CC BY
345
УДК 546.548.54-1 DOI: https://doi.org/10.34680/2076-8052.2020.5(121).78-82
ВЛИЯНИЕ ЛЕЦИТИНА НА ФАЗОВЫЙ СОСТАВ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ В ЖЕЛЧИ
О.А.Голованова, С.С.Леончук EFFECT OF LECITHIN ON THE PHASE COMPOSITION OF CALCIUM CARBONATE IN BILE
O.A.Golovanova, S.S.Leonchuk
Омский государственный университет им. Ф.М.Достоевского, [email protected], [email protected]
Данное исследование посвящено изучению влияния лецитина на состав осадка, сформированного при осаждении карбоната кальция в присутствии желчи. Проведен синтез двенадцати образцов при варьировании концентрации лецитина и состава желчи. Методами рентгенофазового анализа, ИК-Фурье-спектроскопии и оптической микроскопии установлено, что лецитин в малых концентрациях стабилизирует образование метастабильных кристаллических модификаций карбоната кальция (ватерита и арагонита), а при увеличении концентрации — ингибирует процесс кристаллизации карбоната кальция в целом.
Ключевые слова: карбонат кальция, лецитин, L-альфа-фосфатидилхолин, ватерит, арагонит, кальцит, желчь, желчные камни
Для цитирования: Голованова О.А., Леончук С.С. Влияние лецитина на фазовый состав карбоната кальция в желчи // Вестник НовГУ. Сер.: Технические науки. 2020. №5(121). С.78-82. DOI: https://doi.org/10.34680/2076-8052.2020.5(121).78-82.
This research is devoted to studying the effect of lecithin on the composition of the sediment formed during the precipitation of calcium carbonate in the presence of bile. Synthesis of twelve samples was carried out with varying lecithin concentration and bile composition. It was established by X-ray diffraction (XRD) phase analysis, FTIR spectroscopy and optical microscopy that lecithin in low concentrations stabilizes the formation of metastable crystalline modifications of calcium carbonate (vaterite and aragonite), and with increasing concentration inhibits the crystallization of calcium carbonate in general.
Keywords: calcium carbonate, lecithin, L-alpha-phosphatidylcholine, vaterite, aragonite, calcite, bile, gallstones
For citation: Golovanova O.A., Leonchuk S.S. Effect of lecithin on the phase composition of calcium carbonate in bile // Vestnik NovSU. Issue: Engineering Sciences. 2020. №5(121). P.78-82. DOI: https://doi.org/10.34680/2076-8052.2020.5(121).78-82.
Введение
Карбонат кальция представляет собой соединение, отличающееся высокой распространенностью в живой природе, в том числе в организме человека. Это минерал с широким полиморфным набором (кальцит, метастабильные арагонит и ватерит, кристаллогидраты моногидрокальцит и шестиводный икаит, а также аморфный СаС03) [1], который используется в различных отраслях современной науки и техники, в том числе в медицине, в пищевой промышленности и даже в экологии, климатологии и палеонтологии [2-4]. При этом, несмотря на его достаточно полную изученность как индивидуального вещества, исследования его свойств, полиморфных модификаций продолжаются и сегодня. Прежде всего, они связаны с изучением взаимного влияния ряда соединений, в основном органической природы, на процессы кристаллизации разных модификаций карбоната кальция [5-9].
Один из таких процессов — появление карбоната кальция в составе желчных камней (холелитов). Известно, что состав желчных камней многообразен. Это могут быть фосфаты, стеарат, билирубинат и др., однако большая часть всей неорганической составляющей желчных камней представлена именно карбонатом кальция, причем находящимся в метаста-бильной модификации — в форме ватерита (с редкими примесями кальцита, арагонита и аморфного
СаС03). Важно, что без солей кальция образование даже холестериновых холелитов было бы невозможным, как отмечают авторы [10,11].
Как связаны между собой раствор, в котором протекает кристаллизация, и фазовый состав осаждаемого карбоната кальция уже частично известно из ряда исследований [1,5,12]. Некоторые вещества (часто органической природы) способствуют кристаллизации в растворе метастабильных модификаций СаС03, стабилизируя их образование, но механизм этого явления до конца не изучен. Основываясь на знании о составе желчи человека, где в качестве главных компонентов выступают холестерин, желчные кислоты и лецитин, можно предположить, что эти компоненты могут влиять на фазообразование ряда модификаций карбоната кальция в системе Са2+ - С032-, что подтверждается рядом исследований [5,13,14]. Особое внимание, на наш взгляд, необходимо уделить лецитину.
Лецитин (Ь-а-фосфатидилхолин) — один из самых распространенных и биологически важных фосфолипидов. В настоящее время лецитин повсеместно используется в пищевой промышленности в качестве недорогого и эффективного эмульгатора ввиду своего амфифильного химического строения [15,16]. В желчи человека лецитин выполняет стабилизирующую функцию, образуя мицеллы и везикулы с молекулами желчных кислот и не растворимого в воде холестерина, которые также наряду с лецитином
являются главными компонентами желчи. При желчнокаменной болезни концентрация лецитина, как правило, бывает либо повышенной (приводит к возрастанию вязкости желчи), либо сниженной (при этом снижается связывание холестерина в мицеллы и везикулы) [17,18]. В организме человека лецитин также выполняет множество других биохимических функций (в том числе метаболическую и структурную). Известна его значимость для мозга, которая определяется необходимостью лецитина для строительства мембран нервных клеток и выработки ней-ромедиатора — ацетилхолина [15,16,19]. Таким образом, можно предположить возможность влияния лецитина и его концентрации на устойчивость полиморфных модификаций карбоната кальция, что может быть связано и с дальнейшим процессом формирования и роста желчных камней. Поэтому целью данного исследования стало изучение влияния лецитина при варьировании его концентрации на фазовый состав карбоната кальция, осаждаемого из раствора желчи.
Экспериментальная часть
В данном исследовании были проведены три параллельные серии экспериментов, в каждой из которых использовались разные модельные растворы желчи. При этом каждая серия включала в себя 4 синтеза, отличающиеся между собой только концентрацией вводимого лецитина.
Модельные растворы. Первые образцы (1-4) были синтезированы с использованием водного раствора №С1 в качестве модельного раствора желчи. При этом моделировалась только неорганическая составляющая желчи путем создания необходимой ионной силы раствора [5]. Хлорид натрия не вводился заранее, а получался в системе в ходе целевой реакции между хлоридом кальция и гидрокарбонатом натрия.
Образцы (5-8) были получены с использованием модельного раствора, приготовленного из сухой желчи (желчь КРС сухая, очищенная, ТУ 10.02.01.112-89, ОМСКРЕАКТИВ). При этом учитывалось, что содержание сухой составляющей в желчи — порядка 133,5 г/л [20].
Синтезы образцов (9-12) были проведены в консервированной медицинской желчи (ООО «САМСОН-МЕД», эмульсия для наружного применения), использованной в качестве модельного раствора желчи человека. Присутствием фосфолипидов в желчи при синтезе образцов 5-12 пренебрегали.
Общая схема синтеза. Из модельного раствора и необходимого количества лецитина (см. табл.) готовилось 500 мл смеси (кроме синтезов образцов 1, 5 и 9, в которых лецитин не вводился, т. е. в этих случаях использовалось 500 мл модельного раствора). После этого смесь делилась на две равные части по 125 мл. В первую её часть вводилось 55,0х10-3 моль/л ионов НС03- в форме NaHCO3, а во вторую — 6,60*10-3 моль/л ионов Са2+ в форме СаС12*2Н20 в соответствии с максимальной (для гидрокарбоната) и средней (для кальция) концентрациями этих ионов в желчи человека соответственно [5]. Далее первый раствор из бюретки со скоростью ~ 0,2 мл/с приливали к раствору с солью кальция в стакане, термостати-
руемом при 310+1 К при постоянном перемешивании. После их полного смешения перемешивание продолжали еще 10 мин. Реакция осаждения протекает в соответствии с уравнением: СаСЬ + 2 NaHCOз = СаТОэ + 2 №С1 + СО2 + Н2О.
Полученные растворы с осадками помещали в шкаф-термостат БИАТРОН при температуре 310+1 К (температура внутренних органов человека) на 7 суток. Затем осадки фильтровали, промывали водой и этиловым спиртом и высушивали при комнатной температуре до постоянной массы в эксикаторе. Полученные образцы твердой фазы далее исследовали методами рентгенофазового анализа, ИК-Фурье-спектроскопии и оптической микроскопии.
Описание синтезов CaCO3
№ образца Концентрация лецитина* Модельный раствор
1 0
2 0,5C Раствор NaCl
3 1С
4 2С
5 0
6 0,5С Раствор сухой желчи
7 1С
8 2С
9 0
10 0,5С Консервированная
11 1С желчь
12 2С
* В таблице С = 8,0х10-3 моль/л, что соответствует средней концентрации лецитина в желчи среднестатистического здорового человека.
Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3М методом Дебая-Шеррера. Дифрактограммы снимали в интервале углов 26 от 10° до 60°. Качественный анализ фазового состава образцов осуществлялся на основе литературных данных о характеристических углах рассеяния [1]. Обработку дифрактограмм проводили в программе OriginPro 2018.
ИК-Фурье-спектроскопия полученных порошков осуществлялась на спектрофотометре «ФТ-801» (СИМЕКС, Россия). Для изучения образец в виде порошка массой 0.5 мг смешивали с 50 мг KBr и прессовали в таблетку диаметром 3 мм. Температура — комнатная, разрешение спектров — 4 см-1, общее число сканирований — 32, область сканирования — от 400 до 4000 см-1. Обработку ИК-спектров проводили в программе OriginPro 2018 с использованием литературных данных о положении характеристических полос поглощения различных атомных группировок (в том числе для неорганических анионов) [1].
Оптическая микроскопия синтезированных образцов производилась с помощью микроскопа «XCP-104» (АРМЕД, Россия). Исследовалась морфология данных порошков. Пробы тонким слоем наносили на предметное стекло и изучали под микроскопом с увеличением ><640. Микрофотографии получали с помощью оборудования и программы «Toup View».
Обсуждение результатов
Данные, полученные при синтезе образцов 1-4, показали, что в отсутствие лецитина при прочих равных условиях из водно-солевого раствора осаждается карбонат кальция, представленный кальцитом и мо-ногидрокальцитом в виде преобладающих фаз с примесью арагонита (рис.1, образец 1). Анализируя рентгенограммы образцов 3-4, можно сказать, что присутствие лецитина в водном растворе в малых концентрациях (образец 2) способствует образованию вате-рита и частично ингибирует процесс кристаллизации СаС03. Повышение же концентрации лецитина приводит к значительному увеличению аморфной составляющей карбоната кальция в составе осадка и к ингибированию кристаллизации СаС03 в целом (образцы 3 и 4). Полученные при обработке дифракто-
грамм данные подтверждаются и ИК-спектрами образцов (рис.2, образцы 1 и 3), на которых видно заметное снижение интенсивности характеристических колебаний карбонат-аниона (713, 875 и 1420 см-1 для кальцита) [1]. При этом стоит отметить, что образующаяся смесь аморфного карбоната кальция и лецитина в образцах 2-4 с увеличением концентрации последнего приводит к снижению интенсивности всех полос поглощения в ИК-спектрах. Это характеризует уменьшение интенсивности соответствующих колебаний групп в изучаемых соединениях.
Результаты оптической микроскопии коррелируют с данными ранее приведенных методов исследования: на микрофотографиях образца 1 (рис.3а) отчетливо видно кристаллы тригональной сингонии, в то время как в образцах 2-4 (рис.3б) отдельные кристаллы не были обнаружены.
Рис.1. Рентгенограммы некоторых образцов. На рисунке: К— кальцит, М — моногидрокальцит, А — арагонит, В — ватерит, И — икаит
нЭ -
н
о н
О
х 1
@
к о ж
и А ь
К Н
К :
V, см
-1
2000 4000
Рис.2. ИК-спектры некоторых образцов
6000
Рис.3. Микрофотографии некоторых образцов (увеличение *640)
Для образцов 5-8 по данным РФА (рис.1, образцы 5 и 7) отмечается высокая степень аморфности (низкая кристалличность) всех образцов, полученных в модельном растворе из сухой желчи. Основной состав — это аморфный СаС03 (с микропримесями арагонита и икаита в образце 5). С введением лецитина частично снижается интенсивность рассеяния в области малых 6, увеличивается разрешенность некоторых пиков. Однако значимых изменений в фазовый состав лецитин не вносит ни в одном из трех случаев (образцы 6-8). ИК-спектроскопия подтверждает результаты РФА (рис.2, образцы 5 и 7): колебательные спектры образцов 6-8 практически идентичны и характеризуют в основном присутствие органических группировок таких соединений, как билирубин, холестерин и т.п. Таким образом, влияния лецитина на состав полученного осадка практически не наблюдается. Микрофотографии всех образцов 5-7 (рис.3в, г) имеют идентичный вид и характеризуются обилием аморфных агрегатов, что и следовало ожидать.
Для образцов 9-12 рентгенограммы (рис.3, образцы 9 и 11) указывают на более высокую степень кристалличности осадков (за исключением образца 12, представленного аморфным СаС03). Состав образцов 9, 10 и 11 представлен в основном смесью фаз ватерита, моногидрокальцита и кальцита с преобладанием первых двух. Можно отметить, что при увеличении концентрации лецитина в модельном растворе наблюдается снижение кристалличности осадков, а также явное снижение содержания фазы моно-гидрокальцита в осадке. На ИК-спектрах наблюдается снижение интенсивности колебаний карбонат-аниона, но не такое резкое, как для образцов 1-4. Микрофотографии образца 9 (рис.3д) показывают наличие в осадке сферических частиц, характерных для ватери-та (гексагональной сингонии). Но в образцах 10-12 с
увеличением концентрации лецитина число таких сферолитов сводится к минимуму (рис.3е), на фото заметны только частицы аморфной фазы.
Заключение
Проведен синтез и анализ двенадцати образцов, полученных в различных экспериментальных условиях. С помощью РФА, ИК-Фурье-спектроскопии и оптической микроскопии установлено, что лецитин во всех случаях выступает ингибитором кристаллизации карбоната кальция, а также снижает долю фазы моно-гидрокальцита в образующихся осадках и приводит к значительному увеличению аморфности твердой фазы в целом (особенно при двукратном превышении концентрации лецитина сверх средней его концентрации в желчи). Это подтверждает тот факт, что лецитин является важным стабилизатором желчи как биохимической системы, препятствуя образованию центров кристаллизации из карбоната кальция и дальнейшему росту кристаллических фаз, которые могут формировать желчные камни.
1. Al Omari M.M.H., Rashid I.S., Qinna N.A. et al. Calcium Carbonate // Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology. 2016. Vol.41. P.31-132. doi 10.1016/bs.podrm.2015.11.003.
2. Tollefson J. First sun-dimming experiment will test a way to cool Earth // Nature. 2018. Vol.563. P.613-615. doi 10.1038 / d41586-018-07533-4.
3. Griffith E.M., Paytan A., Caldeira K. et al. Dynamic marine calcium cycle during the past 28 million years // Science. 2008. Vol.322. Issue 5908. P.1671-1674. doi 10.1126/science. 1163614.
4. Ваганов Е.А., Круглов В.В., Васильев В.Г. Природные индикаторы изменений климата: учебное пособие. Красноярск: Изд-во СФУ, 2008. 151 с.
5. Golovanova O.A., Leonchuk S.S. Synthesis of calcium carbonate in the presence of bile, albumen, and amino acids //
Russ. J. Inorg. Chem. 2020. Vol.65. № 4. P.472-479. doi: 10.1134/S0036023620040063.
6. Euw S.V., Azai's T., Manichev V. et al. Solid-state phase transformation and self-assembly of amorphous nanoparticles into higher-order mineral structures // J. Am. Chem. Soc. 2020. Vol.142. №29. P. 12811—12825. doi: 10.1021 / jacs.0c05591.
7. Shir I.B., Kababya S., Zax D.B., Schmidt A. Resilient intracrystalline occlusions: a solid-state nmr view of local structure as it tunes bulk lattice properties // J. Am. Chem. Soc. 2020. Vol. 142. №32. P.13743-13755. doi: 10.1021/jacs.0c03590.
8. Du H., Steinacher M., Borca C. et al. Amorphous CaCO3: Influence of the formation time on its degree of hydration and stability // J. Am. Chem. Soc. 2018. Vol.140. №43. P.14289-14299. doi: 10.1021/jacs.8b08298.
9. Seknazi E., Mijowska S., Polishchuk I., Pokroy B. Incorporation of organic and inorganic impurities into the lattice of metastable vaterite // Inorg. Chem. Front. 2019. №6. P.2696-2703. doi: 10.1039/c9qi00849g.
10. Тихонов Д.Г. Патогенез желчнокаменной болезни // Якутский медицинский журнал. 2015. №4. С.91-96.
11. Голованова О.А. Желчные камни: монография. Омск: Наука, 2012. 126 с.
12. Франке В.Д., Бочаров С.Н. Морфология кристаллов карбоната кальция в присутствии аспарагиновой кислоты, желатина и холестерина // Современная минералогия: от теории к практике. Мат. XI Съезда РМО. СПб, 2010. С.160-162.
13. Пальчик Н.А., Столповская В.Н., Мороз Т.Н. и др. Фазовый и микроэлементный состав желчных камней // Журн. неорган. химии. 2003. Т.48. №12. С.2080-2085.
14. Lee T., Chen J.G. Biomimetic Gallstone Formation: Crystallization of calcium carbonate by the evolving taurocholate-lecithin-cholesterol complex lipid system // Cryst. Growth Des. 2009. V.9. №8. P.3737-3748. doi 10.1021/cg900440p.
15. Дзяк Г.В., Дроздов А.Л., Шульга С.М. и др. Современные представления о биологических свойствах лецитина (лекция для врачей) // Медичш перспективи. 2010. Т.15. №2. С.123-135.
16. Огай М.А., Степанова Э.Ф., Малявина В.В. Использование лецитина в мягких лекарственных формах // Научные ведомости. Сер.: Медицина. Фармация. 2011. Т.117. №22. С.159-163.
17. Быстровская Е.В., Ильченко А.А., Сильвестрова С.Ю. Особенности биохимического состава операционной желчи при различных видах холецистолитиаза // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2010. №6. С.3-6.
18. Jungst D., Lang T., Huber P. et al. Effect of phospholipids and bile acids on cholesterol nucleation time and vesicular/micellar cholesterol in gallbladder bile of patients with cholesterol stones // Journal of Lipid Research. 1993. V.34. P.1457-1464.
19. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека в 2-х т. / Пер. с англ. М.: Мир; Бином. 2009.
20. Коротько Г.Ф. Физиология системы пищеварения. Краснодар: Изд-во ООО БК «Группа Б». 2009. 608 с.
References
1. Al Omari M.M.H., Rashid I.S., Qinna N.A., Jaber A.M., Badwan A.A. Calcium Carbonate / In: Brittain H.G., editor. Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology. Burlington: Academic Press, 2016, vol. 41, pp. 31132. doi 10.1016/bs.podrm.2015.11.003
2. Tollefson J. First sun-dimming experiment will test a way to cool Earth. Nature, 2018, vol. 563, pp. 613-615. doi 10.1038 / d41586-018-07533-4
3. Griffith E.M., Paytan A., Caldeira K., Bullen T.D., Thomas E. Dynamic Marine Calcium Cycle During the Past 28 Million Years. Science, 2008, vol. 322, pp. 1671-1674. doi 10.1126/science.1163614
4. Vaganov E.A., Kruglov V.V., Vasil'ev V.G. Prirodnye indi-katory izmeneniy klimata [Natural indicators of climate
change]: uchebnoe posobie. Krasnojarsk, SFU Publ., 2008. 151 p.
5. Golovanova O.A., Leonchuk S.S. Synthesis of Calcium Carbonate in the Presence of Bile, Albumen, and Amino Acids. Russ. J. Inorg. Chem., 2020, vol. 65, no. 4, pp. 449-457. doi: 10.1134/S0036023620040063
6. Euw S.V., Azaïs T., Manichev V., Laurent G., Pehau-Arnaudet G., Rivers M., Murali N., Kelly D.J., Falkowski P.G. Solid-State Phase Transformation and Self-Assembly of Amorphous Nanoparticles into Higher-Order Mineral Structures. J. Am. Chem. Soc., 2020, vol. 142, no. 29, pp. 1281112825. doi: 10.1021 / jacs.0c05591
7. Shir I.B., Kababya S., Zax D.B., Schmidt A. Resilient In-tracrystalline Occlusions: A Solid-State NMR View of Local Structure as It Tunes Bulk Lattice Properties Schmidt. J. Am. Chem. Soc., 2020, vol. 142, no. 32, pp. 13743-13755. doi: 10.1021/jacs.0c03590
8. Du H., Steinacher M., Borca C., Huthwelker T., Murello A., Stellacci F., Amstad E. Amorphous CaCO3: Influence of the Formation Time on Its Degree of Hydration and Stability. J. Am. Chem. Soc., 2018, vol. 140, no. 43, pp. 14289-14299. doi: 10.1021/jacs.8b08298
9. Seknazi E., Mijowska S., Polishchuk I., Pokroy B. Incorporation of organic and inorganic impurities into the lattice of me-tastable vaterite. Inorg. Chem. Front., 2019, no. 6, pp. 26962703. doi: 10.1039/c9qi00849g
10. Tikhonov D.G. Patogenez zhelchnokamennoy bolezni [Pathogenesis of gallstone disease]. Yakutskiy meditsinskiy zhurnal, 2015, no. 4, pp. 91-96.
11. Golovanova O.A. Zhelchnye kamni [Gallstones]: mono-grafiya. Omsk, Nauka Publ., 2012. 126 p.
12. Franke V.D., Bocharov S.N. Morfologiya kristallov kar-bonata kal'tsiya v prisutstvii asparaginovoy kisloty, zhelatina i kholesterina: [Morphology of calcium carbonate crystals in the presence of aspartic acid, gelatin and cholesterol]: doklad na XI S"ezde RMO. Saint Petersburg, 2010, pp. 160-162.
13. Pal'chik N.A., Stolpovskaya V.N., Moroz T.N., Kolmagorov Yu.P., Leonova I.V. Fazovyy i mikroelementnyy sostav zhelchnykh kamney [Phase and trace element composition of gallstones]. Zhurn. neorgan. khimii, 2003, vol. 48, no. 12, pp. 2080-2085.
14. Lee T., Chen J.G. Biomimetic Gallstone Formation: Crystallization of Calcium Carbonate by the Evolving Taurocholate-Lecithin-Cholesterol Complex Lipid System. Cryst. Growth Des., 2009, vol. 9, no. 8, pp. 3737-3748. doi 10.1021/cg900440p
15. Dzyak G. V., Drozdov A. L., Shul'ga S. M., Glukh A. I., Glukh I. S. Sovremennye predstavleniya o biologicheskikh svoystvakh letsitina (lektsiya dlya vrachey) [Modern ideas about the biological properties of lecithin (a lecture for doctors)]. Medichni perspektivi, 2010, vol. 15, no. 2, pp. 123135.
16. Ogay M. A., Stepanova E. F., Malyavina V. V. Ispol'zovanie letsitina v myagkikh lekarstvennykh formakh [The use of lecithin in soft drug forms]. Nauchnye vedomosti. Seriya Meditsina. Farmatsiya, 2011, vol. 117, no. 22, pp. 159-163.
17. Bystrovskaya E. V., Il'chenko A. A., Sil'vestrova S. Yu. Osobennosti biokhimicheskogo sostava operatsionnoy zhel-chi pri razlichnykh vidakh kholetsistolitiaza [Features of the biochemical composition of surgically removed bile in various types of cholecystolithiasis]. Eksperimental'naya i klinicheskaya gastroenterologiya, 2010, no. 6, pp. 3-6.
18. Jungst D., Lang T., Huber P., Lange V., Paumgartner G. Effect of phospholipids and bile acids on cholesterol nucleation time and vesicular/micellar cholesterol in gallbladder bile of patients with cholesterol stones. Journal of Lipid Research, 1993, vol. 34, pp. 1457-1464.
19. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W. Harper's Biochemistry, 21th ed., 1988. (Russ. ed.: Marri R., Grenner D., Mejes P., Rodujell V. Biohimija cheloveka v 2-h tomah: per. s angl. Moscow, Mir; Binom Publ., 2009. 797 p.).
20. Korot'ko G. F. Fiziologiya sistemy pishchevareniya. [Physiology of the digestive system]. Krasnodar, OOO BK Gruppa B Publ., 2009. 608 p.
