Magen E., Bychkov V., Ginovker A. et al. Chronic Opisthorchis felineus infection attenuates atherosclerosis-an autopsy study // Int. J. Parasitol. 2013. 43. (10). 819-824.
23. Maksimova G.A., Pakharukova M.Y., Kashi-na E.V. et al. Effect of Opisthorchis felineus infection and dimethylnitrosamine administration on the induction of cholangiocarcinoma in Syrian hamsters // Parasitol. Int. 2015. http://www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S138357691500166X
24. Mordvinov V.A., Furman D.P. The Digenea parasite Opisthorchis felineus: a target for the discovery and development of novel drugs // Infect. Disord. Drug Targets. 2010. 10. (5). 385-401.
25. Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Pirozhkova D.S. et al. The first comprehensive study of praziquan-tel effects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda) // Int. J. Antimicrob. Agents. 2015. 46. (1). 94-100.
26. Pinlaor S., Prakobwong S., Hiraku Y. et al. Oxidative and nitrative stress in Opisthorchis viverrini-infected hamsters: an indirect effect after praziquantel treatment // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2008. 78. (4). 564-573.
27. Razzoli M., Carboni L., Andreoli M. et al. Different susceptibility to social defeat stress of BalbC and C57BL6/J mice // Behav. Brain Res. 2011. 216. (1). 100-108.
28. Rew R.S., Colglazier, Enzie F.D. Effect of diamfenetide on experimental infections of Fasciola hepatica in lambs: anthelmintic and clinical investigations // J. Parasitol. 1978. 64. (2). 290-294.
INFLUENCE OF N-(4-METHYL-3-CHLOROPHENYL)-2-ACETOXY-
3,5-dichlorobenzamide on the adult and juvenile worms
OF O. FELINEUS UNDER IN VITRO AND IN VIVO CONDITIONs
Damira Fuatovna AVGUSTINOVICH1, Galina Borisovna VISHNIVETSKAYA1, Dar'ya Sergeevna PIROZHKOVA1, Mikhail Alexandrovich TSYGANOV12, Valentin Andreevich VAVILIN3, Mariya Yur'evna PAKHARUKOVA1, Alexandr Gennad'evich SHILOV1, Vladimir Gennad'evich DUDAREV4, Vyacheslav Alexeevich MORDVINOV13
1 Institute of Cytology and Genetics of SB RAS 630090, Novosibirsk, Akademik Lavrent'ev av., 10
2 Novosibirsk State University 630090, Novosibirsk, Pirogov str., 2
3 Research Institute of Molecular Biology and Biophysics 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2/12
4 Saint Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy 197376, Saint-Petersburg, Professor Popov str., 14
The purpose was to determine the anthelmintic properties of the new substance from the class of salicylanilides -N-(4-methyl-3-chlorophenyl)-2-acetoxy-3,5-dichlorobenzamide (nadinate) on trematoda O. felineus under in vitro and in vivo techniques. In vivo studies, the effects of the substance on juvenile parasites in liver of inbred C57BL/6 mice and on adult worms in the liver of Syrian hamsters (Mesocricetus auratus) were evaluated. In vitro experiments, the sensitivity of adult and juvenile helminths was assessed by the IC50 and IC95 values of nadinate when inducing non-motility of worms. In experiments in vitro, the high sensitivity of adult helminths to this substance was established. Even more pronounced immobilizing effect of the nadinate was obtained in juvenile O. felineus individuals. In studies in vivo, the anthelmintic impact of nadinate on adult O. felineus worms has not been established. However, the juvenile parasites, like in vitro situation, were sensitive to the administration of this substance. An assumption is made about the possible protective anthelmintic properties of the compound tested.
Key words: O. felineus, anthelmintic, hamsters, mice, effects in vitro and in vivo.
Avgustinovich D.F. - doctor of biological sciences, associate professor, senior researcher of the laboratory of molecular mechanism of pathological processes, e-mail: avgust@bionet.nsc.ru Vishnivetskaya G.B. - researcher of the laboratory of molecular mechanism ofpathological processes, e-mail: wishn@bionet.nsc.ru
Pirozhkova D.S. - engineer of the laboratory of molecular mechanism ofpathological processes, e-mail: pirozhkova@bionet.nsc.ru
Tsyganov M.A. - engineer of scientific education department, postgraduate student, e-mail: tsyganov@bionet.nsc.ru Vavilin V.A. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of drug metabolism and pharmacokinetics, e-mail: drugsmet@niimbb.ru
Pakharukova M.Yu. - candidate of biological sciences, senior researcher of the laboratory of molecular mechanism ofpathological processes, e-mail: pakharukova@bionet.nsc.ru
Shilov A.G. - senior researcher of the laboratory of molecular mechanism ofpathological processes, e-mail: shilov@bionet.nsc.ru
Dudarev V.G. - candidate of chemical sciences, senior teacher of the chair for chemical technology of medicinal substances, e-mail: vladimir.dudarev@pharminnotech.com
Mordvinov V.A. - doctor of biological sciences, head of the laboratory of molecular mechanism ofpathological processes, acting director, e-mail: mordvin@bionet.nsc.ru
