CC BY
56
Таблица 2
Результаты показателей неспецифической резистентности у животных при аспленизации (медиана, квартили)
Группы Сутки ЦИК ФИ (%) ФЧ НСТсп, (%) НСТинд. (%)
СЭ 2 б* (3-14) б 4 * ) 1,8 (1,7-2,0) 0,5* (0-1,0) 1,0* (1,0-2,0)
5 4* (2-б) б3* (б0-75) 2,0 (1,9-2,1) 0,5* (0-1,0) 3,5* (2,0-4,0)
7 72*- (5б-77) 40* (40-42) 1,4 *■ (1,3-1,5) 0,5* (0-1,0) 0,5*- (0-1,0)
Норма 22 (12-22) 53 (53-54) 1,9 (1,9-1,9) ,0) О, LO (4 15,0 (14,0-1б,0)
Примечания: *- значимые различия по критерию Даннета по сравнению с нормальным показателем (рБ£0,05); — значимые различия по критерию Вилкоксона по сравнению с предыдущим показателем (pW£0,05).
животных. Забор анализов выполняли на 2-е, 5-е и 7-е сутки послеоперационного периода. За норму приняты показатели, полученные у 6 здоровых животных.
Результаты исследования
Для оценки воспалительной реакции организма на аспленизацию контролировали количество лейкоцитов и форменных элементов в венозной крови (табл. 1).
Отмечено, что уровень лейкоцитов в крови экспериментальных животных на 2-е сутки был существенно повышенным по сравнению с нормой (рБ<0,006). А на 7-е сутки исследования закономерно сохранялся лейкоцитоз, при этом уровень лейкоцитов был максимальным (рБ<0,004; pW<0,006).
При анализе лейкоцитарной формулы в мазке крови отмечено несущественное возрастание количества сегментоядерных нейтрофилов и снижение лимфоци-
тов на 2-е сутки. Изменения лейкоцитарной формулы в наибольшей степени происходили на 7-е сутки послеоперационного периода. А также отмечалось относительное увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов, статистически значимо отличающееся от нормы. Описанные сдвиги лейкоцитарной формулы сопровождались синхронным увеличением удельного веса моноцитов в формуле крови.
Далее рассмотрим результаты исследования неспецифической резистентности организма, показатели фагоцитоза, представленные в таблице 2.
Отметим, что на вторые сутки исследования процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, достоверно возрастал. В свою очередь фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов существенно снижалась на 7-е сутки эксперимента по сравнению с нормой.
При исследовании величины спонтанного и индуцированного НСТ-теста на вторые и пятые сутки нами выявлено существенное снижение показателей, по сравнению с нормой (рБё0,0001).
При оценке величины спонтанного НСТ-теста на 7-е сутки выявлена существенная депрессия по сравнению с нормой. Реакция индуцированного НСТ-теста на 7-е сутки выявила существенное снижение этого показателя у всех спленэктомированных животных
Для оценки функции фагоцитарной системы нами были исследованы уровни циркулирующих иммунных комплексов. Результаты динамической оценки ЦИК представлены в таблице 2.
Следует отметить, что при оценке количества ЦИК на 5-е сутки отмечалась выраженная депрессия (рБ£0,05; ри£0,0001).
Установлено, что аспленизация животных приводит к выраженным изменениям выбранных показателей к 7-м суткам, с развитием иммунодефицита, что проявляется депрессией фагоцитоза и неспецифической резистентности организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Матинян Н.С. Аутотрансплантация размельченной селезеночной пульпы в эксперименте (экспериментальное исследование): Автореф. ... канд. мед. наук. — М., 1986. — 22 с.
2. Павлова И.Е. Особенности функционирования иммунной системы после спленэктомии у пациентов с заболеваниями системы крови и травмами селезенки: Автореф. . док. мед. наук. — С-Пб., 2007. — 42 с.
3. Сорокин А.П., Полянкин Н.Я., ФедонюкЯ.И. Клиническая морфология селезенки. — М.: Медицина, 1989. — 160с.
4. Acea Nebril B. Acute abdomen caused by thrombosis of the portal and superiror mesenterie veins in a splenectomized hematologic patient / B. Acea Nebril, M. Marini Dhaz, J. Fraguela Marica [ et al.] // Gastroenterol hepatol. — 1997. — Vol. 20. — № 6. — P. 299-302.
5. Buntain W.L., Lynn H.B. Splenorraphy: changing concepts for the traumatized spleen // Surgerry. — 1979. — Vol. 86. — № 5. — P. 748-760.
6. Dujmovic F. Post-traumatic asplenia and splenosis // Med Pregl. — 1993. — Vol. 46. — № 7-8. — P. 264-267.
Адрес для переписки: 664079 Иркутск, Юбилейный, 100, а/я 23.
Александр Германович Каргин — аспирант НЦРВХ СО РАМН;
Татьяна Аркадьевна Рой — м.н.с. ОЭХ НЦРВХ СО РАМН, тел. 89021771894;
Константин Анатольевич Апарцин — д.м.н., профессор НЦРВХ СО РАМН;
Лариса Васильевна Зарицкая — к.б.н., зав. лабораторным отделом ЦНИЛ ИГИУВ Ольга Николаевна Постовая — м.н.с. лабораторного отдела ЦНИЛ ИГИУВ;
Елена Владимировна Батунова — м.н.с. лабораторного отдела ЦНИЛ ИГИУВ;
Светлана Александровна Лепехова — к.б.н., заведующая ОЭХ НЦРВХ СО РАМН, [email protected] 407-666; Максим Владимирович Прокопьев, Сергей Евгеньевич Григорьев, Артем Геннадьевич Кувшинов
© ЛЕПЕХОВА С.А., АПАРЦИН К.А., ЗАРИЦКАЯ Л.В., ПОСТОВАЯ О.Н., БАТУНОВА Е.В., ПРОКОПЬЕВ М.В., КАРГИН А.Г., РОЙ Т.А., КОВАЛЬ Е.В. — 2009
ВЛИЯНИЕ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ НА ИЗМЕНЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА ПРИ ОСТРОМ ТОКСИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ
С.А. Лепехова, К.А. Апарцин, Л.В. Зарицкая, О.Н. Постовая, Е.В. Батунова,
М.В. Прокопьев, А.Г. Каргин, Т.А. Рой, Е.В. Коваль (Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН, директор — член-корр. РАМН, д.м.н., проф. Е.Г. Григорьев; Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, ЦНИЛ, зав. — к.м.н., доц. А.В. Стародубцев)
Резюме. Нами были проанализированы показатели неспецифической реакции организма на токсическое повреждение печени при коррекции ксенотрансплантацией культуры эмбриональных криоконсервированных кле-
ток печени свиньи. Исследование проводилось на 100 крысах породы «Вистар». Показатели контролировали на протяжении 2-х, 4-х и 6-х суток. Установлено ограничение системной воспалительной реакции, сохранность неспецифической резистентности и отсутствие сенсибилизации при остром токсическом повреждении печени под воздействием ксенотрансплантации ККП.
Ключевые слова: острая печеночная недостаточность, ксеногепатоциты, трансплантация, неспецифическая резистентность.
THE INFLUENCE OF XENOTRANSPLANTATION OF CULTURES OF CELLS OF A LIVER ON CHANGES IN NON-SPECIFIC RESISTENCE OF AN ORGANISM IN ACUTE TOXIC DAMADGE OF LIVER
S.A. Lepekhova, K.A. Aparcin, L.V. Zaritskaya, O.N. Postovaya, E.V Batunova,
M.V. Prokopiev, A.G. Kargin, T.A. Roy, E.V. Koval (Center for Reconstructive Surgery, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences;
Irkutsk State Institute for Medical Advanced Studies, Russia)
Summary. We had analysed parameters of nonspecific reaction of organism on toxic damage of a liver in correction with xenotransplantation of culture of embryonal cryoconservation cells of liver of pig (CCL). Research was spent on 100 rats of breed «Vistar». Parameters were checked during 2, 4 and 6 day. It has been established the restriction of systemic inflammatory reaction, safety of nonspecific resistance and absence of a sensitization at acute toxic damage of a liver under influence of xenotransplantation CCL.
Key words: xenotransplantation, cells of liver, toxic damage.
Проблема лечения острой печеночной недостаточности до сих пор остается нерешенной. Летальность при данной патологии остается очень высокой, достигая 60-100% [8].
Низкая эффективность лечения во многом связана с отсутствием эффективной патогенетически обоснованной терапии этого драматического состояния. Одной из основных задач лечения острой печеночной недостаточности является поддержание печени в течение критического периода времени [1,11]. Такой подход обусловлен значительными компенсаторными возможностями печени для восстановления своих утраченных важных функций.
Неудовлетворительные результаты лечения больных с острой печеночной недостаточностью с использованием традиционных методов лечения диктуют необходимость поиска новых. По мнению многих исследователей, наиболее перспективным направлением в лечении печеночной недостаточности является использование «клеточной терапии», включающей изолированные ксено- или аллогепатоциты [9,10]. В настоящее время механизм действия клеток печени, применяемых для коррекции печеночной недостаточности, нельзя считать выясненным окончательно.
Ряд авторов полагают, что лечебный эффект в основном связан с органозамещающей функцией [7].
Однако, известно, что трансплантированные изолированные гепатоциты не столько увеличивают функционирующую массу печени, сколько изменяют гуморальные и молекулярные механизмы, отвечающие за активацию функций оставшихся гепато-цитов реципиента и регенерацию, путем выработки регуляторных пептидов, среди которых ведущая роль принадлежит факторам роста [4,5].
Для оценки эффективности ксенотран-сплантации культуры клеток печени при токсическом повреждении печени нами было проведено исследование системной воспалительной реакции организма при ксе-нотрансплантации культуры клеток печени.
Целью настоящего исследования является оценка неспецифической резистентности организма у экспериментальных животных с модулированной острой печеночной недостаточностью, вызванной токсическим повреждением печени, под влиянием ксе-нотрансплантации культуры криоконсер-вированных клеток печени.
Материалы и методы
Работа выполнена на базе научного отдела экспериментальной хирургии с виварием Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии НЦ РВХ СО РАМН совместно с лабораторным отделом Центральной научно-исследовательской лаборатории Иркутского государственного института усовершенствования врачей.
Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище соответственно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, вет. удостоверение №18-005304 от 27 октября 2004 г, администрация Иркутской области, управление ветеринарии). В эксперимент включали крыс-самцов породы Вистар в возрасте не менее 6 месяцев, весом 200-250г. Опыты на животных выполнялись в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.85 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».
У всех экспериментальных крысмоделировали острое токсическое повреждение печени. Моделирование ОТП печени выполняли путем подкожного введения ЧХУ чистого для анализов (ЧДА) из расчета 0,5 мг\100г массы животного по А. Фишеру (1961) [6].
Через сутки после индукции острого токсического повреждения печени животных относили к экспери-
Таблица 1
Характеристика экспериментальных групп
Распределение животных на группы и методы исследования в первой серии экспериментов
№ п/п Характер воздействия Кол-во животных Методы исследования
1.1 Подкожная инъекция 2х106 криоконсервированной ККП в 1 мл взвеси 20 ОАК, иммунологические тесты
1.2 Подкожная инъекция 2х106 криоконсервированных НГ в 1 мл взвеси 20
1.3 Подкожная инъекция 1 мл физиологического раствора 20
1.4 Подкожная инъекция 0,5 мл гептрала 20
1.5 Подкожная инъекция 1 мл питательной среды 20
Всего: 100
Рис. 1. Динамика количества лейкоцитов (х109) и форменных элементов (%) крови животных: лейкоциты (А), сегментоядерные нейтрофилы (Б), моноциты (В), лимфоциты (Г).
ментальным группам методом случайного распределения, таким образом, в исследование вводили животных с индуцированной ОПН. Отправной точкой эксперимента было введение крысам препарата, определяющего в дальнейшем их групповую принадлежность. Проведено исследование иммунологических тестов под влиянием ксе-нотрансплантации криоконсервированной культуры эмбриональных клеток свиной печени (КТ ККП) (1.1), ксенотранспланта-ции криоконсервированных неонатальных гепатоцитов (КТ НГ) (1.2), после введения физиологического раствора (1.3), лекарственного препарата гептрал (1.4) и питательной среды для культивирования клеток печени (1.5).
Распределение животных на группы в зависимости от характера воздействия представлено в табл. 1.
Клетки печени получали по оригинальной методике (ферментативно-механический способ дезагрегации). Суспензию клеток в концентрации 2х106 в 1 мл вводили иньекци-онно в подкожно-жировую клетчатку передней брюшной стенки через сутки после введения четыреххлористого углерода.
Для определения параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови использовали убитые при 80-900С, клетки дрожжей 8ассЬагошусез сегеу1з1ае. Оценивали фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность
или ФИ) — процент фагоцитов из числа сосчитанных нейтрофилов, и ФЧ — среднее число дрожжей, поглощенных одним нейтрофилом [2, 4].
Для оценки степени антигенной раздраженности не активированных in vitro гранулоцитов крови исследова-Таблица 2 ли спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), выражая результаты в процентах. Активированный НСТ-тест (%) определяли для оценки функционального резерва кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.
Подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу крови по общепринятым методикам [3] Выбранные показатели оценивали на 2, 4 и 6 сутки исследования. За норму приняты показатели, полученные у 6 здоровых животных.
Результаты и обсуждения
Для оценки воспалительной реакции организма при ксено-трансплантации ККП в условиях ОТП проведен анализ количества лейкоцитов и форменных элементов в венозной крови (рис.1).
Острое токсическое повреждение печени во всех экспериментальных группах сопровождалось лейкоцитозом на 2-е сутки исследования, при этом уровень лейкоцитов в основной группе (1.1) был значимо выше, чем в контрольной группе 1.2 и норме (рЫ-К=0,05; рБ=0,01). К четвертым суткам количество лейкоцитов в основной группе 1.1 существенно уменьшалось (pW=0,006), а в контроле 1.3-1.5 происходило статистически значимое увеличение. Изменения лейкоцитарной формулы у жи-
Результаты сравнительного анализа показателей фагоцитоза, в условиях корригированного ОТП (медиана, квартили)
Сутки Экспериментальные группы
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5
2 б3(б2-б7) б8(б3-70) 70(б8-72) 70(б1-75) б9(б4-79)
ФИ 4 б9*0(б5-72) 71*0(б9-75) 56*-N(52-58) 700(б7-75) 57N(54-65)
(%) б б1(59-70) 61N(59-63) - 59N(56-60) -
Норма б1 (59-б5)
2 1,9(1,9-2,0) 1,8(1,8-1,9) 2,0(2,0-2,1) 2,0(2,0-2,1) 2,1(2,1-2,2)
ФЧ 4 2,Ш»(2,1-2,1) 1,б*-»(1,в-1,7) 1,7*-.(1,б-1,8) 1,90(1,9-2,0) 2,00(1,8-2,0)
б 2,0(1,9-2,1) 2,0о(1,9-2,0) - 1,6*-N0(1,6-1,6) -
Норма 2 (1,9-2,1)
2 100N(8-12) 0*0-(0-1) 18*-N(18-20) 1*0-(0-1) 110N(9-19)
НСТсп, 4 mN(10-15) 2*0^ (1-2) 5*-N»(4-6) 1*0-(1-2) б - N(5-10)
(%) б 14*N(12-18) 9-о(7-10) - 0*-N(0-0) -
Норма 11 (8-12)
2 150N(12-17) 0*0-(0-2) 22*-N(21-24) 3*0-(2-б) 160N(10-22)
НСТинд. 4 140N(10-19) 3*0-(3-4) 4*-(4-б) 2*-(1-4) 4*-.(3-9)
(%) б 24*N0(16-25) 10-0(10-12) - 0*-N(0-0) -
Норма 14 (8-1б)
2 41*0N(34-56) б*0-(3-9) 28-N(25-30) 10-(5-17) 17-N(1-30)
ЦИК 4 250N(22-36) 38*0-»(3б-4б) бб*^»^^) 70-N(2-16) 122*0-N® (97-145)
б 22(22-24) 23о(22-37) - 5-N(3-11) -
Норма 22 (17-24)
Примечания: * — значимые различия по критерию Даннета в сравнении с нормальным показателем (рБ£0,05); ◊ — значимые различия по критерию Ньюмана-Кейлса по сравнению с 1.3 (рК-К£0,05); ■ — значимые различия по критерию Манна-Уитни по сравнению с группой 1.1(ри£0,05); ё значимые различия по критерию Манна-Уитни по сравнению с группой 1.2 (ри£0,05); • — значимые различия по критерию Вилкоксона по сравнению с показателем в той же группе на 2-4-е сутки (pw£0,05); о — значимые различия по критерию Вилкоксона по сравнению с показателем в той же группе на 4-6-е сутки (pW£0,05).
Рис. 2. Динамика показателей фагоцитарной активности клеток: ФЧ, шт. (А), НСТспонт, % (Б) в крови животных.
вотных экспериментальных групп в наибольшей степени происходили на 2-4-е сутки исследования. В основной группе 1.1 сдвиг лейкоцитарной формулы вправо, отмеченный на 2-е сутки, исчезает к 6-м суткам исследования.
Таким образом, ксенотрансплантация ККП не только не сопровождается увеличением воспалительной реакции, но и приводит к уменьшению воспалительного ответа, вызванного ОТП.
Результаты сравнительного анализа показателей фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов представлены в табл.2. и на рис. 2.
На 2-е сутки исследования значимых изменений показателей фагоцитоза не было. На 4-е сутки отмеча-
ется повышение ФИ и ФЧ в основной группе, по сравнению с нормой и контролем (рБ=0,04; рЫ-К=0,009; ри=0,006)
с последующей нормализацией. Отметим, что в основной группе снижения функциональной активности фагоцитов (НСТсп. и НСТинд.) не выявлено на протяжении всего эксперимента (рБ<0,05).
Для оценки аллергической реакции 3-го типа и функции фагоцитарной системы нами были оценены уровни циркулирующих иммунных комплексов. На 2-е сутки выявлено существенное повышение количества ЦИК в крови животных основной группы 1.1 по сравнению с нормой и контролем (рБ=0,0001; рЫ-К=0,006; ри<0,0002). Однако уже на 4-е сутки этот показатель нормализовался в основной 1.1 и контрольной 1.2 группах (рБ<0,05) и был существенно ниже, чем в контрольных группах 1.3, 1.5 (ри<0,0001).
Таким образом, установлено ограничение системной воспалительной реакции, сохранность неспецифической резистентности и отсутствие сенсибилизации при ОТП под воздействием ксенотрансплантации ККП.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бруслик В.Г., Островерхов Г.Е., Шиманко И.И. Трансплантация изолированных клеток печени в лечении острой печеночной недостаточности // Успехи гепатологии. — Тбилиси. — 1982. — С. 40.
2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля. — Пер. с нем. — М.: Медицина. — 1987. — 472 с.
3. Луговская С.А., Морозова В. Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Лабораторная гематология. — М., 2002. — 120 с.
4. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследований: Пер. с англ. — М.: Мир, 1988. — 530 с.
5. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. — М.: Медицина, 2000. — 544 с.
6. Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. — Будапешт, 19б1. — 230 с.
7. Liu K.X., Kato Y., Matsumoto K., et. al. Characterization of the enhancing effect of protamine on the proliferative activity of
hepatocyte growth factor in rat hepatocytes /Pharm Res. — 2009. — Vol. 26, №4. — P. 1012-1021.
8. Makowka L., Lee G., Cobourn C.S. Allogenic hepatocyte transplantationintheratspleenundercyclosporineimmunosupression// Transplantation. — 1986. — Vol.5. — P. 537-541.
9. Makowka L., Rostein L.E., Falk R.E. Cellular trasplantation in the treatment of experimental hepatic failure // Science. — 1980. — Vol. — 210. — P. 901-903.
10. ShimizuM., Takakuwa Y.,NittaS., et al. Study of stimulation-secretion coupling in a flow culture system: periodic secretion of hepatocyte growth factor by interleukin-1 alpha-stimulated human embryonic lung fibroblasts/ Biochim. Biophys. Acta. — 2001. — Vol.1244, №2-3. — P357-362.
11. Wolf H.K., Michalopoulos G.K. Hepatocyte regeneration in acute fulminant and subfulminant hepatitis: a study ofproliferating cell nuclear antigen expression // Hepatology. — 1992. — Vol.15. — P. 707-713.
Адрес для переписки: 664079 Иркутск, Юбилейный, 100, а/я 23, Светлана Александровна Лепехова — к.б.н., заведующая ОЭХ НЦРВХ СО РАМН. E-mail: lepekhova [email protected] 407-666.
© ЧЕРТОВСКИХ М.Н., ФЛОРЕНСОВА Е.В., КУЛИНИЧ С.И. — 2009
ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ УЛУЧШЕНИЯ ДИАГНОСТИКИ ТРУБНОЙ БЕРЕМЕННОСТИ В ПЛАНЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ОРГАНОСОХРАНЯЮЩИХ ОПЕРАЦИЙ
М.Н. Чертовских, Е.В. Флоренсова, С.И. Кулинич (Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра акушерства и гинекологии, зав. — д.м.н., проф. С.И. Кулинич)
Резюме. Ретроспективный анализ 710 историй болезни прооперированных по поводу трубной беременности показал, что обнаружение плодного яйца на догоспитальном этапе до появления признаков прерывания возможно в 96% наблюдений. На ранних стадиях развития (4-6 недель), находящееся в трубе эктопическое плодное яйцо, имеет эхографические признаки, значительно отличающиеся от таковых при маточной беременности. Отсутствие при этом глубоких морфологических изменений трубы, вызванных инвазией трофобласта, позволяют успешно реализовывать органосохраняющие операции. Высокочувствительным и специфичным методом диагностики пер-систенции трофобласта в раннем послеоперационном периоде является ЦДК с импульсной допплерометрией.
Ключевые слова: эктопическая беременность, персистенция трофобласта.
