CC BY
20
Суковатых Б.С., Гордов М.Ю., Боломатов Н.В.
ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА И ПРЕПАРАТА «МИЕЛОПИД» НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ ПРИ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА И ПРЕПАРАТА «МИЕЛОПИД» НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ ПРИ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Суковатых Б.С.1, Гордов М.Ю.2, Боломатов Н.В.3 УДК: 616.718-005.4:57.089.6
1 Курский государственный медицинский университет, Курск
2 Больница скорой медицинской помощи, Курск
3 Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И. Пирогова, Москва
Резюме
Опыты проводились на 100 белых крысах-самцах линии Wistar, которые были разделены на четыре группы: интактную, контрольную, опытную и группу сравнения. В интактную группу вошло 10 крыс, у которых оценены нормальные показатели микроциркуляции. В остальных группах было включено по 30 животных с моделированием критической ишемии конечности. В контрольной группе лечение не проводилось. В группе сравнения лабораторные животные получали мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга по оригинальной методике. В опытной группе проводилось лечение комбинированным способом: мононуклеарная фракция аутологичного костного мозга и препарат «Миелопид». Оценка уровня перфузии в мышцах голени крыс выполнялась методом лазерной допплеровской флоуметрии на 10-е, 21 -е и 28-е сутки. На тех же сроках производили гистологическое исследование ишемизированных мышц с определением динамики уровня артерио-венулярного шунтирования, площади некроза и плотности капиллярной сети.
Комбинированное применение мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и иммуностимулирующего препарата «Миелопид» при лечении экспериментальной критической ишемии конечностей в большей степени увеличивает уровень перфузии мягких тканей и плотность капиллярной сети, что приводит к уменьшению индексаартерио-венулярного шунтирования и площади не кротизированных тканей, чем при изолированном введении клеток костного мозга.
Ключевые слова: экспериментальная критическая ишемия, лечение, мононуклеарная фракция, костный мозг, миелопептиды, микроциркуляция, неоангиогенез.
THE EFFECT OF MONONUCLEAR FRACTION OF AUTOLOGOUS BONE MARROW AND OF THE DRUG "MYELOPID" ON THE MICROCIRCULATION IN CRITICAL LIMB ISCHEMIA IN EXPERIMENT
Sukovatyh B.S., Gordov M.Yu., Bolomatov N.V.
The experiments were conducted on 100 white male Wistar rats, which were divided into four groups: intact, control, experimental and comparison group. In the intact group consisted of 10 rats, which evaluated normal values of microcirculation. In the other groups, 30 animals were included with modeling of critical limb ischemia. In the control group, treatment was not carried out. In the comparison group, laboratory animals obtained mononuclear fraction of autologous bone marrow according to the original method. In the experimental group, the treatment was carried out in a combined way: mononuclear fraction of autologous bone marrow and the drug "Myelopid". The assessment of the level of perfusion in the muscles of the lower leg of rats was performed by laser Doppler flowmetry on the 10th, 21st and 28th days. At the same time made a histological examination of the ischemic muscle definition level dynamics arterio-venular shunting, the area of necrosis and the density of the capillary network.
The combined use of mononuclear fraction of autologous bone marrow and im-munostimulating drug "Myelopid" in the treatment of experimental critical limb ischemia to a greater extent increases the level of soft tissue perfusion and capillary network density, which leads to a decrease in the index of arterio-venular shunting and the area of necrotic tissues, than with isolated administration of bone marrow cells.
Keywords: experimental critical ischemia, treatment, mononuclear fraction, bone marrow, myelopeptides, microcirculation, neoangiogenesis.
Введение
Хроническая ишемия нижних конечностей регистрируется в 5-8% случаев у лиц старше 50 лет, а при наличии таких факторов риска, как курение, сахарный диабет, гиперлипидемия и артериальная гипертония - примерно у 30% [12]. В РФ количество пациентов с перемежающей хромотой составляет около 5% среди лиц пожилого возраста, то есть около 2 млн. человек [3; 4].
Основным методом терапии критической ишемии нижних конечностей (КИНК) остаются хирургическая и эндоваскулярная реваскуляризация конечности. Несмотря на впечатляющие достижения в этих областях [8; 12], примерно у 20-40% пациентов с КИНК такие технологии не могут быть применены вследствие особенностей анатомической локализации поражений магистральных сосудов, длительности заболевания или сопутствующей патологии [6]. Также актуальной остается проблема раннего послеоперационного тромбоза шунтов и протезов. В силу этих причин ампутация конечности часто ока-
зывается единственной возможностью продлить жизнь больному с КИНК [1; 14].
Следовательно, должно приветствоваться развитие новых, менее инвазивных направлений в качестве дополнения к уже существующим методам лечения больных с окклюзирующими заболеваниями артерий нижних конечностей.
Прорывом в поиске новых способов лечения хронической ишемии конечностей стала разработка инновационных технологий терапевтического ангиогенеза - стимуляции роста кровеносных сосудов и коллатералей в зоне ишемии с помощью фармакологических и иных средств [2; 5; 11]. На основании анализа мировой литературы опубликован обзор принципов, фундаментальных концепций и возможностей геноинженерных технологий стимуляции ангиогенеза [4; 5].
Следует подчеркнуть, что современные методики геноинженерной стимуляции неоваскулогенеза являются не только эффективными, но и безопасными: не
вызывают специфических осложнений, не способствуют возникновению онкологических заболеваний [6; 13]. К сожалению, высокая стоимость отечественного фармакологического препарата «Неоваскулоген» препятствует широкому применению генно-инженерных стимуляторов в клинической практике.
Проведенные нами ранее экспериментальные исследования показали возможность применения моно-нуклеарной фракции аутологичного костного мозга для лечения критической ишемии конечностей [9]. В другом исследовании было доказано позитивное влияние иммуностимулирующего препарата «Миелопид», получаемого из культуры клеток костного мозга свиней и телят, на течение экспериментальной критической ишемии конечностей [10]. Однако до сих пор остается неизученным их комбинированное применение.
Цель работы: изучить влияние комбинированного применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга и препарата «Миелопид» на микроциркуляцию при лечении экспериментальной критической ишемии конечностей.
Материалы и методы
Опыты проводились на 100 белых крысах-самцах линии Wistar массой 300-350 г без внешних признаков заболевания, находящихся в виварии Курского государственного медицинского университета в одинаковых условиях на стандартном пищевом режиме. Операции и все манипуляции с крысами проводились в условиях общего обезболивания. Эвтаназию осуществляли при помощи передозировки средств для наркоза в соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях».
Экспериментальные животные были разделены на четыре группы: интактную, контрольную, сравнения и опытную. В интактную группу вошло 10 крыс, у которых оценены нормальные показатели микроциркуляции методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ), индекс артерио-венулярного шунтирования (АВШ) и плотность капиллярной сети в норме путем микроскопии гистологических препаратов из мышечной ткани интакт-ной голени крысы. В остальных группах было включено по 30 крыс-самцов в каждую, у которых моделировали критическую ишемиюправой задней конечности по оригинальной методике (патент на изобретение №2559937, дата публикации 20.08.2015 г.).
Под действием средств для наркоза («Хлоралгидрат» в дозе 300 мг/кг, внутрибрюшинно, в виде раствора) животных фиксировали на спине. Затем в асептических условиях, на выбритом от шерсти участке, в области внутренне-медиальной поверхности бедра, производили линейный разрез кожи,
подкожно-жировой клетчатки и фасции от паховой складки до коленного сустава. Далее обнажали сосудисто-нервный пучок, бедренную артерию мобилизовали (отсекали от нее ветви первого порядка) на протяжении всего разреза и брали на резиновые держалки. Перевязывали и пересекли a. saphena (аналог глубокой артерии бедра у человека). В дистальном направлении, в области бифуркации подколенной артерии, ее лигировали и отсекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию, артерию сафена и начальные отделы артерий голени удаляли. На кожу шелковой нитью размером 1.0 накладывали один непрерывный шов.
В контрольной группе лечение не проводилось. В группе сравнения экспериментальные животные получали лечение мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга (МНФ) по оригинальному способу, опубликованному нами ранее[9]. В опытной группе лечение осуществлялось комбинированным применением МНФ и препарата «Миелопид».
Оценка уровня перфузии в мышцах голени крыс выполнялась методом ЛДФ с помощью лазер-доппле-ровского флоуметра «Biopac-systems MP-100» и специализированным датчиком «TSD-144». Запись и обработка полученных данных производили при помощи компьютерной программы «AcqKnowledge-38». Исследование перфузии мышц у лабораторных животных выполняли на 10-е, 21-е и 28-е сутки под действием наркотизирующих средств («Хлорал-гидрат» в дозе 300 мг/кг, внутри-брюшинно, в виде раствора).
После измерения уровня перфузии мышечной ткани исследуемую мышцу забирали на биопсию для морфологического и морфометрического исследования. Из каждой мышцы вырезали по 2 кусочка и после дегидратации в спиртах восходящей крепости заливали в парафин по стандартной методике. Заготовленные парафиновые срезы, толщиной 7-10 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
Микроскопирование и микрофотографирование гистологических препаратов осуществляли с помощью лабораторного микроскопа LevenhukD320L и цифровой окуляр-камеры LevenhukC310 на увеличениях X 100, X 200 и X 400 крат с документированием снимков в программе LevenhukToupView. На микрофотографиях проводили измерение среднего диаметра артериол, капилляров, венул и мышечных волокон, зоны некроза и плотности капиллярной сети. Далее подсчитывали их количество в 10 полях зрения во всех сериях эксперимента на 10-е, 21-е и 28-е сутки.
Подсчет индекса АВШ производили следующим образом по формуле [7]:
0вен-0арт
ИАВШ = —---— х 100%
Човен
где: ИАВШ - индекс артерио-венулярного шунтирования (%), 0вен - средний диаметр венул (мкм), 0арт - средний диаметр артериол (мкм).
Суковатых Б.С., Гордов М.Ю., Боломатов Н.В.
ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА И ПРЕПАРАТА «МИЕЛОПИД' НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ ПРИ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Полученные данные анализировали с помощью методов описательной статистики путем определения таких показателей как среднее арифметическое, стандартное отклонение и стандартная ошибка. В качестве основного способа определения уровня статистической значимости отличий между средними величинами использовали методику определения границ доверительного интервала (^ при допустимом уровне р<0,05 для экспериментальных медико-биологических исследований.
Для выявления значимой корреляционной связи между показателями уровня перфузии тканей и морфометрически-ми измерениями на разных сроках исследования использовали коэффициент ранговой корреляции Пирсона.
Результаты исследования
При сравнительной оценке уровня перфузии в группах экспериментальных животных методом ЛДФ выявлен следующий характер изменения перфузии мягких тканей (Табл. 1). В контрольной группе исследования уровень перфузии тканей на 10-е сутки был ниже в сравнении с интактной на 60,2%, на 21-е - на 40,6%, на 28-е - на 29,7%.
По сравнению с контрольной группой в группе сравнения (МНФ) уровень перфузии тканей был выше на 10-е сутки на 79,4%, на 21-е - на 100%, на 28-е - на 110%. В опытной группе (МНФ + «Миелопид») показатель перфузии тканей по сравнению с контрольной группой был выше на 10-е сутки на 97,4%, на 21-е - на 109%, на 28-е - на 132,3%. Уровень перфузии тканей в опытной группе был выше, чем в группе сравнения, на 10-е сутки на 18%, на 21-е - на 9%, на 28-е - на 22,3%. Эти результаты были подтверждены наличием статистически значимых отличий1, полученных средних значений уровня перфузии мягких тканей.
Результаты исследования патофизиологического феномена АВШ представлены в Табл. 2. В контрольной группе животных индекс АВШ был выше на всех сроках эксперимента в сравнении с интактной группой: на 10-е сутки на 28,6%, на 21-е - на 10,9%, на 28-е - на 9,9%. В группе сравнения (МНФ) исследуемый индекс был ниже на 10-е сутки на 25,6%, на 21-е - на 14,8%, на 28-е - на 19,4% в сравнении с контрольной группой. В опытной группе (МНФ + «Миелопид») также отмечалось снижение индекса АВШ на всех сроках эксперимента по сравнению
Табл. 1. Динамика изменения уровня перфузии тканей в группах экспериментальных животных
Группы животных Уровень перфузии мягких тканей,(в абсолютных значениях перфузионных единиц)
10 сутки 21 сутки 28 сутки
Интактная (n = 10) M±m 588,74±19,28 588,74±19,28 588,74±19,28
t 0,35 0,35 0,35
Контрольная(n = 30) M±m 234,30±7,22* 349,53±15,71* 413,91±16,4*
t 1,92 1,86 2,71
Сравнения (МНФ) (n = 30) M±m 420,28±21,44# 695,74±46,6# 873,98±43,72#
t 6,88 2,06 3,39
Опытная (МНФ+«Миелопид») (n = 30) M±m 462,30±18,35#** 730,52±24,52#** 961,37±38,53#**
t 1,39 6,79 8,28
Примечание: * - наличие статистически значимых отличий средних значений между контрольной и интактной группами, # - наличие статистически значимых отличий средних значений между исследуемыми группами и контрольной группами, ** - наличие статистически значимых отличий средних значений между опытной группой и группой сравнения. М - среднее арифметическое, т - стандартное отклонение, t - доверительный интервал.
Табл. 2. Динамика изменения индекса артериовенулярного шунтирования в группах экспериментальных животных
Группы животных Индекс артериовенулярного шунтирования,(в %)
10 сутки 21 сутки 28 сутки
Интактная (n = 10) M±m 28,8±1,2 28,8±1,2 28,8±1,2
t 0,67 0,67 0,67
Контрольная (n = 30) M±m 57,4±1,60* 39,7±1,38* 38,7±3,25*
t 2,97 3,28 6,67
Сравнения (МНФ) (n = 30) M±m 31,74±3,69# 24,88±1,37# 19,3±1,56#
t 8,78 3,79 2,95
Опытная (МНФ + «Миелопид») (n = 30) M±m 28,40±4,17# ** 18,15±2,04# ** 1,80±4,88# **
t 9,21 6,01 9,77
Примечание: * - наличие статистически значимых отличий средних значений между контрольной и интактной группами, # - наличие статистически значимых отличий средних значений между исследуемыми группами и контрольной группами, ** - наличие статистически значимых отличий средних значений между опытной группой и группой сравнения. М - среднее арифметическое, т - стандартное отклонение, t - доверительный интервал.
1 Здесь и в последующих таблицах и диаграммах наличие статистически значимых отличий между значениями средней арифметической рассчитаны методом доверительного интервала (Ц.
с контрольной группой: на 10-е сутки на 29%, на 21-е - на 21,5%, на 28-е - на 36,9%. Индекс АВШ в опытной группе был ниже, чем в группе сравнения, на 10-е сутки на 3,4%, на 21-е - на 6,7%, на 28-е - на 17,5%.
При анализе корреляционной зависимости между уровнем АВШ и перфузией тканей на различных сроках эксперимента во всех исследуемых группах выявлено наличие отрицательной корреляционной связи различной силы (Рис. 1). Самые высокие показатели перфузии тканей наблюдаются в группах животных, которые имеют низкие значения индекса АВШ. Так, самая сильная отрицательная корреляционная связь наблюдается на 10-е сутки в группе сравнения (г = -0,92). Самые низкие значения коэффициента корреляции выявлены в контрольной группе на 21-е и 28-е сутки - г = -0,04 и г = -0,05 соответственно, что говорит практически об отсутствии корреляционной связи. В опытной группе определялась слабая отрицательная корреляционная связь на всех сроках эксперимента (коэффициент варьирует от -0,15 до -0,20). Однако, к 28-м суткам корреляционная связь усилилась (г = -0,37).
Динамика изменения плотности капиллярной сети в группах экспериментальных животных изучена путем определения количества капилляров в стандартном поле зрения окуляра микрометра (Табл. 3). В контрольной группе исследуемый параметр был ниже на всех сроках наблюдения в сравнении с интактной: на 10-е сутки на 36,7%, на 21-е - на 24,4%, на 28-е - на 14,4%. Плотность капилляров в группе сравнения (МНФ) была выше по сравнению с контрольной на 10-е сутки на 12,7%, на 21-е - на 25,4% и на 28-е - на 22,4%. В опытной группе (МНФ + «Миелопид») плотность капилляров также была выше на всех сроках эксперимента в сравнении с контрольной группой: на 10-е сутки на 20,5%, на 21-е - на 38,9%, на 28-е - на 32,7%. Плотность капилляров в ишемизированной конечности в опытной группе была выше, чем в группе сравнения на 10-е сутки на 7,8%, на 21-е - на 13,4% и на 28-е - на 10,4%.
При анализе корреляционной зависимости между плотностью капиллярной сети и перфузией тканей на различных сроках эксперимента во всех исследуемых группах
0
« -0,5 _
10 сутки ; 21 сутки ; 28 сутки
— Контрольная ! -0,2239 : -0,04832 : -0,054396
— Сравнения : -0,920357 i -0,75625 i -0,560447
— Опытная ; -0,20536 ; -0,153191 ; -0,37881
Рис. 1. Значения коэффициента корреляции при анализе корреляционной зависимости между уровнем АВШ и перфузией мягких тканей
выявлено следующее (Рис. 2). Самые высокие показатели перфузии тканей наблюдаются в группах животных, которые имеют высокие значения плотности капиллярной сети. Самая сильная положительная корреляционная связь наблюдается на 10-е сутки в группе сравнения (г = 0,84). В контрольной группе на всех сроках выявлена слабая корреляционная связь (г = от -0,15 до 0,24), причем на 21-е и 28-е сутки связь носила отрицательный характер. В опытной группе определялась средняя положительная корреляционная связь на 21-е сутки (г = 0,55).
При изучении удельной площади некроза в мышечных волокнах на различных сроках эксперимента получены следующие результаты (Табл. 4).В группе сравнения (МНФ) площадь некротизированных тканей в сравнении с контрольной группой на 10-е сутки была ниже на 23,9%, на 21-е - на 14,4%, на 28-е - на 10,6%. При комбинированном применении МНФ и препарата «Мие-лопид» (опытная группа) площадь некроза уменьшилась на 10-е сутки на 24,1%, на 21-е - на 13,5%, на 28-е - на 10,6%. При сопоставлении результатов в исследуемых группах животных статистически значимых различий в опытной группе и группе сравнения не выявлено.
Табл. 3. Динамика изменения средней плотности капилляров (мкм) в одном поле зрения мышечной ткани
Группы животных Средняя плотность капилляров(мкм)
10 сутки 21 сутки 28 сутки
Интактная (n = 10) M±m 33±1,5 33±1,5 33±1,5
t 0,86 0,86 0,86
Контрольная(n = 30) M±m 20,87±0,50* 24,95±0,44* 28,25±0,30*
t 1,01 0,93 0,56
Сравнения (МНФ) (n = 30) M±m 23,53±0,48# 31,29±0,33# 34,57±0,27#
t 1,04 0,76 0,59
Опытная (МНФ + «Миелопид») (n = 30) M±m 25,15±0,47# 34,67±0,46# ** 37,5±0,60# **
t 0,89 0,99 1,25
Примечание: * - наличие статистически значимых отличий средних значений между контрольной и интактной группами, # - наличие статистически значимых отличий средних значений между исследуемыми группами и контрольной группами, ** - наличие статистически значимых отличий средних значений между опытной группой и группой сравнения. М - среднее арифметическое, т - стандартное отклонение, t - доверительный интервал.
Суковатых Б.С., Гордов М.Ю., Боломатов Н.В.
ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА И ПРЕПАРАТА «МИЕЛОПИД' НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ ПРИ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Табл. 4. Динамика изменения удельной площади некроза в группах экспериментальных животных
Группы животных Удельная площадь некроза, (в %)
10 сутки 21 сутки 28 сутки
Контрольная (n=30) M±m 37,46±0,14 19,94±0,35 13,1±0,39
t 0,28 0,66 0,81
Сравнения (МНФ)(п=30) M±m 13,55±1,07* 5,52±0,34* 2,51±0,09*
t 2,20 0,68 0,24
Опытная (МНФ+«Миелопид») (n=30) M±m 13,4±1,05* 6,39±0,16* 2,51±0,09*
t 1,96 0,31 0,24
Примечание: * - наличие статистически значимых отличий средних значений между исследуемыми группами и контрольной группами, М - среднее арифметическое, т - стандартное отклонение, t - доверительный интервал.
1
0,8 _
0,6 _
0,4 _
0,2 -
0 _
-0,2 _
-0,4 _
0,8 0,6 _ 0,4 _ 0,2 _ 0_ -0,2 _ -0,4 _ -0,6 _ -0,8 _ -1 _
10 сутки 21 сутки 28 сутки 10 сутки : 21 сутки : 28 сутки
— Контрольная ; 0,24644 -0,04035 -0,15996 — Контрольная ! -0,154941 : 0,552135 : -0,28003
— Сравнения : 0,84808 0,11444 0,48452 — Сравнения : -0,9194947 ! -0,04709 ! -0,30454
— Опытная ; 0,149589 0,55894 0,19477 — Опытная ; -0,21709 ! -0,13502 ! -0,14878
Рис. 2. Значения коэффициента корреляции при анализе корреляционной зависимости между плотностью капиллярной сети и перфузией мягких тканей
Рис. 3. Значения коэффициента корреляции при анализе корреляционной зависимости между площадью некроза и перфузией мягких тканей
При анализе корреляционной зависимости между площадью некроза и перфузией тканей на различных сроках эксперимента в исследуемых группах выявлено следующее (Рис. 3). Самые высокие показатели перфузии тканей наблюдаются в группах животных, которые имеют низкие значения площади некроза. Самая сильная отрицательная корреляционная связь наблюдается на 10-е сутки в группе сравнения (г = -0,92). В контрольной группе на 10-е и 28-е сутки выявлена слабая отрицательная корреляционная связь (г = -0,15 и г = -0,28), а на 21-е - средняя положительная (г = 0,55). В опытной группе корреляционная связь носила слабый отрицательный характер на всех сроках исследования (г = от -0,14 до -0,22).
При микроскопическом изучении гистологических препаратов ишемизированных мышц у животных в контрольной группе на 10-е сутки были выявлены крупные участки некроза. На периферии и в глубине некротизи-рованной зоны наблюдали картину тяжелого воспаления в виде выраженной инфильтрации сегментоядерными нейтрофилами и макрофагами. Выявлен интерстициаль-ный отек и полнокровие капилляров (Рис. 4 А).
В группе сравнения, на фоне лечения МНФ, на 10-е сутки эксперимента определялись участки воспалительной инфильтрации. Инфильтрат был представлен ней-трофилами и значительным количеством макрофагов и
гистиоцитов. Выявлены обширные разрастания грануляционной ткани, состоящей из сосудов капиллярного типа, фибробластов и миобластов. Начиналось формирование новых капилляров (Рис. 4 Б).
В опытной группе, на фоне комбинированного лечения МНФ и препаратом «Миелопид», на 10-е сутки эксперимента наблюдали участки некроза мышечных волокон, с воспалительной инфильтрацией. Имелись единичные сформированные новообразованные капилляры, немногочисленные миобласты (Рис. 4 В).
В контрольной группе животных на фоне моделирования критической ишемии конечности на 21-е сутки эксперимента наблюдали полиморфную картину некротических и дистрофических изменений (Рис. 5 А).
На 21-е сутки эксперимента в группе сравнения (МНФ) продолжалось замещение участков некроза грануляционной тканью, происходила регенерация мышечных волокон. Воспалительная реакция стихала. Вне зон некроза и грануляционной ткани продолжался процесс формирования капилляров (Рис. 5 Б).
В опытной группе (МНФ + «Миелопид») на 21-е сутки сохранялись небольшие очаги заместительного некроза с элементами регенерации отдельных мышечных волокон и заканчивалось образование капиллярной сети (Рис. 5 В).
Рис. 4. Микрофотография участка мышечных волокон на 10-е сутки эксперимента в группах экспериментальных животных. Окраска гематоксилин и эозин. А - контрольная группа (1 - отек интерстиция, 2 - полнокровие капилляров), увеличениех100; Б - группа сравнения (МНФ) (3 - единичный формирующийся капилляр), увеличение х 400; В - опытная группа (МНФ + «Миелопид») (4 - новообразованный капилляр, 5 - скопление мио-бластов), увеличение х 200
Рис. 5. Микрофотография участка мышечных волокон на 21-е сутки эксперимента в группах экспериментальных животных. Окраска гематоксилин и эозин. А - контрольная группа (1 - некрозы мышечных волокон), увеличение х 100; Б - группа сравнения (МНФ) (2 - линейно упорядоченные скопления миобластов), увеличение х 400; В - опытная группа (МНФ + «Миелопид») (3 - новообразованный сосуд микроциркуляторного русла), увеличение х 400
Рис. 6. Микрофотография участка мышечных волокон на 28-е сутки эксперимента в группах экспериментальных животных. Окраска гематоксилин и эозин. А - контрольная группа (1 - миобласты, 2 - разрастание соединительной ткани), увеличениех200; Б - группа сравнения (МНФ) (3 - новообразованный сосуд, 4 - скопления миобластов), увеличениех200; В - опытная группа (МНФ + «Миелопид») (5 - новообразованные капилляры), увеличение х 400
На 28-е сутки в контрольной группе зона некротизи-рованной ткани постепенно замещалась грануляционной, наблюдали скопления миобластов (Рис. 6 А).
В группе сравнения после лечения МНФ на 28-е сутки определялись отдельные участки некроза мышечных волокон. Имелись новообразованные сосуды
капиллярного типа, миобласты в большом количестве (Рис. 6 Б).
В опытной группе при комбинированном лечении МНФ и препаратом «Миелопид» на 28-е сутки завершался процесс замещения участков некроза соединительной тканью, между которыми находились новообразованные сосуды (Рис. 6 В).
Суковатых Б.С., Гордов М.Ю., Боломатов Н.В.
ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА И ПРЕПАРАТА «МИЕЛОПИД» НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ ПРИ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Обсуждение
Изучение механизмов проангиогенного действия стволовых клеток костного мозга было расширено после открытия гемопоэтических клеток мононуклеарной фракции костного мозга относительно небольшой популяции эндотелиальных клеток-предшественников. При структурной перестройке сосудистой сети в поврежденной ткани, в основе которой лежит развитие коллатеральных артериол и ветвление капилляров, возможно формирование микрососудов de novo с участием эндотелиальных клеток-предшественников, мигрирующих из костного мозга в периферический кровоток и далее в зоны ишемии. В ответ на ишемию увеличивается число циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников, которые встраиваются в стенку капилляра с последующей дифференцировкой в зрелые эндотелиоциты.
Однако проведенные нами гистологические исследования ишемизи-рованных мышц после введения в них мононуклеарной фракции костного мозга показали, что срок образования новых полноценных капилляров в среднем составляет 4 недели. При развитии критической ишемии конечности желательно уменьшение сроков формирования новой сосудистой сети, что позволит предупредить развитие гангрены конечности.
В основе фармакологического действия препарата «Миелопид» лежат естественные иммуномодуляторы костного мозга - миелопептиды. Препарат имеет в своем составе 6 миелопептидов. Они действуют физиологично и эффективны в крайне низких концентрациях, а также не обладают видовой специфичностью. «Миелопид» кроме иммуностимулирующего обладает ангиопротек-торным действием. Полифункциональность пептидов костномозгового происхождения способствует стимуляции неоангиогенеза, увеличивает плотность капиллярной сети, уменьшает артериовенулярное шунтирование при ишемии конечности. В свою очередь эти эффекты уменьшают площадь некроза мышц и ускоряют их регенерацию.
Гистологические исследования ишемизированных мышц после введения в них мононуклеарной фракции костного мозга и препарата «Миелопид» показали, что формирование новой капиллярной сети происходит уже на 10-21-е сутки эксперимента, что вдвое меньше, чем при изолированном применении клеток костного мозга. Этим эффектом можно объяснить более позитивное влияние их комбинированного введения на микроциркуляцию при критической ишемии конечностей.
Выводы
Комбинированное применение мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга и препарата «Ми-елопид» при экспериментальной критической ишемии конечностей увеличивает средний уровень перфузии мягких тканей на 16,4±4,6% и плотность капиллярной сети на 10,5±2,3%; уменьшает индекс артерио-венулярного шун-
тирования на 9,2±4,15% на всех сроках эксперимента по сравнению с изолированным введением клеток костного мозга за счет двукратного снижения сроков образования новой капиллярной сети.
Литература
1. Андожская, Ю.С. Состояние регионарной гемодинамики у больных с атеросклерозом в зависимости от фокальности поражения и тяжести ишемии нижних конечностей // Региональное кровообращение и микроциркуляция. - 2011.
- № 2. - С. 75-78.
2. Аутологичные стволовые клетки. Экспериментальные исследования и перспективы клинического применения: рук. для врачей / под ред. В. А. Ткачука. - М.: Литтерра, 2009. - 448 с.
3. Влияние фармакотерапии хронических облитерирующих заболеваний артерий и нижних конечностей на состояние микроциркуляторного русла / И. Г. Учкин [и др.] // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2014. - Т. 20, № 2. - С. 27-35.
4. Воронов, Д.А. Стимуляция ангиогенеза в улучшении результатов хирургического лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: экспериментальное обоснование и эффективность клинического применения / Д.А. Воронов, А.В. Гавриленко, Н.П. Бочков // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2009. - Т. 2, № 3. - С. 45-49.
5. Гавриленко, А.В. Результаты комплексного лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей с использованием генных технологий стимуляции ангиогенеза (часть 2) / А.В. Гавриленко, Д.А. Воронов // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2015. - Т.21,№ 4 .- С. 29-34.
6. Клеточная терапия критической ишемии нижних конечностей / С.В. Лебедев [и др.] // Вестн. РАМН. - 2013. - № 3. - С. 33-44.
7. Савельев, В.С. Патогенез и консервативное лечение тяжелых стадий обли-терирующего атеросклероза артерий нижних конечностей /В.С. Савельев, В.М. Кошкин, А.В. Каралкин. - М. : МИА, 2010. - 216 с.: ил.
8. Самодай, В.Д. Нестандартная хирургия критической ишемии нижних конечностей /В.Д. Самодай, Ю.А. Пархисенко, А. А. Иванов. - М.: МИА, 2009. - 240 с.
9. Суковатых, Б.С. Результаты лечения экспериментальной критической ишемии конечности мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга / Б.С. Суковатых, А.Ю. Орлова, М.Ю. Гордов // Вестн. нац. медико-хирург. центра им. Н.И. Пирогова. - 2016. - Т. 11, № 2. - С. 65-68.
10. Фармакологическая коррекция нарушений микроциркуляции и ишемических повреждений мышечных тканей при экспериментальной критической ишемии конечностей / Б.С. Суковатых, Е.Б. Артюшкова, А.Ю. Орлова, М.Ю. Гордов // Вестн. эксперим. и клин. хирургии. - 2016. - Т. 9, № 3. - С. 222-230.
11. Fadini,G.P. Autologousstemcelltherapyforperipheralarterialdiseasemeta-analysisa-ndsystematicreviewoftheliterature / G.P. Fadini, C. Agostini, A. Avogaro // Atherosclerosis. - 2010. - Vol. 209, N 1. - P. 10-17.
12. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II) / L. Norgren [et al.] // J. Vasc. Surg. - 2007. - Vol. 45, Issue 1, Suppl. - P. 5-67.
13. Intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells in patients with critical limb ischemia: a randomized-start, placebo-controlled pilot trial (PROVASA) / D.H. Walter [et al.] // Circ. Cardiovasc. Interv. - 2011. - Vol. 4, N 1. - P. 26-37.
14. Lawall, H. Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal / H. Lawall, P. Bramlage, B. Amann // Thromb. Haemost. - 2010.
- Vol. 103, N 4. - P. 696-709.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3 e-mail: [email protected]
