CC BY
68
УДК 616.155.392.8-08:542.978
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИМАТИНИБА В ПЛАЗМЕ НА ДОСТИЖЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ РЕМИССИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ
Сергей Иванович Куцев1, Оксана Станиславовна Оксенюк2,
Мария Владимировна Вельченко3
‘Лаборатория медицинской генетики (зав. — доц. С.И. Куцев), 2кафедра гематологии и трансфузиологии с курсом лабораторной диагностики (зав. — проф. Ю.В. Шатохин), 3 курс медицинской генетики (зав. — доц. С.И. Куцев) Ростовского государственного медицинского университета, e-mail: kutsev@mail.ru
Реферат
Изучена взаимосвязь между концентрацией има-тиниба в плазме крови и формированием молекулярной ремиссии у 49 пациентов с хроническим миелолей-козом при монотерапии иматинибом в дозе 400 мг/сут. Сш1я иматиниба в группе пациентов с молекулярной ремиссией составила 1729,2 ± 215,0 нг/мл, без молекулярной ремиссии - 962,1 ± 77,2 нг/мл (р=0,0007). Обнаружена корреляция (г=-0,4) между С иматиниба и уровнем экспрессии гена БСК-ЛБЬ. При низком уровне иматиниба в плазме крови рекомендовано повышение суточной дозы препарата с целью достижения молекулярной ремиссии.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, има-тиниб, экспрессия гена БСК-ЛБЬ.
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) — клональное миелопролиферативное заболевание, в основе патогенеза которого лежит появление специфической транслокации 1(9;22)(ч34^11) в стволовых по-липотентных гемопоэтических клетках. В результате этой генетической аберрации образуется хромосома 22 с укороченным длинным плечом, названная филадельфийской (РИ-хромосома) [19].
На молекулярном уровне транслокация 1(9;22Хч34^11) сопровождается образованием химерного гена БСК-АБЬ. На момент верификации диагноза ХМЛ цитогенетическим методом в 95-100% клеток костного мозга обнаруживается РИ-хро-мосома [19], а молекулярно-генетическим методом — высокая экспрессия химерного гена БСК-ЛБЬ в клетках крови и костного мозга [1, 2, 8]. Белок БСК-АБЬ, образующийся в результате транскрипции и трансляции гена БСК-ЛБЬ, является тиро-зинкиназой с повышенной активностью, которая реализуется в значительном увеличении пролиферативной активности, угнетении апоптоза и уменьшении адгезивных свойств лейкозных клеток при ХМЛ [4].
Понимание патогенеза ХМЛ легло в основу разработки целенаправленной терапии, основанной на использовании специфических ингибиторов тирозинкиназ. Создание препарата иматиниба мезилата (иматиниба) представляет большой успех в области целенаправленной противоопухолевой терапии и революционный прорыв в лечении ХМЛ. Международное рандомизированное исследование IRIS, в котором сравнивались безопасность и эффективность интерферона и иматиниба для лечения ХМЛ, показало безусловное превосходство иматиниба [9, 12, 13, 15]. К 7 годам наблюдения общая выживаемость пациентов, получающих иматиниб, составила 86% [16].
Критериями эффективности терапии ХМЛ иматинибом и другими, появившимися в последние несколько лет ингибиторами тирозинкиназ являются достижение полного цитогенетического ответа (отсутствие Ph-положительных клеток в костном мозге) к 12 месяцам непрерывной терапии и достижение большого молекулярного ответа к 18 месяцам терапии (снижение уровня экспрессии BCR-ABL транскрипта в клетках крови более чем на 3 log по сравнению с базовым уровнем) [5]. Снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках крови, как и уменьшение количества Ph-положительных клеток в костном мозге отражают редукцию клона опухолевых клеток.
Несмотря на значительные успехи таргетной терапии ХМЛ иматинибом, к 7 годам наблюдения в клиническом исследовании IRIS у 18% пациентов не достигалось полного цитогенетического и тем более большого молекулярного ответа, а у 17% пациентов полученный цитогенетический ответ был потерян на фоне
339
непрерывной терапии иматинибом [16]. В основе резистентности к иматинибу могут лежать различные механизмы: амплификация и повышенная экспрессия гена BCR-ABL, мутации гена BCR-ABL, появление дополнительных хромосомных аберраций, избыточное связывание иматиниба с транспортными белками крови (например, сывороточным альфа-
1-кислым гликопротеином), экспрессия белка множественной лекарственной резистентности Pgp [11].
По мнению ряда исследователей [14, 18], проблема достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию ХМЛ иматинибом у некоторых пациентов лежит в области индивидуальных особенностей фармакокинетики препарата. Так, например, S. Picard et al. [18] ообнаружили, что среднее значение минимальной концентрации иматиниба в плазме крови (C ) у пациентов, получавших 400-600 мг препарата в сутки и достигших большого молекулярного ответа, значительно выше, чем в группе пациентов без большого молекулярного ответа. Напротив, D. L. Forrest et al. [10] не обнаружили корреляции между достижением большого молекулярного ответа и показателем C . иматиниба в плазме у па-
min J
циентов с ХМЛ, получавших 400-600 мг препарата. Однако исследования S. Picard et al. [18] и D. L. Forrest et al. [10] были выполнены на гетерогенных небольших группах пациентов с ХМЛ в хронической фазе или в фазе акселерации, получавших 400 или 600 мг иматиниба в сутки, с длительностью терапии от одного года до 7 лет.
Целью нашей работы являлось изучение взаимосвязей между концентрацией иматиниба в плазме крови и формированием молекулярной ремиссии у пациентов с ХМЛ в хронической фазе при монотерапии данным препаратом в стандартной дозе.
Были обследованы 79 пациентов с цитогенетически подтвержденным диагнозом Ph-положительного ХМЛ в хронической фазе. 1-ю группу составили 30 больных с впервые выявленным ХМЛ,
2-ю — 49 из 53 пациентов с ХМЛ, получавших иматиниб в дозе 400 мг/сут в течение 18—36 месяцев. Из исследования были исключены 4 пациента с ХМЛ, у которых
340
выявлено нарушение режима приема препарата. У этих больных ХМЛ концентрация иматиниба в плазме составляла 0-76 нг/мл.
Молекулярно-генетические исследо-
вания экспрессии гена BCR-ABL в клетках крови методом ПЦР в реальном времени выполнялись на этапе постановки диагноза у 30 пациентов, вошедших в группу с впервые диагностированным ХМЛ, на 18—36-й месяцы у 49 пациентов, получавших терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут в течение 18-36 месяцев. Из образцов венозной крови в количестве не менее 10 мл выделяли тотальную РНК гуанидин-тиоционат хлороформ-феноль-ным методом [7]. Для реакции обратной транскрипции использовали от 1 до 3 мкг выделенной РНК, случайные гексамер-ные праймеры и M-MLV обратную транс-криптазу. ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили в термоциклере Rotor-Gene 6000 (версии 1.7). Для выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени использовали наборы реагентов ОНКОСКРИН 1-1-Q («ГеноТехнология», Россия). Интенсивность экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210 и контрольного (“housekeeping”) гена ABL определяли по протоколу производителя. Результат относительной экспрессии гена BCR-ABL выражали как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 106( BCR-ABLх106/копий ABL). Снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с ХМЛ, получавших терапию иматинибом, устанавливали по отношению к рассчитанному нами среднестатистическому базовому уровню (БУ) экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с впервые выявленным ХМЛ. Для удобства представления данных об изменении уровня экспрессии BCR-ABL в процессе лечения иматинибом была использована логарифмическая шкала измерений [6]. Результаты выражали в виде десятичного логарифма снижения (Alg) экспрессии по отношению к БУ. Снижение экспрессии на 1 lg по отношению к базовому уровню означало снижение уровня экспрессии BCR-ABL транскрипта по сравнению с БУ в 10 раз, на 2 lg — в 100 раз, на 3 lg — в 1000 раз, на 4 lg — в 10000 раз. Сниже-
ние экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log (Alg >3) означало достижение большого молекулярного ответа.
С целью определения минимальной концентрации иматиниба в плазме (С ) образцы крови у 49 пациентов, получавших иматиниб 18-36 месяцев, брали через 20-25 часов после последнего приема препарата, т. е. перед очередным приемом иматиниба. Концентрацию иматиниба в плазме исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ/ МС/МС) с помощью хроматографа Agilent 1200 и квадрупольного тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 (Agilent Technologies, США) [20].
Статистический анализ данных производили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой [3] по обработке численных результатов экспериментов в медицине с вычислением среднего значения стандартной ошибки средней, медианы. Вариабельность признака определяли с помощью стандартного отклонения (s). Для оценки значимости статистических различий количественных показателей в сформированных группах применяли непараметрические методы — критерий Манна-Уитни (p), для изучения связи изучаемых признаков — коэффициент корреляции Спирмена (г).
На первом этапе исследования определяли уровень экспрессии гена BCR-ABL у 30 больных с впервые диагностированным ХМЛ до начала терапии. Значения экспрессии гена BCR-ABL варьировали от 9118 до 501189 копий BCR-ABLх106/копий ABL. Медиана экспрессии гена BCR-ABL у больных с впервые выявленным хроническим миелоидным лейкозом составляла 94211 копий BCR-ABLх106/копий ABL. Эта величина была принята за БУ экспрессии гена BCR-ABL.
Среди 49 пациентов, получавших терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут в течение 18-36 мес и вошедших в наше исследование, 18 (36,7%) достигли большого молекулярного ответа, а 31 (63,3%) — нет (A lg BCR-ABL < 3). Пациенты с ХМЛ (n=18), достигшие большого молекулярного ответа, были в возрасте в среднем 54 лет,
соотношение числа мужчин и женщин — 8/10, длительность терапии иматинибом — в среднем 29 месяцев. Среднее значение С . иматиниба в плазме крови в этой
min г
группе составляло 1729,2 ± 215,0 нг/мл, медиана — 1558,5 нг/мл, минимальное значение — 447,0 нг/мл, максимальное —
3394.0 нг/мл. Отмечалась значительная вариабельность данного показателя, поскольку стандартное отклонение (s) в этой группе пациентов составляло 916,2.
В группе пациентов с ХМЛ (n=31), не достигших большого молекулярного ответа, средний возраст составлял 51 год, соотношение числа мужчин и женщин — 16/15, средняя длительность терапии има-тинибом — 24 месяца. Среднее значение С . в плазме крови — 962,1 ± 77,2 нг/мл,
min Г 7 7/7
медиана — 922,0 нг/мл, минимальное значение — 263,0 нг/мл, максимальное —
2472.0 нг/мл. В этой группе также обнаружена значительная вариабельность С —
г min
стандартное отклонение (s) равнялось 430,1.
Статистический анализ с использованием критерия Манна-Уитни (U-тест) выявил, что между группами пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа и не достигших его, средние значения С иматиниба в плазме
min
различаются статистически достоверно (р=0,0007). Использование критерия Спирмена показало, что уровень экспрессии гена BCR-ABL и, следовательно, объем опухолевого клона клеток коррелируют с уровнем Cmin иматиниба (выявлена отрицательная корреляция: г=-0,4; р=0,006).
В ходе двух независимых исследований, результаты которых были недавно опубликованы [10, 18], обнаружилась
корреляция между минимальным уровнем иматиниба в плазме и достижением цитогенетической и молекулярной ремиссии у пациентов с ХМЛ. По данным S. Picard et al. [18], у пациентов, достигших большого молекулярного ответа на терапию иматинибом в дозе 400-600 мг/сут, С . иматиниба в плазме была значитель-
min
но выше, чем у пациентов без большого молекулярного ответа (1452,1±649,1 нг/мл против 869,3±427,5 нг/мл соответственно; p<0,001). Дальнейший дискриминационный статистический анализ показал, что С . в плазме более 1002 нг/мл является
min 1
минимально необходимой концентрацией для достижения большого молекулярного ответа.
В клиническом исследовании IRIS также была выявлена связь между минимальной концентрацией иматиниба в плазме и достижением полного цитогенетического и большого молекулярного ответов на терапию иматинибом [14]. Авторы сопоставляли значения С . имати-
г min
ниба в плазме крови у пациентов с ХМЛ на 29-й день терапии иматинибом с последующим клиническим исходом. Оказалось, что пациенты с С . иматиниба
’ ^ min
в плазме менее 647 нг/мл (нижний квартиль) достигают большого молекулярного ответа только в 63% случаев, с С . более
J min
1170 нг/мл (верхний квартиль) — в 86%. Противоположные данные получены D.L.Forrest et al. [10]: C . иматиниба у
L J min *
больных ХМЛ с большим молекулярным ответом составил 1067±473,1 нг/мл, без такового — 1063±642,5 нг/мл (p=0,74). Авторы не обнаружили корреляции между C иматиниба и молекулярным ответом
min ^ А
на терапию ХМЛ.
Дизайн указанных выше исследований небезупречен. В частности, в исследование вошли пациенты, получавшие как 400 мг, так и 600 мг иматиниба в сутки. Вероятно, такое решение было принято на основании данных B. Peng et al. [17], показавших, что C иматиниба при на-
min г
значении 400 и 600 мг иматиниба мало различается. Однако в этой работе авторы приводят результаты I фазы клинических испытаний иматиниба, выполненных на небольшом числе пациентов. Кроме того, S. Picard et al. [18] и D.L.Forrest et al. [10] обследовали пациентов как в хронической фазе, так и в фазе акселерации ХМЛ. D.L.Forrest et al.[10] анализировали результаты пациентов, которые получали имати-ниб от одного года до 7 лет. Причем 55 из 133 пациентов были исключены из исследования в связи с прогрессированием заболевания. R. Larson et al. [14] показали, что прогрессирование ХМЛ коррелирует с концентрацией иматиниба. С большой вероятностью можно предположить, что именно эти 55 пациентов имели низкую концентрацию препарата в плазме. Исключение этих пациентов из исследования уменьшили потенциальную корреля-342
цию между Сш1п иматиниба и ответом на терапию. В дополнение к этому исследование выполнялось на небольшом числе пациентов с разной степенью риска по шкале Sokal.
В наше исследование вошли больные ХМЛ только в хронической фазе. Все пациенты получали терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут. Длительность терапии у всех пациентов варьировала от 18 месяцев, когда в соответствии с критериями БЬМ должен быть достигнут большой молекулярный ответ до 36 месяцев. В результате исследования Сш1п иматиниба в группе пациентов с ХМЛ в молекулярной ремиссии составила 1729,2 ± 215,0 нг/мл, а в группе без таковой — 962,1 ± 77,2 нг/мл (р=0,0007). Достоверные различия Сш1п има-тиниба в этих двух группах, а также обнаруженная связь (г=-0,4) между С имати-ниба и уровнем экспрессии гена БСК-ЛБЬ, отражающим объем опухолевой массы, свидетельствуют о влиянии концентрации иматиниба на достижение молекулярной ремиссии у пациентов с ХМЛ.
По данным различных авторов, концентрация иматиниба в плазме крови является достаточно вариабельным показателем [14, 17]. Нами выявлена межин-дивидуальная вариабельность Сш1п иматиниба. Вариабельность концентрации иматиниба в плазме имеет мультифак-ториальную основу, включающую генетический полиморфизм ферментов, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов, воздействие факторов окружающей среды (например, особенности питания пациентов), наличие сопутствующих заболеваний [21]. Эти факторы, несомненно, влияют на такие фармакокинетические показатели, как абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция иматиниба, поэтому лекарственный мониторинг терапии ХМЛ иматинибом с последующей коррекцией дозы препарата приобретает особое значение для повышения эффективности лечения.
Таким образом, терапевтическая концентрация иматиниба в плазме крови является вариабельным показателем. У пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа, концентрация иматиниба в плазме значительно выше, чем у больных ХМЛ, не достигших
его при терапии иматинибом в дозе 400 мг/сут. В случае отсутствия у пациентов с низким уровнем иматиниба большого молекулярного ответа в рекомендованные ELN сроки суточная доза препарата может быть повышена до 600-800 мг.
ЛИТЕРАТУРА
1. Куцев С.И., Вельченко М.В., Зельцер А.Н. Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза ингибиторами тирозинкиназ // Онкогематология. — 2008. — №4. — C.17-25.
2. Мисюрин А.В. Аксенова Е.В., Крутов А.А. и др. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематол. и трансфузиол. — 2007. — Т.52, №2. — С.35-40.
3. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных.- М.: Медиа Сфера,2002.- 305 с.
4. Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и др. Эффективность терапии иматиниба мезилатом (гливе-ком) в хронической фазе миелолейкоза // Тер. арх. —
2003. — Т. 75, № 8. — С. 62-67.
5. Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the european leukemia Net // Blood. — 2006. — Vol. 108, № 6. — Р. 1809-1820.
6. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I. et al. Real-time quantitative PCR analysis can be used as a primary screen to identify patients with CML treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations // Blood. —
2004. — Vol.104, № 9. — P. 2926-2932.
7. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. — Vol.162, №1. — P. 156-159.
8. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210 bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome // Science. — 1990. — Vol. 247, № 4944. — P. 824-830.
9. Druker B.J., Guilhot F., O'Brien S.G. et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia // N. Engl. J Med. — 2006. — Vol. 355, № 23. — Р. 2408-2417.
10. Forrest D.L., Trainor S., Brinkman R.R. et al. Cytogenetic and molecular responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukemia are correlated with Sokal risk scores and duration of therapy but not trough imatinib plasma levels // Leuk. Res. — 2008. — Vol.33, № 2. — P. 271-275.
11. Goldman J.M. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era // Blood. — 2007. — Vol. 110, № 8. — P. 2828-2837.
12. Hochhaus A, Druker B.J., Larson RA. et al. IRIS 6-year follow-up: Sustained survival and declining annual rate of transformation in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CML-CP) treated with imatinib // Blood. — 2007. — Vol. 110, № 11. — P. 25.
13. Kantarjian H., Sawyers C., Hochhaus A. et al. Hematologic and cytogenetic responses to imatinib
mesylate in chronic myelogenous leukemia // N. Engl. J. Med. — 2002. — Vol. 346, № 9. — P. 645-652.
14. Larson R.A., Druker B.J., Guilhot F. et al. Imatinib pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study // Blood. — 2008. — Vol. 111, № 8. — P. 4022-4028.
15. O’Brien S., Guilhot F., Larson R. et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348, № 11. — P. 994-1004.
16. O’Brien S.G., Guilhot F., Goldman J.M. et al. International randomized study of interferon versus STI571 (IRIS) 7-year follow-up: Sustained survival, low rate of transformation and increased rate of major molecular response (MMR) in patients (pts) with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CMLCP) treated with imatinib (IM) // Blood. — 2008. — Vol. 112, № 11. — Р. 186.
17. Peng B. , Hayes M., Resta D. et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of imatinib in a phase I trial with chronic myeloid leukemia patients // J. Clin. Oncol.—2004. — Vol. 22, № 5. — P. 935-942.
18. Picard S., Titier K., Etienne G. et al. Trough imatinib plasma levels are associated with both cytogenetic and molecular responses to standard-dose imatinib in chronic myeloid leukemia // Blood. — 2007. — Vol.109, № 8. — P3496-3499.
19. Rowley J.D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining // Nature. — 1973. — Vol. 243, № 5405. — Р. 290-293.
20. Titier К., Picard S.,Ducint D. et al. Quantification of Imatinib in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry // Ther. Drug. Monit. — 2005. — Vol.27. — P. 634-640.
21. Wilkinson G.R. Drug metabolism and variability among patients in drug response // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 352. — P. 2211-2221.
Поступила 27.03.09.
THE INFLUENCE OF PLASMA IMATINIB CONCENTRATION ON ATTAINING A MOLECULAR REMISSION IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOLEUKEMIA
S.I. Kutsev, O.S. Oksenyuk, M.V. Vel'chenko
Summary
Examined was the relationship between the concentration of imatinib in blood plasma and the formation of molecular remission in 49 patients with chronic myeloleukemia during monotherapy with imatinib. Cmin of imatinib in the group of patients with molecular remission was higher than that in the group without molecular remission. Found was a correlation between Cmin of imatinib and the level of BCR-ABL gene expression. At low levels of imatinib in the blood plasma recommended was an increase of the daily dose to achieve a molecular remission.
Key words: chronic myeloleukemia, imatinib
concentration, BCR-ABL gene expression.
