Влияние магнитного поля на активность фермента лактатдегидрогеназы Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 577.15:537.6

ВЛИЯНИЕ МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

© 2006 г. Е.Г. Чеботарева, В.Б.Бородулин, И.А.Горошинская, И.В.Бабушкина, Н.Ю.Фомина, В.В.Моррисон, А.Д.Усанов, А.В.Скрипаль, Д.А. Усанов

Results of research of influence of a variable magnetic field in the certain frequency and peak ranges of values for the speed of lactate dehydrogenase enzymatic reaction are resulted. The increase in speed of enzymatic reaction is revealed in comparison to control values more than in one and a half time.

Введение

В настоящее время достоверно установлено влияние магнитного поля (МП) на биологическую активность живых организмов. В частности, большое число публикаций, например [1-6], посвящено исследованию воздействия электромагнитных полей на жизнедеятельность организмов, применению МП в различных областях медицины, влиянию инфранизкочастот-ных МП на рост колоний микроорганизмов, ранний онтогенез растений, эмбриогенез млекопитающих.

Однако механизм действия МП на живые организмы для большинства из наблюдавшихся явлений практически не выяснен. Примером исключения является поведение магнитобактерий, вызванное высокой концентрацией содержащегося в них магнитного материала [7, 8].

Ключ к пониманию механизма действия МП на биологические объекты может быть найден, если будут исследованы особенности его влияния на органические компоненты, входящие в состав биологических объектов.

Важную роль в обмене углеводов играет фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Поскольку ранее нами было установлено, что на биологические объекты наибольшее влияние оказывает воздействие переменного магнитного поля (ПеМП) в определенном частотном и амплитудном диапазонах для заданного времени воздействия [9], то целью работы явилось исследование изменения скорости ферментативной реакции (СФР) после обработки образцов ПеМП.

Условия проведения эксперимента

Приготовление реактивов. Для работы использовали фермент ЛДГ («Reanal») в виде кристаллической суспензии в исходной концентрации 0,1 г в 5,65 мл (или 1,77-10-2г/мл) в 2,2 М раствора сульфата аммония. Фермент разводили в 3-107 раз до конечной концентрации 5,9-10-10 г/мл.

Для определения активности ЛДГ использовали кварцевую кювету с длиной оптического пути в 1 см. В нее последовательно вносили 3000 мкл 1/15 М фосфатного буфера, рН 7,4, 50 мкл пирувата натрия (4 мг пирувата натрия + 1 мл фосфатного буфера), 50 мкл НАДН (2 мг НАДН + 1 мл фосфатного буфера), 10 мкл фермента из последнего разведения.

Спектры регистрировались после добавления фосфатного буфера и НАДН в кювету на спектрофотометре «Specord UV VIS» в диапазоне волн от 220 до

400 нм. Для определения активности ЛДГ и исследования кинетики данного процесса самописец спектрофотометра устанавливали на отметку 29,5, что соответствовало длине волны 340 нм. Затем в кювету добавляли последовательно пируват натрия и ЛДГ. Сразу после добавления ЛДГ каждые 10 с в течение минуты отмечали время с помощью секундомера, затем каждую минуту до полного затухания реакции.

С0 - С1/2

СФР определяли по формуле: V = -

т-t0

где

V - СФР, моль/лх; С0 - концентрация НАДН до начала реакции, М; С1/2 - половина от общей концентрации НАДН, М; т - время, за которое произошло ферментативное окисление половины НАДН+Н+; /0 -время начала реакции.

Концентрацию НАДН определяли по формуле:

С

А

НАДН

где А, о.е. - оптическая плотность в

6220

оптических единицах; 6220 - молярный коэффициент экстинкции НАДН при Х=340.

Установка, используемая в эксперименте. Эксперимент проводился на установке, схема которой представлена на рис. 1. При создании ПеМП источником поля служил вращающийся диск диаметром 25 см, на котором радиально были прикреплены чередующиеся по полярности постоянные магниты с осью намагничивания, перпендикулярной плоскости диска. Помещенный непосредственно вблизи кюветы с ферментом, диск с помощью электродвигателя вращался в вертикальной плоскости с фиксированной плоскостью, обеспечивающей наличие ПеМП с частотой 5 Гц и амплитудой 0,025 Тл.

Рис. 1. Схема установки для получения ПеМП: В - вектор индукции магнитного поля, 1 - магниты, 2 - вращающийся диск, 3 - неподвижный держатель

Результаты и их обсуждение

После обработки образцов, содержащих фосфатный буфер, НАДН и пируват натрия, в течение 85 мин ПеМП скорость реакции при температуре 20 °С возрастала от 1,677-10-7 моль/л-с до 2,59-10-7 моль/л-с.

Скорость реакции зависела от времени воздействия ПеМП и не зависела от концентрации облученного буфера (рис. 2-5). При воздействии ПеМП на образцы в течение 85 мин скорость увеличивалась почти в 1,6 раза (таблица).

надн, моль л

№ опыта СФР, моль/(л-с)

Контроль 1,677-10"7

1 2,6-10"7

2 2,58-10-7

3 2,08-10-7

4 2,03-10"7

Контроль - без воздействия ПеМП. Опыт1 - 85 мин воздействия ПеМП на экспериментальный раствор, содержащий фосфатный буфер, пируват натрия и НАДН. Опыт 2 - 85 мин воздействия ПеМП на 10 мкл фосфатного буфера с последующим внесением этого объема в экспериментальный раствор, содержащий 2990 мкл фосфатного буфера, пируват натрия и НАДН. Опыт 3 - 120 мин воздействия ПеМП на 10 мкл фосфатного буфера с последующим внесением этого объема в экспериментальный раствор, содержащий 2990 мкл фосфатного буфера, пируват натрия и НАДН. Температура экспериментального раствора во всех опытах составляла 20 °С. Фермент во всех опытах вносили в экспериментальный раствор необ-лученным.

При действии ПеМП в течение 120 мин скорость реакции возрастала от 1,677-10-7 моль/л-с до 2,055-10-7 моль/л-с в среднем, что соответствует увеличению скорости реакции в 1,23 раза (таблица).

А 0,12-

0.1

0,0fr

0,04-

v = 0,0616е 0>™&

2.5-10" 2-Ю-5 1.510 5 1-Ю"5 510 6

| | | 1 V 1 б

- X л

ч.

1 1 1 1 •

0 100 20« 300 400 500 600

Рис. 2а. Кинетические кривые ферментативной реакции превращения пирувата в лактат по изменению оптической плотности НАДН: 1 - контроль; 2 - раствор, содержащий фосфатный буфер, пируват и НАДН, предварительно обработанный МП в течение 85 мин, с последующим добавлением фермента ЛДГ

Рис. 2б. Первые производные от кинетических кривых: 1 -контроль; 2 - опыт

В результате проведенных исследований установлены скорости реакций после воздействия ПеМП на исходный раствор с последующим переносом аликво-ты в необлученный раствор (опыты 2 и 4). В течение 85 мин облучали 100 мкл фосфатного буфера, брали аликвоту 10 мкл и вносили в 2990 мкл необлученного буфера. При увеличении времени воздействия ПеМП с 85 мин до 120 мин скорость реакции несколько снижалась от 2,58-10"7 моль/л-с до 2,03-10"7 моль/л-с.

А, о.е. 0,12

од 0,08 0,06 0,04 0,02

V = 0,0208е 1:1

oJ-1-^-———,-,-,-г- г, с.

у = 0,0121е-°-0(в*

0 100 200 J00 с-надн, моль/л

5,5-10

400

500 600

"00

300

600 t, с,

3 -10

2,5-10 2-10 1,5-10 1-10 5-10

0 100 200 300 400 500 600 700 с<

Рис. 3а. Кинетические кривые ферментативной реакции превращения пирувата в лактат по изменению оптической плотности НАДН: 1 - контроль, 2 -10 мкл фосфатного буфера, предварительно обработанного МП в течение 85 мин.

с

Его вносят в раствор, содержащий фосфатный буфер, пиру-ват и НАДН, предварительно не обработанный МП, с последующим добавлением фермента ЛДГ.

Рис. 3б. первые производные от кинетических кривых: 1- контроль; 2 - опыт

При внесении 10 мкл облученного ПеМП фосфатного буфера в конечный объем рабочего раствора, равный 3000 мкл, т.е. при разведении исходной (облученной) пробы в 1:300, СФР была существенно выше по сравнению с контрольными значениями скоростей реакции. Наблюдаемые результаты нельзя отнести к гомеопатическим эффектам, которые обнаруживаются при нано-, пико- и фемтомолярных концентрациях биологически активных молекул. Расчет показывает, что при добавлении 10 мкл в 3000 мкл объеме обнаруживается примерно 2-10-4 моль/л облученных молекул воды:

С = -

1 10•10-

1

2 • 10 4 моль/л.

М Vo 18 3 -10"л Здесь т - масса 10 мкл фосфатного буфера, облученного ПеМП, которая соответствует 10-10-6 г; М -молекулярная масса воды, равная 18 г/моль; V) - объем раствора, равный 3000 мкл.

В то же время, на основании полученных экспериментальных данных можно утверждать, что эффект от «обработанных» ПеМП молекул, содержащихся в 10 мкл раствора, каким-то образом передается на весь объем раствора (3000 мкл). В противном случае мы не обнаружили бы увеличения скорости реакции (опыт 2).

а, е.е.

0,12-1

v = 0,0125t

0.00251

( надн, моль л

2,5-10

2*10

1,5-10

МО

5-10

0 100 200 300 400 500 600 700 С

Рис. 4а. Кинетические кривые ферментативной реакции превращения пирувата в лактат по изменению оптической плотности НАДН: 1 - контроль; 2 - раствор, содержащий

фосфатный буфер, пируват и НАДН, предварительно обработанный МП в течение 120 мин, с последующим добавлением фермента ЛДГ

Рис. 4б. Первые производные от кинетических кривых: 1 -контроль; 2 - опыт

Выводы

1. Адекватным показателем действия МП на биологические объекты может служить изменение СФР. После воздействия на аликвоту раствора МП с частотой 5 Гц и амплитудой 0,025 Тл происходило увеличение скорости реакции примерно в 1,6 раза в сравнении с контролем при 85 мин и в 1,23 раза при 120 мин.

2. СФР зависит от времени воздействия МП и не зависит от концентрации облученного растворителя в конечном объеме рабочего раствора.

А, o.e.

а

0,08 0,06 0,04 0,02

у = 0,0337е0-ши*

у = 0,01б9е

100 200 300 400 500 600

700

С

К4ДН, моль, л

2,5-10

2-10

1,5-10

1-10

5-10

100 200 300 400 500 600 "00 с'

Рис. 5а. Кинетические кривые ферментативной реакции превращения пирувата в лактат по изменению оптической плотности НАДН: 1 - контроль, 2 -10 мкл фосфатного буфера, предварительно обработанного МП в течение 120 мин. Его вносят в раствор, содержащий фосфатный буфер, пируват и НАДН, предварительно не обработанный МП, с последующим добавлением фермента ЛДГ

Рис. 5б. Первые производные от кинетических кривых: 1 - контроль; 2 - опыт

Литература

1. Демецкий А.М., Алексеев А.Г. Искусственные магнитные поля в медицине. Минск, 1981.

2. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. Новосибирск, 1985.

3. Пресман А. С. Электромагнитные поля и процессы регулирования в биологии. Вопросы бионики. М., 1967.

6

m

4. Темурьянц Н.А., Владимирский Б.М., Тишкин О.П. Сверхнизкочастотные электромагнитные сигналы в биологическом мире. Киев, 1992.

5. Усанов Д.А. и др. // Биомедицинская радиоэлектроника. 2001. № 8. С. 57-61.

6. Popp F.A. Electromagnetic control of cell processes. Interaction with living system. Paris, 1979.

7. Бинги В.Н., Савин А.В. // УФН. 2003. Т. 177, №3. С. 265-300.

8. Киршвинк Д. Биогенный магнит и магниторецепция: Новое о биомагнетизме. Т. 1. М., 1989.

9. Усанов Д.А. и др. // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2003. № 3. С. 59-62.

Саратовский государственный медицинский университет, Саратовский государственный университет им Н.Г. Чернышевского, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт

1 марта 2006 г.