CC BY
38
Экспериментальная биология и медицина УДК 616-092.4: 577.112.34
ВЛИЯНИЕ L-АРГИНИНА НА ЭЛЕКТРОКОЖНУЮ И ТЕМПЕРАТУРНУЮ БОЛЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ У КРЫС
© Северьянова Л.А., Бобынцев И.И., Кирьянова Н.А., Долгинцев М.Е.
Кафедра патофизиологии Курского государственного медицинского университета
Внутрибрюшинное введение L-аргинина крысам-самцам Вистар за 12 минут до начала опыта в диапазоне доз от 0,05 доз 1500 мкг/кг оказывало алгическое действие на моделях электрокожного раздражения хвоста и "горячей пластины", а также вызывало усиление болевого поведения вследствие высокой чувствительности к аминокислоте супраспинальных ноцицептивных структур. Наибольшая активация супраспи-нальных механизмов формирования боли наблюдалась при введении малых доз аминокислоты (0,15 и 0,5 мкг/кг). Увеличение дозы L-аргинина, напротив, приводило к усилению его эффектов на спинальном уровне и ослаблению действия на поведение. Алгическое влияние аминокислоты было более выраженным и устойчивым при электрокожном раздражении хвоста. В основе отмеченных эффектов может быть облегчение болевой трансмиссии с вовлечением оксида азота. Ослабление же алгического действия L-аргинина могло являться следствием постепенной активации киоторфин-синтазы, обладающей меньшей аффинностью к L-аргинину.
Ключевые слова: L-аргинин, боль, электрокожное раздражение, температурное болевое воздействие, горячая пластина.
L-ARGININE EFFECTS ON THE ELECTRODERMAL AND THERMAL PAIN SENSITIVITY IN RATS
Severyanova L.A., Bobyntsev I.I., Kiryanova N.A., Dolgintsev M.E.
Pathophysiology Department of the Kursk State Medical University
Intraperitoneal administration of L-arginine to Wistar mail rats 12 min before the beginning of experiment in the doses ranging from 0.05 up to 1500 mcg/kg exerted algesic action in the electrodermal tail-flick test and "hot plate" model as well as caused the increase of pain behavior due to high sensitivity of the supraspinal nociceptive structures to the amino acid. The highest activation of the supraspinal mechanisms of pain arising was observed after administrating low amino acid doses (0.15 and 0.5 mcg/kg). On the contrary, the increase in L-arginine doses results in the enhancement of its effects on the spinal level and decrease of behavioral effects. The algesic amino acid action was the most expressed and steady in the electrodermal tail-flick model. The base of the above mentioned effects could be the relief in pain transmission due to NO production. The decrease in algesic L-arginine action could be the consequence of the delayed activation of kyotorphin syntase that possesses less affinity to L-arginine.
Key words: L-arginine, pain, electrodermal tail-flick test, thermoalgesic test, hot plate.
В предыдущие годы в результате исследования нейротропных эффектов 20 аналогов гипоталамо-гипофизарных пептидов (Ы терминальных фрагментов АКТГ, гонадотро-пин-рилизинг гормона, энкефалинов) и тафт-сина нами было установлено, что при системном введении пептиды, содержащие остаток L-аргинина, усиливали проявления страха и аффективную агрессивность при неизбе-гаемом электрическом болевом раздражении крыс и, как правило, обладали алгическим действием [1, 4, 5, 10]. Необходимым про-
должением этих исследований является изучение эффектов самой аминокислоты, тем более что работами многих исследователей последнего времени установлена ее особая роль в контроле болевой чувствительности. С использованием различных моделей боли, способов введения и доз показано, что влияние L-аргинина на болевую чувствительность связано с тем, что эта аминокислота является предшественником для синтеза оксида азота (N0), играющего роль вторичного посредника во многих эффектах, и дипептида
киоторфина, индуцирующего выделение мет-энкефалина [7]. Однако полученный материал достаточно противоречив, чтобы можно было считать решенным вопрос о механизмах нейротропных эффектов L-аргинина.
В связи с этим целью данного исследования явилось изучение влияния L-аргинина на электрокожную и температурную болевую чувствительность у крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на 220 крысах-самцах Вистар массой 180-200 г, разделенных на группы по 10 животных. Аминокислоту растворяли в физиологическом растворе и вводили подопытным животным внутри-брюшинно за 12 минут до начала опыта в дозах 0,05; 0,15; 0,5; 1,5; 5; 15; 50; 150; 450 и 1500 мкг/кг. Контрольная группа получала физиологический раствор из расчета 1 мл на кг веса.
При определении порогов электрокожной болевой чувствительности крысам на основание хвоста накладывали пластинчатые электроды и наносили раздражение электрическим током. Возникающую при этом у крыс болевую реакцию оценивали путем регистрации порогов (в тА) последовательно развивающихся поведенческих актов, отражающих уровень болевой чувствительности: напряжение хвоста и поворот головы к электродам. Наряду с этим регистрировали пороги эмоционально-аффективных реакций на боль: вращение, вокализация и грызение электродов. На каждом животном проводили 2 испытания с интервалом 1 мин в условиях свободного поведения животного в специальной камере, позволявшей экспериментатору вести наблюдение без воздействия на поведение крысы [2].
Изучение болевой чувствительности при температурном воздействии проводили путем помещения животных на пластину с ограничительным стеклянным цилиндром, нагретую до температуры 55оС. Проводили 4 пробы продолжительностью по 1 мин с интервалом в 1 мин. Болевую чувствительность оценивали по величине латентных периодов (в секун-
дах) реакции облизывания лап в 1-м и 2-м испытаниях и реакции выпрыгивания на край ограничительного цилиндра - в 3-м и 4-м испытаниях [6].
Достоверность полученных результатов определяли по парному и непарному ^кри-терию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из таблицы 1, в тесте электрокожного раздражения хвоста у крыс L-аргинин при введении во всех примененных дозах повышал болевую чувствительность и усиливал выраженность всех компонентов болевого поведения. Однако степень развития эффектов существенно зависела от использованной дозы аминокислоты. Так, при введении L-аргинина в малых дозах: 0,05; 0,15 и 0,5 мкг/кг - величины болевых порогов, определенных по реакции отдергивания хвоста (собственно болевого рефлекса), уменьшились на 12-15% (р<0,01-0,001), тогда как степень снижения порогов реакции гры-зения электродов (оборонительный ответ с компонентом агрессии) составила 14-23% (р<0,05-0,001). Увеличение доз аминокислоты до 5 и 15 мкг/кг сопровождалось значительным усилением алгического эффекта (снижение порогов боли до 25-37%) (р<0,001), превысившим степень изменения эффектов защиты и агрессии. При дальнейшем возрастании доз (50, 150 и 450 мкг/кг) степени снижения порогов боли и аффективно-оборонительного поведения были достаточно близкими. Следует отметить, что наименьшие алгический и оборонительные эффекты наблюдались при использовании пептида в наибольшей дозе (1,5 мг/кг).
При исследовании болевой чувствительности в тесте "горячая пластина" в контрольных группах латентные периоды реакции облизывания лап в 1-й пробе составлял 11,3±1,6 сек, во 2-й - 19,0±2,4 сек, латентный период реакции выпрыгивания в 3-й пробе - 12,6±2,2 сек, в 4-й - 17,1±3,3 сек. Результаты исследования эффектов L-аргинина на термоалгиче-скую чувствительность представлены на рисунках 1, 2 и 3. Как видно из представленных
Таблица 1
Величина порогов болевых реакций у крыс (в mA, М±m) в тесте электрокожного раздражения хвоста после внутрибрюшинного введения L-аргинина
Реакция Группа Напряжение хвоста Поворот головы Вокализация Вращение Грызение электродов
Контроль 0,73±0,07 0,76±0,03 1,31±0,04 1,27±0,05 1,14±0,05
L-аргинин: 0,05 мкг/кг 0,64±0,02* 0,80±0,05 1,13±0,06* 1,17±0,08 0,98±0,06*
0,15 мкг/кг 0,62±0,02* 0,75±0,03 1,13±0,05* 1,13±0,06 0,92±0,05*
0,5 мкг/кг 0,62±0,02* 0,74±0,02 1,13±0,04* 1,16±0,04 0,88±0,03*
1,5 мкг/кг 0,61±0,03* 0,84±0,06 1,22±0,06 1,22±0,06 1,10±0,07
5 мкг/кг 0,55±0,04* 0,68±0,06 1,02±0,07* 1,09±0,06* 0,99±0,05*
15 мкг/кг 0,47±0,02* 0,65±0,03* 1,09±0,04* 1,10±0,03* 0,92±0,03*
50 мкг/кг 0,62±0,03* 0,73±0,04 1,01±0,05* 1,02±0,07* 0,88±0,05*
150 мкг/кг 0,62±0,02* 0,62±0,02* 1,18±0,8 1,29±0,05 1,07±0,05
450 мкг/кг 0,57±0,02* 0,74±0,04 1,22±0,06 1,24±0,06 0,89±0,05*
1500 мкг/кг 0,66±0,05 0,78±0,06 1,13±0,06* 1,16±0,05 1,13±0,05
Примечание: * - р < 0,05-0,001 в сравнении с показателями контрольной группы.
данных, после введения L-аргинина во всех дозах, кроме 15 мкг/кг в 1-й пробе с реакцией облизывания лап и 5 мкг/кг - во 2-й, в сравнении с контрольными результатами наблюдалось уменьшение латентных периодов болевой реакции, которое было статистически достоверным при использовании доз 0,5; 50;
150 и 450 мкг/кг (рис. 1). Эти результаты позволяют сделать заключение о термоалгиче-ском эффекте L-аргинина при системном введении.
Что же касается динамики изменения болевой температурной чувствительности, оцениваемой по реакции облизывания лап
%
20 10 0 -10
50 150 450 1500 мкг/кг
Рис. 1. Изменение порогов болевой реакции облизывания лап у крыс в тесте "горячая пластина". Столбики: изменение порогов реакции в 1-й (светлые) и во 2-й (темные) пробах в процентах по отношению к их величинам в контрольных условиях (шкала слева). * - р < 0,05-0,01 по сравнению с контрольной группой.
%
Рис. 2. Изменение порогов болевой реакции выпрыгивания у крыс в тесте "горячая пластина". Столбики: изменение порогов реакции в 3-й (светлые) и во 4-й (темные) пробах в процентах по отношению к их величинам в контрольных условиях (шкала слева). * - р < 0,05-0,01 по сравнению с контрольной группой.
при сопоставлении результатов 1-й и 2-й проб у одних и тех же животных (рис. 3), то она характеризуется снижением термоалги-ческой чувствительности, достигающим уровня статистической значимости при введении аминокислоты в дозах 0,15; 0,5; 5,0; 15 и 1500 мкг/кг. Этот эффект оказался еще более выраженным при 3-м испытании (рис. 2): ла-тентные периоды реакции "выпрыгивания" как проявления аффективно-эмоционального болевого поведения увеличивались по сравнению с показателями у контрольных животных на 96-126% и достигали уровня статистической достоверности при подавляющем большинстве доз. Однако при 4-м испытании у подопытных крыс не удалось выявить устойчивых и однонаправленных эффектов в сравнении с контрольными показателями. При сопоставлении же латентных периодов реакции избегания в 3-й и 4-ой пробах для одних и тех же групп животных (рис. 3) обнаруживается преобладающее снижение показателей, что свидетельствует об активации болевого поведения.
Следует отметить, что проявления болевого поведения могут зависеть от состояния общей двигательной активности животных. Ранее нами было исследовано влияние малых
доз L-аргинина при внутрибрюшинном введении на вертикальный компонент ориентировочной активности, груминг и эмоциональность на модели "открытого поля". Установлено, что под влиянием L-аргинина происходило усиление вертикальной активности и эмоциональности, достигавшие статистически достоверных различий при дозе аминокислоты 15 мкг/кг (соответственно на 125% и 175%, p<0,05).
Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что L-аргинин при системном введении в указанном диапазоне доз оказывал алгическое действие в обеих исследованных моделях болевой чувствительности - электрокожной и температурной, а также вызывал существенные изменения болевого поведения. Необходимо отметить, что алгический эффект аминокислоты был более выраженным и устойчивым у крыс в тесте "отдергивания хвоста" при электрокожном раздражении.
При анализе механизмов установленных эффектов возможно следующее их объяснение, причем необходимо особо подчеркнуть, что применение нами в целом низких доз аминокислоты позволяет считать возникающие у крыс изменения ее уровня и эффекты
Рис. 3. Динамика изменения болевых реакций в подопытных группах животных. Столбики: светлые - изменение латентного периода реакции облизывания лап во 2-й пробе в % по отношению к 1-й, темные - изменение латентного периода реакции выпрыгивания лап в 4-й пробе в % по отношению к 3-й. * - р < 0,05-0,01
близкими к физиологическим, а не к фармакологическим характеристикам [3]. Так, в тесте с электрокожным раздражением хвоста мы имели возможность оценить действие L-аргинина на спинальном уровне (отдергивание хвоста - болевой спинальный рефлекс) и супраспинальном, обеспечивающем развитие поведенческой реакции в ответ на боль. Как показали полученные нами результаты, супраспинальные интегративные механизмы оказались более чувствительными к действию L-аргинина, поскольку при использовании очень малых доз (0,15 и 0,5 мкг/кг) степень снижения порогов реакции "грызения электродов" превосходила степень повышения собственно болевой чувствительности. С увеличением же дозы становятся более выраженными эффекты L-аргинина на спинальном уровне. Основой этих эффектов может быть облегчение болевой трансмиссии с вовлечением оксида азота, образование которого из L-аргинина сопряжено с активацией NMDA-рецепторов глютаматом [9]. Усиление этого механизма может быть вызвано увеличением вводимой дозы аминокислоты. Ослабление же алгического действия L-аргинина при дальнейшем повышении доз может быть связано с постепенной активаци-
ей киоторфин-синтазы, обладающей, как известно, меньшей аффинностью к L-аргинину и вовлекаемой при более высоких дозах [7].
Что касается термоалгических эффектов при системном введении L-аргинина, то их неоднозначность, возможно, обусловлена большей сложностью теста "горячей пластины", в котором ответы крыс во всех пробах представляют собой поведенческие реакции, формирующиеся в результате тесного взаимодействия спинальных и супраспинальных механизмов. Обращает на себя внимание кратковременный анальгетический эффект в 3-м испытании с уменьшением латентных периодов поведения в 4-м. Возможно, отставле-ние начала избегания в 3-й пробе обусловлено, по крайней мере, отчасти, ослаблением ориентировочной активности после ее кратковременного усиления под влиянием L-аргинина. Ускорение же поведения избегания в 4-й пробе могло включать в какой-то мере эффект обучения, который усиливается L-аргинином. Имеющиеся в литературе данные об улучшении под действием аминокислоты памяти, сниженной неблагоприятным воздействием [12], а также об улучшении обучения [11], могут быть основанием для подобного заключения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бобынцев И.И., Северьянова Л.А., Ляшев Ю.Д. Нейротропные эффекты аналога люлиберина у крыс с различной чувствительностью к этанолу // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1991. - Т. 112, № 12. - С. 612-615.
2. Диапазон возможного практического применения люлиберина как нейротропного пептида / С.М. Тихомиров, С.В. Николаев, В.Д. Ба-харев, Р.Н. Крымкевич // Пробл. эндокринол.-1988. - Т. 34, № 4. - С. 54-56.
3. Количественный анализ аминокислот в сыворотке крови методом изократической обра-щенно-фазовой ВЭЖХ / И.Н. Краснова, Ю.В. Черкас, Т.В. Денисенко, Л.А. Карцова // Клиническая лабораторная диагностика. -1999. - № 7. - С. 11-14.
4. Нейропептиды: механизмы влияния на инте-гративную деятельность мозга / Северьянова Л.А., Бобынцев И.И., Ляшев Ю.Д., Плотников Д.В. // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -1995. - Т. 81, № 8. - С. 158-161.
5. Северьянова Л.А. Влияние адаптивных гормонов на интегративную деятельность мозга. - М.: Наука, 1988. - 124 с.
6. Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии. М., 2000. - 352 с.
7. Kawabata A., Umeda N., Takagi H. L-arginine exerts a dual role in nociceptive processing in the brain: involvement of the kyotorphin-met-enkephalin pathway and NO-cyclic GMP pathway // Br. J. Pharmacol. - 1993. - V. 109, № 1. -P. 73-79.
8. Khavandgar S., Homayoun H., Larrindast M.R. The effect of L-NAME and L-arginine on impairment of memory formation and state-dependent learning induced by morphine in mice // Psychopharmacology. - 2003. - V. 167, № 3. - P. 291-296.
9. Meller S.T., Gebhart G.F. NO and nociceptive processing in the spinal cord // Pain. - 1993. -V. 52, № 1. - P. 127-136.
10. Nitric oxide synthesis in the brain mediates neu-ropeptide effects on pain sensitivity and pain-induced aggression / Severyanova L.A., Bobynt-sev I.I., Plotnikov D.V., Lyashev Yu.D. // Analgesia. - 2001.- Vol. 5, № 3/4. - P. 223-227.
11. Plech A., Klimkiewicz T., Maksym B. Effect of L-arginine on memory in rats // Pol. J. Pharmacol. - 2003. - V. 55, № 6. - P. 987-992.
12. Paul V., Reddy L., Ekambaram P. Prevention of picrotoxin convulsions-induced learning and memory impairment by nitric oxide increasing dose of L-arginine in rats // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2003. - V. 75, № 2. - P. 329-334.
