CC BY
27
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Гордов М.Ю. РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Гордов М.Ю. УДК: 616.718-005.4-08
Курский государственный медицинский университет, Курск
Резюме
Представлено экспериментальное обоснование возможности лечения критической ишемии конечности мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.
Ключевые слова: экспериментальная ишемия, нижняя конечность, трансплантация мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга, микроциркуляция, динамика площади некроза.
RESULTS OF TREATMENT OF THE EXPERIMENTAL CRITICAL ISCHEMIA EXTREMITY OF THE MONONUCLEAR FRACTION OF AUTOLOGOUS BONE MARROW
Sukovatyh B.S., Orlova A.Ju., Gordov M.Yu.
Experimental study of the effectiveness of the mononuclear fraction of autologous bone marrow in the treatment of critical limb ischemia.
Keywords: experimental ischemia, lower extremity, transplantation of mononuclear fraction of autologous bone marrow, microcirculation, dynamics of the area of the necrosis.
Критическая ишемия нижних конечностей встречается у 500-1000 чел. на 1 млн жителей в год. Прогнозируется возрастание количества больных в связи с массовым распространением курения, ожирения, сахарного диабета, метаболического синдрома [7]. Результаты лечения остаются неудовлетворительными, в России ежегодно выполняется до 50 тыс. ампутаций нижних конечностей [2]. Среди больных, страдающих облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, в последнее время наметилась четкая тенденция к увеличению числа больных с поражениями «путей оттока» и с конечной стадией развития атеросклероза - кальцинозом артериального русла [1]. При этом в 15-20% случаев прямая реваскуляризация, наиболее привлекательная для хирурга, теряет шансы на успех, ишемия прогрессирует, возникает опасность потери конечности [4]. Отсутствие возможности выполнения реконструктивной операции диктует необходимость разработки, внедрения и тщательного анализа новых путей паллиативной реваскуляризации. Серьезное внимание стало уделяться разработке способов улучшения микроциркуляции в ишемизированных тканях посредством стимуляции неоангиогенеза [5, 11].
В эксперименте на модели локальной ишемии конечности (лигирование ветвей бедренной артерии) было предложено использовать различные клетки-кандидаты для неоангиогенеза в ишемизированной зоне - мононуклеары костного мозга и периферической крови, тромбоциты периферической крови совместно с мононуклеарами, эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизированные в периферический кровоток, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) СD 34+ и CD133+, эндотелиальные прогениторы пуповинной крови человека, стромальные клетки костного мозга и «костномозговые фибробласты» после культивирования [9, 10].
Наибольшее применение в регенерационной клеточной терапии получили стволовые клетки костного мозга в силу их плюрипотентности. Стволовые клетки (гемопоэтические и мезенхимальные) содержатся в мононуклеарной фракции клеток костного мозга. Обладая мультипотентными свойствами, эти клетки могут способствовать замещению дефектов тканей и неоангиогенезу. Кроме того, лимфоидные клетки фракции в силу своих морфогенетических способностей могут принимать участие в процессах восстановительной регенерации поврежденных органов и тканей [8].
Цель: экспериментальное обоснование возможности лечения хронической ишемии конечности мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга.
Материалы и методы исследования
Опыты проводились на 70 белых крысах-самцах линии «Wistar» массой 300-350 г без внешних признаков заболевания, находящихся в виварии Курского государственного медицинского университета в одинаковых условиях на стандартном пищевом режиме. Операции и все манипуляции с крысами проводились в условиях общего обезболивания. Эвтаназию осуществляли при помощи передозировки средств для наркоза в соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях».
Животные были разделены на три группы: интакт-ную, контрольную, и опытную. В интактную группу вошло 10 крыс, у которых оценен нормальный уровень микроциркуляции. В остальные группы вошло по 30 жи-
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Гордов М.Ю.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
вотных в каждой, у которых моделировали критическую ишемию правой задней конечности.
Моделирование критической ишемии задней конечности осуществляли следующим образом. Под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг животных фиксировали на спине, затем после соответствующей подготовки операционного поля (сбривание шерсти и обработка 70% раствором спирта) выполняли разрез кожи по внутренней поверхности бедра на всю длину области. Выделяли элементы сосудисто-нервного пучка бедра. Артерию отделяли от вены и нерва, мобилизовали (пересекали отходящие от нее ветви первого порядка). Накладывали лигатуры на артерию у места ее начала (под паховой связкой) и пересекали. Перевязывали и пересекали а. saphena. Выделяли подколенную артерию и начальные отделы артерий голени (бифуркация подколенной артерии), которые пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени удаляли. Значимого ретроградного кровотечения из артерий голени не наблюдалось, поэтому лигатуры не накладывались. Рану на бедре ушивали непрерывным швом.
Мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга готовили непосредственно перед введением по следующей методике: у крысы, перенесшей операцию моделирования ишемии правой задней конечности, на противоположной конечности пальпировали бедренно-большеберцовый сустав, образованный латеральными и медиальными мыщелками бедренной и большеберцо-вой костей, фиксировали его одной рукой в положении флексии, а другой брали иглу диаметром 20G, соединенную со шприцем, содержащим 2500 Ед гепарина, разбавленного 0,9% раствором NaCl в соотношении 1:1 в объеме 1мл, и после санации 70% этиловым спиртом перкутанно через хрящевые суставные мениски под надколенником осуществляли пункцию костномозговой полости. Костный мозг аспирировался в шприц путем поступательных движений иглы в полости вперед и назад в объеме от 1 до 1,5 мл. Затем мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга выделяли по методу Boyum [6], принцип которого основан на различии в плавучей плотности форменных элементов. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. Мононуклеарная фракция обладает меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.
Методика выделения мононуклеарной фракции из гепаринизированного костного мозга заключалась в
следующем: костный мозг разводили физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5; центрифугировали в градиенте плотности фиколл-верографин при 400g в течение 30 мин. Полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывали в ЗФФР (0,9% изотонический раствор натрия хлорида, забуференный с помощью фосфатно-со-левого буфера) и ресуспендировали в среде RPMI-1640 в концентрации 106 клеток в мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим, превышала 96%.
В контрольной группе лечение не проводилось. У крыс опытной группы и группы сравнения лечение мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга начато на седьмые сутки после операции. Согласно результатам предшествующего исследования морфологические механизмы компенсации ишемии конечности - неоангиогенез - включаются в среднем на 7 сутки после операции моделирования. За этот срок мобилизуются все предсуществующие компенсаторные резервы организма животного; дальнейшие изменения в состоянии кровообращения в конечности могут происходить только благодаря вмешательству извне [12]. В опытной группе мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга 4х клеток в объеме 200 мкл вводили в ишемизирован-ную конечность животного из двух точек, в каждую из которых по 100 мкл: 1) непосредственно под паховую связку в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей; 2) интра-мускулярно в икроножную мышцу передне-латеральной поверхности средней трети голени [3].
Животные выводились из эксперимента путем передозировки наркоза хлоралгидрата на 10, 21 и 28 сутки. Перед выведением из эксперимента у крыс была оценена динамика клинических и флоуметрических показателей при моделировании ишемии конечности на разных сроках. Оценка уровня микроциркуляции в мышцах бедра и голени крыс выполнялась методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазер-доппле-ровского флоуметра «Biopac-systems МР-100» и датчика «TSD-144». Запись и обработка данных производилась при помощи программы AcqKnowledge 38. Исследование выполняли под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора. После наступления наркотического сна иссекали участок кожи на передне-латеральной поверхности правого бедра и голени задней конечности. Животное укладывали на противоположную сторону. Датчик вплотную приставляли к мышце бедра, затем голени и проводили флоуметрию. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы; точки на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее и 5) медиальнее от первой. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 с в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Гордов М.Ю. РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
уровень микроциркуляции в мышцах бедра и голени у данного животного.
После выведения животных из эксперимента ише-мизированные мышцы голени иссекали и фиксировали в 10% растворе формалина. Дальнейшее гистологическое исследование проводили по традиционной методике.
Достоверность полученных при действии моно-нуклеарной фракции аутологичного костного мозга изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием критерия Стьюдента для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р < 0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2007.
Результаты исследования
Несмотря на достаточную агрессивность модели экспериментальной патологии и развития выраженной острой ишемии конечности, по прошествии 3-4 суток наблюдалась относительная компенсация артериальной недостаточности: конечность включалась в акт передвижения, исчезал или уменьшался ишемический отек. Параллельно с течением времени появлялись признаки формирующейся критической ишемии конечности, что характеризовалось наличием таких патогномоничных симптомов, как перемежающаяся хромота, трофические расстройства в дистальных
Табл. 1. Частота симптомов экспериментальной критической ишемии конечности на 5-7 сутки после операции
Симптомы экспериментальной ишемии конечности Абсолютное количество В процентах (%)
Боль (по косвенным признакам) 59 98
Ограниченное участие конечности в передвижении 54 90
«Перемежающаяся хромота» 53 88
Гиперемия кожи конечности 39 65
Сухая гангрена пальцев, части стопы 3 5
Артериальные трофические язвы 2 3,3
Ишемический отек 2 3,3
Сухая гангрена голени, самоампутация 4 6,6
участках конечности - артериальные трофические язвы. В некоторых случаях наблюдалась сухая гангрена пальцев стопы, характерная для синдрома хронической артериальной недостаточности. В отдельных случаях мы наблюдали самоампутацию конечности (очевидно, что развилась сухая гангрена с четкой демаркацией и последующим отторжением некротизированных участков). Т.е. у крыс на фоне экспериментальной патологии сформировались те же самые патогномоничные признаки критической ишемии конечности, которые наблюдаются у пациентов с ХОЗАНК, представленные в таблице 1.
Из таблицы видно, что при обследовании у 65-98% животных зарегистрировано наличие болевого синдрома, гиперемия кожи голени и стопы, симптом «перемежающей хромоты», ограниченное участие конечности в передвижении, ишемический отек, трофические язвы, некрозы.
Для определения нормальных показателей у интакт-ных животных оценивали уровень микроциркуляции в мышцах бедра и голени правой задней конечности методом ЛДФ. Полученные средние значения уровня микроциркуляции в этой группе животных были приняты за «норму» и составили: 588,74 ± 19,28 п.е. (перфузионных единиц) в мышце бедра и 535,22 ± 17,53 п.е. в мышце голени.
Результаты оценки уровня микроциркуляции у интактных крыс, в контрольной и опытной группе с моделированием ишемии правой задней конечности представлены в таблице 2.
Как видно из данных таблицы 2, после операции уровень микроциркуляции у животных контрольной группы резко и быстро снижается, а затем медленно восстанавливается, однако до 28 суток включительно остается достоверно ниже нормального значения, зафиксированного в группе интактных крыс. Прежних значений уровень микроциркуляции достигает только через 3 месяца после операции.
По сравнению с контрольной группой в опытной группе уровень микроциркуляции на уровне бедра был выше на 10 сутки - в 1,8 раза, на 21 сутки - в 2 раза, на 28 сутки - в 2,1 раза; на уровне голени уровень микроциркуляции возрастает в 1,7 раза, в 1,9 раза и в 2 раза соответственно на тех же сроках.
Удельная площадь некроза в мышечных волокнах экспериментальных животных представлена в таблице 3.
Табл. 2. Динамика уровня микроциркуляции в группах экспериментальных животных (М+т в абсолютных значениях перфузионных единиц, п = 10)
Группы животных 10 сутки 21 сутки 28 сутки
бедро голень бедро голень бедро голень
Интактная 588,74 ± 19,28 535,22 ± 17,53 588,74 ± 19,28 535,22 ± 17,53 588,74 ± 19,28 535,22 ± 17,53
Контрольная 234,30 ± 7,22* 209,20 ± 6,45* 349,53 ± 15,71* 312,08 ± 14,03* 413,91 ± 16,4* 369,56 ± 14,64*
Опытная группа 420,28 ± 21,44# 350,23 ± 19,05# 695,47 ± 46,6# 579.56 ± 38.83# 873,98 ± 43,72# 728,32 ± 29,11#
Примечание: * - р < 0,05 в сравнении с показателями в интактной группе; # - р < 0,05 в сравнении с показателями в контрольной группе.
Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Гордов М.Ю.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КРИТИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА
Табл. 3. Динамика удельной площади некроза в группах экспериментальных животных, %
Группы животных 10 сутки 21 сутки 28 сутки
Контрольная 27,5 ± 6 11 ± 2,5 8,5 ± 1,5
Опытная 13,5 ± 2,2* 5,5 ± 0,8* 2,5 ± 0,3*
Примечание. * - при p < 0,05 в сравнении с контрольной группой.
Из таблицы 3 видно, что площадь некроза мышц в ишемизированной конечности в группе животных на фоне лечения аутологичной фракцией костного мозга площадь некроза мышечных волокон уменьшилась соответственно на 10 сутки - на 14%, на 21 сутки - на 5,5% и на 28 сутки - на 6%.
Гистологическое исследование удаленных ишеми-зированных мышц в контрольной группе животных показало следующее. На 10 сутки в пораженных мышцах обнаруживались крупные участки некроза, на периферии которых и в их глубине имелась картина тяжелого воспаления в виде выраженной инфильтрации сегментоядер-ными нейтрофилами и макрофагами. На 21 сутки вокруг зоны некроза происходило интенсивное образование грануляционной ткани, сохранялась выраженная воспалительная реакция. На 28 сутки зона некротизированной ткани начала постепенно замещаться грануляционной тканью, наблюдалось большое количество регенерирующих миобластов.
В опытной группе на 10-е сутки эксперимента на фоне введения аутологиченых мононуклеарных клеток костного мозга определялись очаги некроза с воспалительной инфильтрацией по периферии. Инфильтрат был представлен нейтрофилами и значительным количеством макрофагов и гистиоцитов. Выявлялись обширные разрастания грануляционной ткани, состоящей из сосудов капиллярного типа, недифференцированных клеток соединительной ткани, фибробластов и регенерирующих миобластов. На 21-е сутки эксперимента продолжалось замещение участков некроза грануляционной тканью, происходила регенерация мышечных волокон. Воспалительная реакция стихала. Вне зон некроза и грануляционной ткани формировались новообразованные сосуды капиллярного типа, скопления регенерирующих миобластов. На 28-е сутки заканчивался процесс замещения участков некроза соединительной тканью. Продолжалась регенерация групп мышечных волокон с образованием капиллярной сети, что свидетельствовало о неоангиогенезе.
Выводы
1. Разработанный способ введения полученной мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга 4х клеток в объеме 200 мкл в ишемизированную конечность из двух точек, в каждую из которых по 100 мкл: непосредственно под паховую связку в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей и ин-
трамускулярно в икроножную мышцу передне-латеральной поверхности средней трети голени позволяет активизировать коллатеральное кровообращение за счет резерва функционально незадействованных коллатеральных артерий и усиления притока крови из проксимальных отделов конечности в дистальные, что регистрируется при помощи лазерной допплеровской флоуметрии.
2. Площадь некроза мышц в ишемизированной конечности в группе животных после введения монону-клеарной фракции аутологичного костного мозга на 10 сутки уменьшилась в среднем на 14%, на 21 сутки
- на 5,5% и на 28 сутки - на 6% по сравнению с контрольной группой животных.
Литература
1. Кузнецов М.Р. Ранние реокклюзии у больных облитерирующим атеросклерозом / М.Р. Кузнецов, В.М. Кошкин, А.В. Каралкин - Ярославль. Нюанс. Медицина. 2007; 176.
2. Современные диагностические технологии в определении тактики лечения больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей / Майстренко Д.Н. [и др.] // Вестник хирургии. - 2009. - №2. - С. 41-46.
3. Способ лечения хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей: пат. 2392948 РФ: А61К 35/14, А61Р 9/10, А61М 5/00 / Б.С. Суковатых, А.Ю. Орлова, М.В. Покровский, Е.Б. Артюшкова; дата публ. 27.06.2010.
4. Тактические ошибки в лечении больных с критической ишемией нижних конечностей при поражении бедра и голени / Гавриленко А.В. [и др.] // Хирургия.
- 2011. - №5. - С. 10-14.
5. Шевченко Ю. Л. Клеточные технологии в сердечно-сосудистой хирургии / Ю.Л. Шевченко, С.А. Матвеев - М.: Медицина, 2005.
6. Bôyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Bôyum // Scand J Clin Lab Investig. - 1998. - Vol. 21. - Suppl. 97. - P. 1-9.
7. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II) / Norgren L. [et al] // J Vasc Surg. - 2007. - Vol. 45, № 1. - P. 5-67.
8. Intraarterial administration of bone marrow mononuclear cells in patients with critical limb ischemia: a randomized-start, placebo-controlled pilot trial (PROVASA) / D. H. Walter [et al.] // Circ Cardiovasc Interv. - 2011 Feb 1. - Vol. 4,
N 1. - P. 26-37.
9. Lawall H. Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal / H. Lawall, P. Bramlage, B. Amann // Thromb Haemost. - 2010 Apr.
- Vol. 103, N 4. - P. 696-709.
10. Our top 10 developments in stem cell biology over the last 30 years / L. Armstrong [et al.] // Stem Cells. - 2012 Jan. - Vol. 30, N 1. - P. 2-9.
11. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischemia by autologous transplantation of bone marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial / E. Tateishi-Yuyama [et al.] // Lancet. - 2002. - Vol. 360. - P. 427-435.
12. Tidball J.G. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration / J. G. Tidball, S. A. Villalta // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2010 May. - Vol. 298, N 5. - P. R1173-87.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Суковатых Борис Семенович
305041 Российская Федерация, г. Курск, ул. К.Маркса, 3 e-mail: SukovatykhBS@kursksmu.net
