CC BY
46
Влияние Ь-лизил-Ь-глутаминовой кислоты на фенотип лимфоцитов у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких
Янченко В.В., Аляхнович Н.С., Смирнова О.В., Величинская О.Г., Новиков Д.К.
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Беларусь
Yanchanka U.V., Aliakhnovich N.S., Smirnova O.V., Velichinskaya O.G., Novicau D.K.
Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Belarus
L -lysyl-L-glutamic acid influence on the lymphocytes phenotype in patients with chronic obstructive lung disease
Резюме. Изучена клинико-иммунологическая эффективность L -лизил-L -глутаминовой кислоты (иммугенин) в рандомизированном простом слепом контролируемом проспективном исследовании в параллельных группах пациентов с плацебо-контролем на фоне стандартной терапии хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Установлено, что у пациентов, получавших иммугенин, достоверно реже наблюдались острые респираторные заболевания (ОРЗ) и обострения ХОБЛ, а также удлинялся период ремиссии, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. Применение этого препарата было безопасным, увеличивало относительное и абсолютное количество CD3+HLA-DR+ лимфоцитов в периферической крови пациентов и понижало уровень регуляторных лимфоцитов CD4+CD25+ в крови, по сравнению с плацебо. Ключевые слова: L -лизил-L -глутаминовая кислота, иммугенин, хроническая обструктивная болезнь легких, фенотип, лимфоциты, проточная цитофлуориметрия.
Медицинские новости. — 2014. — №12. — С. 64-66. Summary. Clinical and immunological L -lysyl-L -glutamic acid «immugenin» efficacy was estimated in a randomized single-blind placebo-controlled prospective study in parallel groups of patients treated wtth standard protocols of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Immugenin reduced the number of exacerbations and the number of acute respiratory infections and prolonged healthy period in patients with COPD. L -lysyl-L -glutamic acid administration was safe, led to relative and absolute number of CD3+ HLA-Dr lymphocytes increasing and number of CD4+CD25+ lymphocyte decreasing in peripheral blood of patients, compared with placebo.
Keywords: L -lysyl-L -glutamic acid, immugenin, chronic obstructive lung disease, phenotype, lymphocytes, flow cytometry. Meditsinskie novosti. - 2014. - N12. - P. 64-66.
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) широко распространена во всем мире (0,2-37%) и в Европе (2,1-26,1%) [3, 11]. Основным фактором этиопатогенеза хронических неспецифических заболеваний легких служит ремодуляция бронхов под воздействием внешних факторов, местный и общий иммунодефицит, приводящий к развитию ви-русно-микробной или вирусно-грибковой инфекции [2]. В норме ассоциированная с бронхами лимфоидная ткань и структуры слизистой оболочки обеспечивают защиту от инфекционных агентов. Более 50% лимфоцитов на поверхности эпителия слизистой оболочки являются Т-лимфоцитами, среди которых преобладают Т-хелперы; присутствуют нейтрофилы и макрофаги [1]. При ХОБЛ наблюдаются нарушения различных звеньев системы иммунитета, приводящие к воспалению, фиброзу и стойкой ремодуляции бронхов [12].
В развитии воспаления при ХОБЛ давно признана роль активированных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов [10]. Недавние исследования также указывают на важность адаптивного иммунного ответа с участием лимфоцитов [4, 9, 13, 14]. Миграция лейкоцитов через
эпителий усиливается при воспалении. Лимфоциты, выделяя цитокины, участвуют как в развитии и поддержании воспаления, так и в фиброзе со стойкой ремодуляцией бронхов. При ХОБЛ значительно изменены показатели регуляторных клеток [5, 7, 8]. Феномены антигенной специфичности, клональной экспансии антиген-активированных лимфоцитов и формирование иммунологической памяти лежат в основе болезни, а лечение включает как индукцию толерантности, так и манипулирование иммунорегуляторными механизмами, или направленное подавление, или активацию отдельных субпопуляций лимфоцитов [2, 6].
Одним их подходов к терапии ХОБЛ является использование иммуномодулиру-ющих средств для коррекции изменений специфического и неспецифического иммунитета. С этой целью мы применили синтетический дипептид L -лизил! -глутаминовой кислоты (иммугенин), являющийся аналогом пептидного метаболита интерферона-а2Ь, который в организме человека образуется естественным путём отщепления двух концевых аминокислот молекулы интерферона-а2Ь под действием дипептидаз.
Цель исследования - клинические испытания ампульной лекарственной формы
иммугенина, содержащей 0,01% раствор L -лизил^ -глутаминовой кислоты у лиц с ХОБЛ среднетяжелого течения и рецидивирующими бактериальными инфекциями в фазе начала ремиссии.
Материалы и методы
Лекарственное средство «иммугенин» для клинических испытаний было предоставлено Институтом физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси. Исследование выполнено по протоколу простого слепого рандомизированного контролируемого проспективного исследования в параллельных группах пациентов с плацебо-контролем на фоне стандартной терапии основного заболевания.
В период клинических испытаний было проведено первичное обследование 129 пациентов-добровольцев с диагнозом ХОБЛ. Из них по критериям включения сформирована экспериментальная группа - 40 человек. Пациенты были рандо-мизированны на две группы по 20 человек: «А» - получившие иммугенин, «В» - получившие плацебо.
Пациенты исследуемой группы получали стандартную терапию ХОБЛ, согласно действующим протоколам ведения пациентов, утвержденным Министерством здравоох-
Таблица il Сравнительная эффективность применения иммугенина и плацебо у пациентов с ХОБЛ
Группы пациентов Количество Продолжительность ремиссии
пациентов обострений ХОБЛ ОРЗ
Группа А 20 0,15±0,37В 0,25±0,91В 86,15±11,50
Группа В 20 0,4±0,88А 0,35±0,49А 77,3±26,41
П р и м е ч а н и е : А - достоверные различия с группой иммугенина, В - группой плацебо (р<0,05).
ранения Республики Беларусь, с курсом инъекций иммугенина в дозе 0,1 мл на 10 кг массы тела в сутки внутримышечно ежедневно в течение 5 дней. Пациенты контрольной группы получали стандартную терапию с введением плацебо в том же режиме.
Через 48-72 ч после начала терапии и на 7-9-е сутки от ее начала проводили общий клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, исследование функции внешнего дыхания, определение иммунного статуса (иммунограмма, в том числе фенотипирование лейкоцитов и лимфоцитов по кластерам дифферен-цировки). Через 3 месяца рассчитывали показатели первичных конечных точек: оценивали продолжительность ремиссии, частоту развития нежелательных эффектов.
Иммунологические исследования проводили с помощью проточного цито-метра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc. США). Для фенотипирования клеток крови на проточном цитометре использовали Mouse Anti-Human Life Technologies Corporation моноклональные антитела CD3 (R-PE), HLA-DR (PETR), CD4 (PE CY5.5), CD8 (PETR), CD25 (R-PE), CD19 (PECY5.5), CD23 (R-PE), лизирующий раствор OptiLyse C, Beckman Coulter. IgE на лимфоцитах определяли синтетическим пептидом, связывающим IgE, меченым FITC, синтезированным и конъюгирован-ным В.П. Мартинович и В.П. Голубович (Институт биоорганической химии НАН Беларуси) и предоставленный нам для исследований.
Достоверность различий между показателями до, во время и после лечения оценивали путем статистической обработки с использованием пакета статистических программ MS Excel, Statsoft Statistica 7 и анализа результатов исследования: методами параметрической статистики (попарными сравнениями по парному критерию t-тест Стьюдента) -для оценки результатов, подчиняющихся закону нормального распределения; методами непараметрической статистики (попарными сравнениями по критерию Вилкоксона) - для оценки результатов,
не подчиняющихся закону нормального распределения, оценки отличий в продолжительности ремиссии в группах; тестом Манна-Уитни или Ьтестом Стьюдента между показателями в независимых исследуемой и контрольной группах - при непараметрических и параметрических показателях соответственно.
Различия считали достоверными при вероятности р<0,05 и мощности метода 80%. Статистической обработке подвергались данные пациентов, полностью прошедших испытания в соответствии с протоколом.
Результаты и обсуждение
По критериям включения были отобраны 40 человек, которые были рандо-мизированы с помощью лототрона на две группы по 20 человек: «А» - получившие иммугенин, «В» - получившие плацебо.
В группе А было 15 женщин (средний возраст 50,6; от 35 до 63 лет ) и 5 мужчин (средний возраст 43,6; от 35 до 54 лет); в группе В было 8 женщин (средний возраст 48,6; от 29 до 63 лет) и 12 мужчин (средний возраст 50,25; от 37 до 62 лет). 1руппы оказались сопоставимы по возрасту (р=0,636), но имели достоверные различия по полу (р=0,025).
Введение раствора L -лизил^ -глута-миновой кислоты на фоне стандартной терапии ХОБЛ не влияло на показатели общего и биохимического анализа крови, приводило к понижению относительной плотности мочи, что косвенно указывало на повышение реабсорбции веществ почками пациентов с ХОБл. Эти наблюдения подтвердили безопасность применения L -лизил^ -глутаминовой кислоты.
Клиническая эффективность применения L -лизил^ -глутаминовой кислоты оценивалась при сравнении числа обострений и случаев ОРЗ, а также по времени до возникновения симптомов обострения ХОБЛ в группах пациентов, получавших иммугенин (А) и получавших плацебо (В). Установлено, что в течение 3-месячного срока наблюдения после завершения терапии у лиц группы А достоверно реже наблюдались обострения ХОБЛ и случаи ОРЗ (критерий Волд-Волфовица, р=0,01).
Время до возникновения обострения было большим у пациентов, получавших иммугенин, причем у большинства из них до конца периода наблюдения обострений ХОБЛ не зафиксировано (17 человек из 20) (табл. 1).
Стандартная терапия в сочетании с введением L -лизил^ -глутаминовой кислоты приводила к улучшению функции внешнего дыхания пациентов с ХОБЛ. Показатель ОФВ1 достоверно (р=0,01) увеличился у лиц1группы А: до лечения составлял 80% [72; 88] от должного, после лечения - 85% [78; 92] от должного, в отличие от пациентов группы В, у которых этот показатель не изменялся.
При попарном сравнении количества клеток с разным фенотипом в группе пациентов, получавших иммугенин, выявлены достоверные различия между относительным и абсолютным содержанием лимфоцитов, несущих СD3+HLA-DR+. На фоне иммунотерапии раствором L -лизил^ -глутаминовой кислоты на 2-3-и сутки лечения относительное и абсолютное количество СD3+HLA-DR+ лимфоцитов в 1 мкл крови были максимальными, в то время как до лечения они были минимальными (табл. 2).
Повышение относительного и абсолютного количества СD3+HLA-DR+ лимфоцитов периферической крови является позитивным иммуномоду-лирующим эффектом применения L -лизил^ -глутаминовой кислоты. Она умеренно активировала СD3+ лимфоциты, в результате чего на них усиливалась экспрессия HLA-DR молекул. Эти активированные СD3+HLA-DR+ лимфоциты эффективнее регулировали иммунный ответ, что объективно продемонстрировано снижением числа обострений ХОБЛ и случаев ОРЗ.
При сравнении исходных результатов лабораторных показателей пациентов групп А и В до введения иммугенина и плацебо (А0-В0) выявлены достоверные различия между относительным и абсолютным количеством лимфоцитов с фенотипом CD8+CD25+, в группе В0 больше (р=0,01); относительным и абсолютным количеством лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+, в группе В0 больше (р=0,003 и р=0,006); абсолютным количеством лимфоцитов с фенотипом CD19+IgE+, в группе В0 больше (р=0,01).
Представленные результаты указывают на частичную первоначальную неоднородность отдельных изучаемых показателей между группами, которую не удалось нивелировать путем рандомизации добровольцев с помощью
№12« 2014
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
Таблица 2 Влияние иммугенина на фенотип лимфоцитов пациентов с ХОБЛ
Показатели лимфоцитов Иммугенин (группа А) Плацебо (группа В)
Me [LQ-UQ] или M±SD (n = 20) Me [LQ-UQ] или M±SD (n = 20)
A0 A1 A2 B0 B1 B2
CD8+CD25+, % 0,6 [0,1-2,4]В0 1,1 [0,1-3,8] 0,4 [0,1-2,1]В2 4,1 [0,8-6,2]В2, А0 3,2 [1,5-6,2] 5,2 [1,8-8,6]В0 А2
CD8+CD25+, кл/мкл 14,0 [2,2-51,4] В0 19,9 [1,8-82,9] 7,0 [2,0-44,1]В2 68,6 [16,9-121,6]В2А0 49,6 [15,6-141,3]В2 143,8 [35,6-261,4]В0В1 А2
CD4+CD25+,% 4,7 [0,7-9,2] 2,3 [1,0-5,3]В1 2,6 [1,4-5,9]В2 7,7 [5,2-13,8] 10,8 [5,6-20,7]А1 10,3 [7,6-28,6]А2
CD4+CD25+, кл/мкл 103,2 [11,9-207,9] 42,5 [17,1-154,5]В1 56,1 [33,8-147,1]В2 138,1 [49,0-232,2]В2 156,1 [76,8-385,3] А1 236,5 [135,8- 342,0]во, А2
CD3+HLA-DR+, % 2,6 [0,5-4,7]А2, В0 10,0 [0,8-16,9] 6,5 [1,0-10,3]А0 9,7 [3,4-14,4]В1, А0 13,1 [6,1-16,6]В0, В2 9,6 [6,7-14,0]В1
CD3+HLA-DR+, кл/мкл 63,1 [10,1 —119,9]B0, А1, А2 259,0 [23,7-394,1]А0 119,1 [23,9-221,1]А0 155,0 [79,5-248,0]В1А0 272,1 [143,0-457,2]В0, А1 168,5 [116,4-293,7]А2
CD19+% 10,1±4,4 10,3±4,8 12,4±3,7 11,4±4,4 12,8±4,7 11,2±6,0
CD19+, кл/мкл 217,5 [122,9-401,5] 163,2 [116,3-214,4] 237,5 [162,1-309,8] 211,7 [174,7-262,0] 238,6 [187,2312,2] 234,1 [139,0-380,2]
CD19+CD23+, % 3,5±4,2 6,8±3,6 4,6±4,6 3,7±2,8 3,8±3,4 3,5±3,3
CD19+CD23+, кл/мкл 32,4 [0,0-176,4] 85,9 [36,0-165,3] 56,0 [21,0-140,9] 57,6 [17,1-113,4] 60,1 [8,4-122,1] 89,5 [15,2-130,4]
CD19+IgE+,% 0,6±0,6 1,0±0,9 0,4±0,2 4,1±3,8 2,7±2,8 2,3±2,1
CD19+IgE+, кл/мкл 20,2 [0,0-22,6]B0 26,2 [0,0-42,4] 11,9 [8,4-13,0] 51,8 [22,9-104,7] A0 63,9 [3,5-99,2] 44,9 [18,0-78,0]
П р и м е ч а н и е : А - достоверные различия с группой иммугенина, В - группой плацебо (р<0,05).
лототрона и карточной системы. Ввиду этого анализ и интерпретация результатов между группами А и В проводились только по показателям, не различавшимся до лечения.
При сравнении результатов лабораторных показателей пациентов групп А и В на 2-3-й день введения L -лизил-L -глу-таминовой кислоты и плацебо (А1 и В1) выявлены достоверные различия между относительным (p=0,0003) и абсолютным (р=0,001) количеством лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+, уровень которых понижался в группе А под влиянием лекарственного средства.
Популяция CD4+CD25+ лимфоцитов относится к регуляторным лимфоцитам, одна из задач которых - супрессия чрезмерного ответа клеток системы иммунитета на антигенные стимулы [4, 9, 13]. Кроме того, популяция регуляторных клеток задерживает ремоделирование бронхов [3, 7, 14]. Результаты исследования показывают, что применение L -лизил-L -глутаминовой кислоты позволяло более эффективно регулировать иммунный ответ со снижением количества лимфоцитов популяции CD4+CD25+ на 2-3-й день терапии, по сравнению с группой пациентов, получавших плацебо.
Между остальными показателями на 2-3-й день исследования достоверных различий не выявлено.
На 7-9-й день от начала введения L -лизил-L -глутаминовой кислоты и плацебо у пациентов групп А и В (А2-В2) сохранялись различия между относительными (р=0ДО4) и абсолютными (p=0,0008) значениями лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+: в группе А2 количество CD4+CD25+ лимфоцитов уменьшилось, что можно объяснить более эффективной регуляцией иммунного ответа на фоне применения иммугенина.
Выводы:
1. L -лизил-L -глутаминовая кислота (иммугенин) снижала количество обострений, число случаев ОРЗ и удлиняла период ремиссии у пациентов с ХОБЛ.
2. У пациентов, получавших имму-генин, улучшалась функция внешнего дыхания на 7-9-й день лечения.
3. Препарат увеличивал относительное и абсолютное количество CD3+HLA-DR+ лимфоцитов и уменьшал количество CD4+CD25+ лимфоцитов в крови пациентов с ХОБЛ.
4. Введение иммугенина на фоне стандартной терапии ХОБЛ в дозе 0,1 мл/10 кг массы тела в сутки, внутри-
мышечно, ежедневно в течение 5 дней было безопасным.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. НовиковД.К., Новиков П.Д. Клиническая иммунопатология. - М.: Мед. лит., 2009. - 448 с.
2. Новиков П.Д., Коневалова Н.Ю., Титова Н.Д. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2005. - №2. - С. 8-21.
3. Atsou K, Chouaid C, Hejblum G. // BMC Med. -2011. - №9. - Р.7-9.
4. Deiuliis J.A.., Kampfrath TOghumuS. et al. // Lung Cell. Mol. Physiol. - 2012. - №15. - 302(4). - Р.399-409.
5. Eppert B.L. Wortham B.W., Flury J.L. et al. // J. Immunol. - 2013. - №190(3). - Р.1331-1340.
6. Faustino L., Mucida D, Keller A.C. et al. // Clin. Dev. Immunol. - 2012. - NCBI: 721817.
7. Gadgil A, Duncan S.R. // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. - 2008. - №3(4). - Р.531-541.
8. Kearley J., Robinson D.S., Lloyd C.M. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2008. - №122(3). - Р.617-624.
9. Liu F, Liu J., Weng D., Chen Y // PLoS One. -2010. - №5(11).
10. Monaco C., Andreakos E, Kiriakidis S. et al. // Cur. Drug. Targets Inflamm. Allergy. - 2004. -№3. -Р.35-42.
11. Quint J.K., Wedzicha J.A. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2007. - №119. - Р.1065-1071.
12. Rycroft C.E, Heyes A.., Lanza L. et al. // Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. - 2012. - №7. -Р.457-494.
13. Stefano A.D, Caramori G., Gnemmi I. et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2009. - №157(2). - Р.316-324.
14. Todd N.W, Luzina I.G., Atamas S.P. // Fibrogenesis Tissue Repair. - 2012. - №5. - Р.11.
15. Venet F, Chung C.S., Huang X. // J. Immunol. -2009. - №183(5). - Р.3472-3480.
Поступила 08.04.2014 г.
