CC BY
39
УДК 577.3
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИКРОНОЖНОЙ МЫШЦЫ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Исследована концентрационная зависимость активности лактатдегидрогеназы икроножной мышцы крысы при гипотермических состояниях. Максимальная скорость и константа Михаэлиса уменьшаются при гипотермических состояниях, а константа субстратного ингибирования увеличивается. Отношение Ут/Кт увеличивается. При гипотермии 30 "С, пролонгированной в течение 3 ч, эти изменения выражены сильнее, чем при кратковременной гипотермии 20 "С. Эти результаты говорят о том, что при гипотермии происходит адаптивное изменение кинетических характеристик лактатдегидрогеназы, направленное на поддержание адекватной скорости гликолиза при низких концентрациях субстрата в мышце.
© 2011 г. Р.А. Халилов, А.М. Джафарова, И.С. Мейланов
Дагестанский государственный университет, ул. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, 367025, dgu@dgu.ru
Dagestan State University, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, 367025, dgu@dgu.ru
Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, икроножная мышца, крыса, гипотермия, константа Михаэлиса, максимальная скорость, константа субстратного ингибирования, температурная компенсация.
The concentration dependence of lactate dehydrogenase activity of gastrocnemius muscle was investigated at hypothermic states in rats. Maximal rate and Michaelis constant decrease and constant of substrate inhibition increases at hypothermic states of the animal. Vm/Km ratio increases at hypothermic states. At hypothermia 30 С prolonged during 3 h these effects are more expressed compared with short hypothermia 20 С. These results mean that there are adaptive changes in kinetic characteristics of lactate dehydrogenase of gastrocnemius muscle at hypothermia directed to maintain adequate rate of glycolysis at low lactate concentrations.
Keywords: lactate dehydrogenase, gastrocnemius muscle, rat, hypothermia, Michaelis constant, maximal rate, constant of substrate inhibition, temperature compensation.
Гомойотермия - эволюционно молодая стратегия температурной адаптации. Гомойотермы составляют лишь 2 эволюционно молодых класса позвоночных: млекопитающие и птицы. Эволюция органического мира шла, главным образом, путем постепенного приобретения новых функциональных возможностей. При этом часто сохраняются эволюционно древние адаптации. Например, несмотря на то, что большинство физико-химических параметров внутренней среды у млекопитающих гомеостатировано, у них сохранилась такая древняя адаптация, существовавшая у одноклеточных микроорганизмов, как экспрессия белков теплового шока в ответ на стрессовое воздействие. Гликолиз также является эволюционно древним энергетическим механизмом генерации аденозинтрифосфата (АТФ) по сравнению с окислительным фосфорилиро-ванием [1]. Это же можно сказать и относительно стратегии температурных адаптаций. У гомойотермов должны сохраниться хотя бы некоторые, древние пой-килотермные механизмы температурной адаптации. Эти механизмы, находясь в латентной форме до тех пор, пока внутренняя среда термостатирована, могли бы активизироваться при гипертермии или гипотермии - этих экстремальных для организма гомойотерма состояниях. Следы пойкилотермии проявляются уже в том, что температура поверхности тела у гомойотермов существенно зависит от температуры окружающей среды [2]. Именно поэтому тело млекопитающего можно разделить на ядро и оболочку. Ядро тела термо-статировано в узком диапазоне температур. Оболочка значительно более подвижна в этом отношении. В нее входят поверхностные ткани и подлежащие скелетные мышцы. Именно эти ткани первыми принимают на себя тепловые и холодовые удары. Можно сказать, что мышцы более пойкилотермны, чем печень или мозг.
Молекулярные механизмы температурных адапта-ций у пойкилотермов - одно из самых интересных научных направлений экологической биохимии и физиологии [3]. Особое внимание исследователи уделили температурным адаптациям ферментов, среди которых классическим объектом является лактатдегидрогеназа (ЛДГ) [4]. Акклимация и акклиматизация у рыб сопровождается изменением кинетических характеристик ЛДГ [5]. Механизмы этих изменений до сих пор не выяснены. Например, акклиматизация вьюнов к низкой (5 °С) и умеренной (15 С ) температуре среды обитания обнаруживает существенные различия в температурной зависимости константы Михаэлиса: при акклимации к 5 °С температурная зависимость Кт имеет минимум при 5 °С, а при акк-лимации к 15 °С этот минимум приходится на 15 °С [6]. Однако заметных изменений в химической струк-
туре ЛДГ при этом не обнаружено [7]. Поэтому была выдвинута гипотеза о том, что изменение температуры акклимации переводит молекулы ЛДГ из одной конформерной формы в другую.
Можно предположить, что в мышцах гомойотерм-ного животного при гипотермических состояниях могут проявиться пойкилотермные механизмы терморегуляции на уровне ЛДГ. В связи с этим нами исследовано влияние гипотермии на кинетические характеристики ЛДГ икроножной мышцы крысы.
Материалы и методы
Животные. Исследование проведено на белых беспородных крысах обоих полов массой 150^200 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе и были разбиты на 3 группы (по 3 животных в каждой): интактный контроль; пролонгированная в течении 3 ч гипотермия 30 °С; кратковременная глубокая гипотермия (температура тела 20 °С).
Гипотермия. Гипотермическое состояние создавали, помещая животных в камеру, в рубашке которой циркулирует вода 4^6 °С. Состояние умеренной гипотермии (ректальная температура 30 °С) достигает за 25^30 мин и потом пролонгируется в течении 3 ч глубокой гипотермии (ректальная температура 20 °С) - за 60 мин.
Выделение экстракта ткани. По достижении необходимого состояния животных декапитируют, выделяют икроножную мышцу. Навеску ткани (2 г) измельчают и гомогенизируют в 4-кратном объеме 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Гомогенат центрифугируют при 600 g в течение 10 мин. Центрифугат, профильтрованный через 4 слоя марли, повторно центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин. Полученный супернатант хранят в холодильнике при 4 °С.
Определение активности ЛДГ. Исходный экстракт разводят фосфатным буфером. В кювету спектрофотометра приливают 2,4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), 0,3 мл 0,3 мМ раствора пирувата натрия, 0,3 мл 1 мМ раствора НАДН. Реакцию инициируют добавлением в кювету 0,05 мл экстракта (40 мкг белка). Регистрируют оптическую плотность на длине волны 340 нм в течение 2 мин. Активность ЛДГ выражается в нмоль НАДН/(минмг белка).
Определение белка. Содержание белка в экстракте определяли по методу Лоури.
Определение концентрационной зависимости и кинетических характеристик ЛДГ. Исследование активности ЛДГ проводили в диапазоне концентраций пирувата от 0,1 до 12,8 мМ.
Кинетические характеристики ЛДГ (Кт, Ут, К) находили методом наименьших квадратов в соответствии с математической моделью субстратного ингиби-рования с одним ингибиторным местом связывания
Ут [5 ]
[8]. V = -
Km + [S ] +
S2
К
где Vm - максимальная ско-
E + S ^
k
z>.ES -
>E+P,
к_3 Ч къБ SES
где S - субстрат; Е - фермент; ES - фермент-субстратный комплекс; Р - продукты; SES - непродуктивный тройной комплекс; к, - константы скорости соответствующих стадий.
Концентрация субстрата, соответствующая оптимуму скорости реакции, определяется по формуле:
S
'opt
= ,[К~Щ , где Km = '-
k_i + k
2
k
К =
k
-3
Из рисунка видно, что смещается в область высоких концентраций при гипотермических состояниях.
рость; Кт - константа Михаэлиса; К - константа ингибирования; [8] - концентрация субстрата.
Результаты и обсуждение
На рисунке представлены зависимости скорости окисления от концентрации пирувата в диапазоне от 0,1 до 12,8 мМ (логарифмический формат) при различных состояниях животных. Кривые концентрационной зависимости имеют колоколообразную форму: скорость сначала растет при увеличении концентрации субстрата, а затем снижается. Таким образом, кинетика реакции катализируемой ЛДГ характеризуется наличием субстратного ингибирования, что согласуется с [9]. Снижение температуры тела при гипотермии приводит к уменьшению активности фермента во всем диапазоне исследуемых концентраций. Субстратное ингибирование происходит в простейшем случае в соответствии со схемой [8]
/
/■ __
'..''* N. \
•fc
-1,2 -1,0 -0,й -0,6 -0,4 -0.2 0,0 02 04 0,6 0,8 1,0 1,2 1д[пнруаат], мМ
Зависимость скорости окисления НАДН от концентрации пирувата: о - контроль, □ - гипотермия 20 °С, О - гипотермия 30 °С, пролонгированная 3 ч
В таблице представлены данные по влиянию гипотермии на основные кинетические характеристики Vm Km, K{. При гипотермии Vm уменьшается, но уменьшается и Km, причем отношение Vm/ Km даже несколько увеличивается по сравнению с контролем. Большинство ферментов in vivo работает при концентрации субстрата несколько меньше Km. В этом случае скорость реакции приблизительно описывается уравнением V = (VjKm) •[S].
Тот факт, что изменения Vm и Km компенсируют друг друга, возможно имеет биологическое значение: при низких концентрациях субстрата скорость реакции, катализируемой ЛДГ, при гипотермических состояниях будет примерно такой же, как и в контроле. Важным является и тот факт, что при гипотермии уменьшается Vm .
Кинетические характеристики ЛДГ икроножной мышцы крыс в норме, при глубокой и умеренной пролонгированной гипотермии
Состояние животного Кинетические характеристики
Km, мМ Vm, нмоль/мин V / K у m' m Sonm, мМ К мМ Д=К,- ^
Контроль 0,229±0,035 2880,31±329 12577,7 0,45 6,926±1,195 6,690
Гипотермия 20 °С 0,125±0,039* 1666,57±275* 13332,5 0,9 7,298±2,060 7,173
Гипотермия 30 °С (пролонгированная) 3 ч 0,082±0,012* 1288,79±4,97* 15716,9 1,03 13,08±0,769* 12,998
* - р<0,05.
Временные рамки гипотермического состояния, видимо, исключают возможность количественной регуляции активности фермента, так как синтез новых изо-форм - слишком инерционный механизм. Скорее всего, понижение температуры приводит к модификации уже существующих молекул ЛДГ. Однако в доступной нам литературе нет сведений о регуляторной химической модификации ЛДГ. Напротив, опубликован ряд работ [6, 7] , в которых показано, что при акклимации к
низким температурам у рыб ЛДГ мышц может переходить из высокотемпературного конформера к низкотемпературному. Поэтому можно ожидать, что при гипотермии у крыс изменяются конформации молекул ЛДГ. Эти изменения в принципе могут происходить как на уровне четвертичной структуры, так и третичной структуры протомеров. Тот факт, что изменение кинетических характеристик наблюдается уже при ректальной температуре 30 °С (температура мышц при
этом может быть на несколько градусов ниже) и увеличивается при пролонгировании этого состояния, указывает на то, что прямое влияние температуры на кон-формацию ЛДГ in vivo маловероятно. Можно предположить, что в изменении конформации могут принимать участие шапероны. Если при этом конформация должна измениться на уровне протомеров, то четвертичная структура должна быть предварительно разобрана, чтобы шапероны имели доступ к большей площади поверхности протомеров. В связи с этим следует отметить, что изменения кинетических параметров ЛДГ при глубокой гипотермии хоть и имеют ту же направленность, что при умеренной, но выражены меньше. Возможно, потому, что это гипотермическое состояние (глубокая гипотермия) достигалось всего лишь за 1 ч и не пролонгировалось.
Субстратное ингибирование ЛДГ объясняют образованием комплекса фермент--МЛВ+-пируват [8]. Увеличение Kj при гипотермии указывает на ослабление этого комплекса. Являются ли эти изменения биологически значимыми, неизвестно. Однако Гольдштейн [10] считает, что зависимость субстратного ингибиро-вания от рН может служить переключателем при переходе от аэробного к анаэробному дыханию в мышцах. Пируват расходуется в клетках как в процессе гликолиза, так и митохондриального окисления. Уменьшение константы Михаэлиса ЛДГ (увеличение сродства к пирувату) при гипотермии, возможно, позволяет мышцам эффективно использовать гликолиз для энергообеспечения мышц при низкой температуре ткани. В то же время уменьшение максимальной скорости не позволяет гликолизу отвлекать значительные количества пирувата при высоких концентрациях.
Полученные результаты указывают на то, что ЛДГ мышц у гомойотермов, возможно, реагирует адаптивно на изменение температуры ткани. Ранее нами было показано, что при кратковременной гипотермии 30 °С в икроножной мышце крысы активность ЛДГ незна-
Поступила в редакцию_
чительно, но увеличивается [11]. Кратковременная умеренная гипотермия повышает терморегуляторный тонус, в частности, вызывает мышечную дрожь. Пролонгирование гипотермии приводит к истощению энергетических ресурсов в мышцах, прекращению дрожи. Поэтому гликолитический поток снижается, активность ЛДГ снижается.
Литература
1. Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М.,
1978. 304 с.
2. Слоним А.Д. Эволюция терморегуляции. Л., 1986. 76 с.
3. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.,
1988. 568 с.
4. Somero G.H. Adaptation of enzymes to temperature: search-
ing for basic «strategies» // Comp. Biochem. Physiol. Part B. 2004. Vol. 139. P. 321-333.
5. Activity, stability and structural studies of lactate dehydro-
genases adapted to extreme thermal environments / N. Co-quelle [et al.] // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 374. P. 547-562.
6. Кинетические различия лактатдегидрогеназы из мышц
рыб при температурной адаптации / О.С. Клячко [и др.] // Биофизика. 1995. Т. 40. С. 513-517.
7. Сравнительное изучение конформационной стабильно-
сти лактатдегидрогеназы из мышц вьюна, адаптированных разным температурам среды, по данным дифференциальной микрокалориметрии / А.В. Персиков [и др.] // Биофизика. 1999. Т. 44, № 1. С. 32-37.
8. Effects of temperature acclimation on lactate dehydrogenase
of cod (Gadus morhua): genetic, kinetic and hermodynamic aspects / M. Zakhartsev [et al.] // J. Experimental Biology. 2004. Vol. 207. P. 95-112.
9. Place A.R., Powers D.A. Kinetic characterization of lactate
dehydrogenase(LDH-B4) allozymes of Fundulus heterocli-tus // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, № 2. P. 1309-1318.
10. Goldstein B.N. Transient enzyme kinetics: Graph-theoretic
approach // Biophys. Chem. 2009. Vol. 141. P. 193 -197.
11. Львова С.П., Мейланов И.С. Температурная компенса-
ция активности ферментов у гомойотермных животных // Биофизика. 2000. Т. 45, № 2. С. 228-231.
_27 сентября 2010 г.
