CC BY
30
УДК 619:612.014.462.6:636.12
Ключевые слова: лошади, физическая нагрузка, кислотно-щелочное состояние, лизоцим, комплемент
Key words: horses, exercise, acid-base status, lysozyme, complement
Гундашева Д. И., Сотиров Л. К.
ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО АЦИДОЗА НА НЕКОТОРыЕ ПОКАЗАТЕЛИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ЛОШАДЕй
INFLUENCE OF METABOLIC ACIDOSIS ON SOME INDICATORS OF NONSPECIFIC IMMUNE RESPONSE IN HORSES
Государственный фракийский университет. Адрес: 6000, Болгария, г. Стара Загора, студенческий городок
Trakia University. Address: 6000, Bulgaria, Stara Zagora, Student's campus
Гундашева Димитрина Иванова, к. в. н., доцент каф. «Общая и клиническая патология животных»
Gundasheva Dimitrina I., Ph.D., Associate Professor at the Dept. of Animal General and Clinical Pathology Сотиров Лилян Крумов, проф. каф. «Генетика животных» Sotirov Lilian K., Doctor of Veterinary Science, Professor at the Dept. of Animal Genetics
Аннотация. Физическая нагрузка, которой были подвегнуты лошади в течение четырех дней, вызывает компенсаторный метаболический ацидоз. Этот ацидоз не оказывает влияния на гемолитическую активность класиче-ского пути активации комплемента. Через два часа после окончания нагрузок компенсаторный метаболический ацидоз в меньшей степени отрицательно влияет на активность лизоцима и в большей - на альтернативный путь активации комплемента. Снижение активности этих гуморальных факторов неспецифического иммунитета может сделать организм лошади более уязвимым к инфекции сразу же после физических нагрузок. Summary. The physical exercise to which the horses have been exposedfor four consequitive days led to a compensatory metabolic acidosis. This acidosis did not affect the haemolytic activity of the classical pathway of complement activation. Two hours after physical exercise, compensatory metabolic acidosis had a less negative impact on lysozyme activity than on the alternative pathway of complement activation. The decrease in activity of the humoral factors of nonspecific immunity during the early periods after physical exercise may make horses' organisms more vulnerable to infections.
Введение
Зависимость между кислотно-щелочным статусом (КЩС) и врожденным и приобретенным иммунитетом недостаточно изучена. Существует ограниченное количество данных у некоторых биологических видов, что изменения в КЩС после различных по характеру воздействий влияют на ряд показателей иммунного ответа. Установлено, что при остром и хроническом плавательном стрессе у крыс развивается декомпенсированный метаболический ацидоз и изменяется рСО2, что негативно влияет на В лимфоциты и клетки, продуцирующие антитела [3].
Низкие значения рН ингибируют хемотаксис нейтрофилов, их окислительную и бактерицидную активность, снижают активность лимфоцитов и их пролиферацию. У пациентов с ацидозом различного происхождения развиваются иммунодефицитные состояния [5].
Различная степень гиперхлоремическо-го ацидоза in vitro проявляется в виде эффектов, влияющих на синтез и выделение
воспалительных медиаторов: оксида азота (NO) и фактора некроза опухоли (TNF). Лактатный метаболический ацидоз оказывает противовоспалительное действие, проявляющееся в существенном снижении LPS-индуцированной экспрессии на NO, IL-6, IL-10, RNA [4].
Развитие респираторного метаболического ацидоза у новорожденных телят сопровождается дисбалансом между увеличением интенсивности окислительного стресса и снижением функционального состава анти-оксидантной системы, а также и нарушением количества иммуноглобулинов в молозиве, что снижает уровень колострального иммунитета [11].
На сегодняшний день мало изучены механизмы, посредством которых нарушения в КЩС влияют на специфический и, особенно, на неспецифический иммунный ответ. Это практически не изучено у лошадей. Цель данного исследования - изучить влияние КЩС на некоторые гуморальные факто-
ры естественной резистентности: лизоцим и комплемент после физической нагрузки лошадей.
Материалы и методы
Исследования проводили на 6 меринах ганноверской породы, в возрасте 3-4 года и весом 400-600 кг. Животные не подвергались предварительному активному тренировочному режиму и усиленным физическим нагрузкам. Годом ранее лошади были вакцинированы против Equine influenza virus (EIV) и Equine herpes virus EHV 4/1 (EHV 4/1). За 14 дней до начала исследований лошади были ревакцинированы против возбудителей этих болезней.
Физическая нагрузка, которой были подвергнуты лошади в течение четырех дней, моделировала спортивное соревнование с паркуром (соответствовала высокой прыжковой нагрузке в соревновательный период).
Пробы крови отбирали из v. jugularis анаэробным путем в гепаринизированные капилляры, предназначенные для исследования КЩС, затем капилляры помещали в дробленый лед и анализировали в течение 30 минут с момента получения с помощью аппарата AVL 982 Electrolyte analyzer, AVL, List GmbH, Graz, Austria. Были определены следующие показатели: pH крови, парциальное давление углекислого газа (pCO2), парциальное давление кислорода (pO2), актуальные бикарбонаты (HCO3~), общая двуокись углерода (CO2), щелочной избыток (ВЕ), насыщение кислородом (SAT) и гемоглобин (Hb). Аппарат от-
калибровывали перед каждым измерением. Все показатели были скорректированы для ректальной температуры. Сыворотка крови была использована для исследования показателей неспецифического иммунного ответа. Содержание лизоцима определено по методу Лия и др. [6], альтернативного пути активации комплемента (АПАК) по методу Со-тирова [12], адаптированного для лошадей, и классического пути активации комплемента (КПАК) по методу Майера [7].
Взятие крови проводили до физической нагрузки (исходный уровень), сразу же после физической нагрузки (1 период) и через два часа после окончания последней физической нагрузки (2 период).
Результаты были обработаны с помощью One Way ANOVA, р < 0,05 и представлены в виде x ± SEM. Коэффициенты корреляции были также рассчитаны с использованием статистического программного обеспечения (Stat Most for Windows, Date Most Corporation, USA). Сравнение относительно исходного уровня.
Результаты
Как видно из таблицы 1, сразу же после окончания физической нагрузки (1 период) снижались показатели рН крови (р < 0,01). Также в этот период исследований отмечали снижение уровней HCO3" (р < 0,001), TCO2 (р < 0,001) и BE (р < 0,0l). Через два часа после окончания физической нагрузки (2 период) эти показатели продолжали снижаться (р < 0,05). В этот же период наблюдали тен-
Таблица 1.
Изменения показателей кислотно-щелочного статуса (рН, НСО3~, ТСО2, ВЕ) и газового состава крови (рСО2, рО2, SAT) статуса в венозной крови лошадей на исходном уровне и после физических нагрузок
Исследо- рН рСО2 р02 нсо; ТСО2 ВЕ SAT Нв Ректаль-
вания (mm Hg) (mm Hg) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (%) (g/l) ная Т, °С
Исходный 7,41± 48,50± 53,83± 30,б2± 32,07± 5,90± 84,81± 122,8± 37,9±
уровень 0,01 0,5б 3,01 0,34 0,35 0,4б 2,5 5,бб 0,18
1 период 7,37± 4б,б7± б1,83± 2б,38± 27,70± 1,б5± 85,51± 202,2± 39,2±
0,01b 1,б1 5,35 0,83с 0,8бс 0,7бь 3,05 б,45с 0,11с
2 период 7,39± 4б,50± 5б,83± 28,17± 29,б7± 3,10± 8б,47± 15б,7± 38,0±
0,01 1,23 3,93 0,81а 0,79а 1,03а 1,79 7,44b 0,0б
Примечания. Показатели представлены как среднее (SEM); n = 6. Уровень значимости: а - р < 0,05; b - р < 0,01; с - р < 0,001 по сравнению с исходным уровнем.
Таблица 2.
Изменения в лизоциме, альтернативном пути активации комплемента (АПАК) и классическом пути активации комплемента (КПАК) на исходном уровне и после физических нагрузок лошадей
Исследования Лизоцим (^g/ml) АПАК (СН50) КПАК (СН50)
Исходный уровень 0,977±0,09 54,04±1,15 20,70±0,36
1 период 0,804±0,09 49,59±0,35 19,54±0,46
2 период 0,705±0,131 47,08±0,31с 20,99±1,02
Примечания. Показатели представлены как среднее (SEM), n = 6. Уровень значимости: с - р < 0,001 по сравнению с исходным уровнем.
денцию к снижению рС02 и небольшой рост р02 и SAT. После физической нагрузки (1 и 2 период) отмечали значительное увеличение (р < 0,001) концентрации НЬ в крови. Ректальная температура повышалась (р < 0,001) сразу же после физической нагрузки (1 период).
Активность лизоцима и АПАК снижались ко второму периоду исследований и это снижение было статистически значимо для АПАК (р < 0,001). Изменений гемолитической активности КПАК не установлено (табл. 2).
Обсуждение
Результаты исследования показывают, что в течение двух часов после физической нагрузки у лошадей развивается компенсаторный метаболический ацидоз. Об этом свидетельствует снижение уровня рН (в рамках референтного диапазона для лошадей) и связанных с ним снижений уровней рС02, НС03", ВЕ, и ТС02.
Сниженные показатели для ВЕ и НС03 свидетельствуют, что ацидоз во время высокой физической нагрузки, вероятно, появляется из-за увеличения уровня лактата вследствие доминирования анаэробного гликолиза. Некоторые авторы сообщают о метаболическом ацидозе, который сопровождается увеличением количества лактата после физических нагрузок [10].
Важное влияние на изменение ВЕ, кроме лактата, оказывает и количество бикарбонатов, действующих в качестве буфера для нейтрализации ионов водорода. Тесная связь между этими показателями видна из чрезвычайно высокой корреляции между ними
г = 0,969 ( р < 0,001) через два часа после физической нагрузки.
Снижение содержания бикарбонатов плазмы крови может быть связано с элиминированием С02 из легких, о чем свидетельствует крайне высокая корреляция между рС02 и НСО; ( г = 0,920; р < 0,009).
Тенденция к снижению рС02 и к увеличению р02 может быть в результате компенсационной гипервентиляции легких, вызванной физической нагрузкой. При гипервентиляции кровь почти не насыщается кислородом, необходимым для активно работающей мышечной ткани. Но одновременно с этим происходит элиминирование С02, способствующее восстановлению уровня рН, который наблюдался нами в течение двух часов после окончания физической нагрузки.
Развитие метаболического ацидоза, вероятно, связано с деятельностью ряда гормонов, таких как катехоламины и тиреоидные гормоны, уровень которых увеличивается после стресса. Эти гормоны стимулируют анаэробный метаболизм, производство тепла и сужение сосудов, способствуя тем самым изменению КЩС [9].
Так же установлена нами и гиперхроме-мия, статистически значимая как сразу после нагрузки (р < 0,001), так и через 2 часа (р < 0,01) после нее. Возможными причинами этой гиперхромемии во время физической нагрузки лошадей могут быть повышение доставки кислорода к работающим мышцам [13], а также потеря жидкости с последующим сгущением крови из-за сильного потоотделения животных.
Компоненты неспецифического иммунного ответа, обеспечивающие раннюю ста-
дию защиты, являются одними из первых, которые реагируют на сильные внешние воздействия. Изменения этих показателей указывает, что физическая нагрузка, которая сопровождается метаболическим ацидозом, несколько супрессирует активность лизо-цима до двух часов, в то время как эта супрессия в АПАК особенно сильна через два часа после окончания физических нагрузок (p < 0,001) при уровне рН 7,39. Физическая нагрузка не оказала влияния на КПАК.
Вполне возможно, что уменьшение количества лизоцима связано с нейтрофильной лейкопенией (нейтрофилы являются основным его продуцентом). Пока не ясно, меняет ли ацидоз, влияющий на процесс нейтро-фильного фагоцитоза и внутриклеточного киллинга [4], на синтез и секрецию этого энзима. Однако была установлена значительная корреляция на 2-й период исследований между показателем pCO2 и содержанием ли-зоцима ( r = 0,583; p < 0,225).
Полученный нами отрицательный результат для АПАК отличается от результата, полученного Фишелсоном и др. [2], которые обнаружили, что оптимальный уровень рН для инициирования и амплификации АПАК и формирования комплекса мембранной атаки является рН 6,4, а не рН 7,4. Кроме того, Емис и др. [1] показали, что лактатный ацидоз рег se стимулирует активацию комплемента in vitro, вероятно, из-за инактивации протеазных ингибиторов комплемента. Существуют доказательства того, что активация комплемента, благодаря С-реактивному белку, может быть результатом рН-зависимых конформационных изменений в белках [8].
Заключение
Таким образом, в результате исследований было установлено, что метаболический ацидоз, вызванный физической нагрузкой у лошадей, не оказывает влияния на гемолитическую активность при классическом пути активации комплемента (КПАК). Через два часа после окончания нагрузок метаболический ацидоз в некоторой степени снижает активность лизоцима, но в более сильной степени нами выявлено отрицательное влияние метаболического ацидоза на аль-
тернативный путь активации комплемента (АПАК). Снижение активности этих гуморальных факторов неспецифического иммунитета сразу же после физической нагрузки может сделать организм лошади более уязвимым к инфекции.
Список литературы
1. Emeis, M. Acidosis activates complement system in vitro / M. Emeis, J. Sonntag, C. William, E. Strauss, M. Walka, M. Obladen // Mediat. Inflamm. - 1998. - V. 7. -P. 417-420.
2. Fishelson, Z. Regulation of the alternative pathway of complement by pH / Z. Fishelson, R. Horstman, H. Muller-Eberhart // J. Immunol. - 1987. - V. 138. - P. 3392-3395.
3. Gundasheva, D. I. Effect of acute and chronic stress caused by swimming on acid-base state and immune response in rats / D. I. Gundasheva, M. J. Andonova, V. V. Ivanov // Vet. Med. Bg. - 1996 . - V. 2. - № 4. - P. 244-247.
4. Kellum, J. A. Science review: Extracellular acidosis and the immune response: clinical and physiological implication / J. A. Kellum, M. Song, J. Li // Crit. Care. -2004. - V. 8. - № 5. - P. 331-336.
5. Lardner, A. The effect of extracellular pH on immune function / A. Lardner // J. Leukoc. Biol. - 2001. - V. 69. -№ 4. - P. 522-530.
6. Lie, O. Improved agar plate assay of bovine lysozyme and haemolytic complement activity/ O. Lie, H. Solbu, M. Sued // Markers of resistence to infection on dairy cattle: Dissert., capt. V. - National Veterinary Institute. - Oslo, Norway, 1985. - P. 1-12.
7. Mayer, M. Complement and complement fixation./ E.A. Kabot, M. M. Mayer. Eds.// Experimental Immunichemistry. 2nd Edition. - Charles C. Tomas Publisher, Springfield IL., 1961. - P. 13-240.
8. Miyazawa, K. Complement activation by human C-reactive protein in midly acidic conditions / K. Miyazawa, K. Inoue // J. Immunol. - 1990. - V. 145. - P. 650-654.
9. Neubert, E. Effect of acute stress on plasma level of catecholomines, cortisol and metabolites in stress-susceptive growing pigs / E. Neubert, H. Gurtlet., G. Vallentin // Berlin und Munchen Tierarztl. Wochenschr. -1996. - V. 109 - P. 381-384.
10. Popplewell, J. C. Effect of dietary cation-anion balance on acid-base balance and blood parameters in anaerobically exercised horses / J. C. Popplewell, D. R. Topliff, D. W. Freman, J. E. Breazile // Anim. Sci. Res. Report - 1993. - P. 229-235.
11. Retskii, M. I. Correcting the antioxidant status of newborn calves for forming higher colostral immunity / M. I. Retskii, A. G. Shakhov, D. V. Chusov, A. I. Zolotaev, M. I. Lebedev, T. G. Ermolova, G. N. Bliznetsova // Russan Agricul. Sci. - 2010. - V. 36. - № 2. - P. 127-129.
12. Sotirov, L. K. Method for determination the alternative pathway of complement activation in some animals and man / Forth Scientific Conference of agriculture. - Stara Zagora, Bg. - 1996. - P. 1-10.
13. Taylor, L. Acid-base variables during incremental exercise in sprint-training horses fed a high-fat diet / L. Taylor, P. Ferante, D. Kronfeld, T. Meacham // J. Anim. Sci. - 1995. - V. 73. - P. 2009-2018.
