CC BY
109
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА ИНГИБИТОРАМИ ТИРОЗИНКИНАЗ
С.И. Куцев, М.В. Вельченко, А.Н. Зельцер
ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону
Терапия Ph-позитивного хронического миелолейкоза (ХМЛ) игибитором тирозинкиназ иматинибом приводит к достижению гематологической и цитогенетической ремиссии с большой частотой. Однако у большинства пациентов с полным цитогенетическим ответом молекулярными методами обнаруживается минимальная остаточная болезнь. В связи с этим роль молекулярного мониторинга терапии ХМЛ в последние годы возросла. Регулярный молекулярный мониторинг позволяет рано выявить рецидив и, как следствие терапевтической интервенции, улучшить результаты лечения. Для пациентов с ХМЛ, получающих лечение иматинибом, резистентность к проводимой терапии или повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL служат показанием для анализа мутаций киназного домена этого гена. Выявление мутаций, ставших причиной резистентности к иматинибу, необходимо для выбора тактики терапии. Молекулярные методы полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и ДНК-секвенирования должны войти в практику мониторинга ХМЛ.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, экспрессия гена BCR-ABL, мутации киназного домена гена BCR-ABL, ингибиторы тирозинкиназ
MOLECULAR GENETICS MONITORING OF TYROSINE KINASE INHIBITOR THERAPY FOR CHRONIC MYELOID LEUKEMIA
S.I. Kutsev, M.V. Velchenko, A.N. Zelzer
Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia
Therapy for Ph-positive chronic myeloid leukemia (CML) with the tyrosine kinase inhibitor imatinib results in achievement of high hematological and cytogenetic response rates. However, most patients with a complete cytogenetic response were found to have a minimal residual disease. Therefore the role of molecular monitoring during CML therapy has recently increased. Regular molecular monitoring allows to early diagnosis of relapse and improvement of treatment outcome as a result of therapeutic intervention. For the imatinib-treated patients therapy resistance or increased BCR-ABL gene expression is an indication for kinase domain mutations testing. Detection of the mutations causing imatinib resistance is required for therapy choice. Real-time polymerase chain reaction and DNA sequencing should become customary for CML monitoring.
Key words: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL gene expression, mutations of BCR-ABL gene kinase domain, tyrosine kinase inhibitors
Введение
Успешное лечение пациентов с хроническим ми-елоидным лейкозом (ХМЛ) невозможно без соответствующего мониторинга эффективности проводимой терапии. Это положение стало особенно очевидным со времени внедрения в клиническую практику первого препарата группы ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) — иматиниба мезилата (Гливек, «Novaris Pharma»). В настоящее время прошли клинические испытания и зарегистрированы для лечения ХМЛ ИТК II поколения — нилотиниб (Тасигна, «Novartis Pharma») и дазатиниб (Спрайсел, «Bristol-Mayers Squibb»). Во II и III фазах клинических испытаний находятся новые лекарственные вещества уже III поколения ИТК [1—4]. Возможности терапии ХМЛ не ограничиваются использованием только ИТК. Несомненно, что тактика ведения пациентов с ХМЛ включает и трансплантацию костного мозга у больных с высоким риском развития рецидива на фоне терапии ИТК [4, 5], и применение а-интерферонов у пациентов с низким риском возникновения рецидива, а также для улучшения результатов лечения ИТК [6, 7]. Широкий диапазон доступных в настоящее время подходов к терапии ХМЛ требует унифицированной системы мониторинга эффективности лечения ХМЛ для своевременного выбора наиболее оптимального и потенциально эффективного подхода к терапии ХМЛ в каждом конкретном случае.
Провести достоверную диагностику и мониторинг лечения ХМЛ позволяет стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) клеток костного мозга. СЦИ является единственным методом, позволяющим анализировать весь хромосомный набор клетки. Посредством СЦИ можно обнаружить дополнительные хромосомные аберрации, которые в ряде случаев свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе заболевания. При этом необходимо понимать, что разрешающая способность этого метода относительно низкая и составляет 1—5% клеток. Филадельфийская хромосома с помощью стандартной цитогенетики выявляется почти у 90% вновь диагностированных нелеченых больных с ХМЛ [8].
Метод флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) хромосом является более чувствительным и позволяет обнаружить 1 опухолевую клетку на 200—500 клеток костного мозга. При использовании метода FISH можно определить Ph+ клон клеток даже при отсутствии делящихся клеток. Для выявления BCR-ABL слитного гена используют ДНК-зонды, меченные различными флю-орохромами. С помощью FISH-технологий данную перестройку удается обнаружить у 95% больных с клиническим диагнозом ХМЛ [8]. СЦИ и FISH-анализ используются как для диагностики ХМЛ, так и для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ИТК.
В соответствии с рекомендациями European Leukemia Net [9] контрольные СЦИ или FISH-анализ (в случае отсутствия митозов клеток костного мозга) на
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
фоне терапии ХМЛ ИТК проводят 1 раз в 6 мес до достижения полного цитогенетического ответа, а затем 1 раз в год.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется как для диагностики ХМЛ, так и для мониторирования минимальной остаточной болезни (МОБ) в процессе терапии [10, 11]. С помощью ПЦР или FISH-анализа диагноз подтверждается в тех 5% случаев, при которых СЦИ Ph-хромосому не выявляет. Для проведения исследования можно использовать образцы как крови, так и костного мозга. Чувствительность этого метода высока и позволяет обнаружить одну единственную клетку со специфической ДНК или РНК среди 104—106 клеток. Более чем у четверти из Ph-негативных пациентов с помощью ПЦР выявляют химерный ген BCR-ABL. Только небольшая часть больных (2—3%) с классической картиной ХМЛ — Ph/BCR ABL-негативны [8].
Молекулярный мониторинг уровня BCR-ABL-транскрипта при помощи количественной ПЦР в реальном времени все чаще используется в качестве оценки ответа на лечение у пациентов с ХМЛ [12]. Этот метод становится особенно важным в эру терапии ХМЛ ИТК, когда резидуальный уровень лейкозных клеток обычно ниже уровня чувствительности цитогенетического исследования [13, 14].
Мониторинг у пациентов, получающих иматиниб, молекулярным методом производится путем определения уровня экспрессии BCR-ABL-транскрипта до начала терапии и затем каждые 3 мес. Этот подход позволяет оценить динамику терапии и предсказать возможность развития рецидива.
Значимость молекулярного анализа определяется также тем, что уровень молекулярного ответа служит предиктором безрецидивной выживаемости [15]. Повышение уровня экспрессии BCR-ABL-транскрипта на фоне терапии иматинибом косвенно может указывать на наличие мутаций в гене Bcr-Abl-киназы, являющихся ведущей причиной резистентности к иматинибу. Как следствие, молекулярный мониторинг целесообразно использовать в качестве скрининговой стратегии мутационного анализа [16].
Методология идентификации BCR-ABL эволюционировала на протяжении последних лет [17]. Изначально было возможно только качественное определение BCRABL-транскрипта с использованием одношаговой амплификации или двушаговой «гнездовой» амплификации с внутренними праймерами, повышающими чувствительность [18—20].
Качественный ПЦР-анализ, показывающий только наличие или отсутствие транскрипта, недостаточно информативен. В связи с этим для оценки динамики терапии на первый план вышли количественные ПЦР-иссле-дования и поиск прогностически важных уровней транскрипта BCR-ABL. Для определения МОБ применяют методику количественной ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR, RQ-PCR). В основе метода лежат регистрация накопления продуктов реакции в реальном времени и построение калибровочных кривых по реальным процессам, происходящим в каждой конкретной пробирке. Для определения ПЦР-продукта используются флюоресцентные красители, обеспечивающие флюоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта — так называемая репортерная флюоресценция.
Результат исследования методом ПЦР в реальном времени выражают отношением уровня экспрессии гена BCR-ABL к уровню экспрессии контрольного (housekeeping) гена. В качестве контрольных наиболее часто используют гены ABL, BCR, fi2-M. Полным молекулярным ответом считают случаи, когда BCR-ABL-транскрипт выявить не удается. Негативные результаты подтверждают с помощью качественной реакции ПЦР, чувствительность которой выше, чем у RQ-PCR [17].
Альтернативный метод выражения результатов ПЦР в реальном времени был введен Т Hughes и соавт. в 2003 г. [21] в ходе новаторского международного рандомизированного исследования STI571 (IRIS Study), доказавшего высокую эффективность лечения ХМЛ имати-нибом. В этом исследовании среднее значение экспрессии гена BCR-ABL в 30 образцах крови, полученных у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом до терапии, считалось показателем среднего базового значения. Авторы предложили концепцию мониторирования ответа на терапию иматинибом с использованием десятичного логарифма (logio): редукция экспрессии гена BCR-ABL по сравнению со стандартной базовой линией не леченных иматинибом пациентов оценивалась в logio [21].
Другой вариант выражения результатов - это отношение числа копий гена BCR-ABL к числу копий контрольного гена или представление данного соотношения в процентном выражении, где число копий контрольного гена принято за 100% [17].
Уровень экспрессии транскрипта коррелирует с числом опухолевых клеток, присутствующих в крови, являясь своеобразным маркером ответа на таргетную терапию [22]. Лейкозоспецифичный BCR-ABL-транскрипт является удобным маркером для молекулярного мониторинга терапии ХМЛ методом количественной ПЦР, так как почти у всех пациентов с данным заболеванием обнаруживаются 1 или 2 типа транскрипта, которые различаются только по одному BCR-экзону [22].
У больных, принимающих иматиниб, рядом авторов выявлена выраженная корреляция между процентом Р^позитивных метафаз в костном мозге и уровнем BCRABL-транскрипта, оцененным RQ-PCR-исследованием периферической крови [23—25]. Ранняя редукция уровня BCR-ABL-транскрипта предсказывает цитогенетический ответ у пациентов в хронической фазе ХМЛ, принимающих иматиниб. В свою очередь, повышение уровня BCR-ABL-транскрипта — неблагоприятный прогностический признак, как правило, предшествующий развитию цитогенетического рецидива и прогрессии болезни. С учетом того, что у небольшой части больных с продолжительной полной цитогенетической ремиссией впоследствии возникают рецидивы с быстрой прогрессией вплоть до бластного криза, метод молекулярного мониторинга приобретает особенное значение.
Опыт ведения пациентов с ХМЛ при использовании монотерапии иматинибом показал необходимость регулярного цитогенетического и/или молекулярно-генетического мониторинга ремиссии. Так, в клиническом исследовании IRIS у вновь выявленных пациентов с ХМЛ, получающих терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут, в 4% случаев не удалось достичь полной гематологической ремиссии по истечении 3 мес терапии, в 16% случаев не достигнут большой цитогенетический ответ после 12 мес терапии и у 23% — после 18 мес тера-
пии [26]. Таким образом, приблизительно 20—25% пациентов с только что установленным диагнозом ХМЛ характеризуются субоптимальным ответом или резистентностью к иматинибу в дозе 400 мг/сут [26]. По мнению большинства исследователей, наиболее частой причиной резистентности к иматинибу являются точечные мутации гена BCR-ABL-киназы [27—33], которые приводят к замене аминокислот в белке BCR-ABL и, как следствие, изменяют конформацию белка или структуру активного центра BCR-ABL-киназы. В результате аминокислотных замен иматиниб не способен эффективно связываться с BCR-ABL-киназой и оказывать на нее ингибирующее действие.
Частота мутаций, приводящих к резистентности, у пациентов с ХМЛ зависит от фазы заболевания. Так, в исследовании итальянской рабочей группы GIMEMA [34] проведен мутационный анализ у 297 пациентов с первичной и вторичной резистентностью к иматинибу, и мутации выявлены у 127, что составило 43%. При этом мутации были обнаружены у 27% больных в хронической фазе, у 52% — в фазе акселерации, у 75% пациентов с ми-елоидным и у 85% — с лимфоидным бластным кризом. Мутации отмечены у 30% пациентов с первичной и в 57% случаев — вторичной (приобретенной) резистентностью к иматинибу.
В настоящее время идентифицировано по крайней мере 90 точечных мутаций киназного домена гена BCR-ABL, каждая из которых приводит к замене одной из 53 аминокислот в белке тирозинкиназы BCR-ABL и обусловливает резистентность к иматинибу [35]. Мутации встречаются у резистентных к иматинибу пациентов с различной частотой. Т Hughes и соавт. [36] обобщили данные 20 опубликованных работ, проанализировав частоту различных мутаций у 245 пациентов (219 больных с ХМЛ и 26 - с Р^позитивным острым лимфобластным лейкозом). Чаще всего у резистентных пациентов с ХМЛ и Р^позитивным острым лимфобластным лейкозом обнаруживают мутации Е255К/У и М351Т, а также мутацию Т3151, устойчивую не только к иматинибу, но и к ИТК II поколения (рис. 1). По данным 8. 8оуепш и соавт. [34], мутации М244У, G250E, Y253F/H, Е255К/У Т3151, М351Т и F359V составляют 85% всех мутаций, ассоциированных с резистентностью к иматинибу.
Наиболее широко распространенным методом выявления мутаций гена BCR-ABL у резистентных пациентов является молекулярно-генетический метод прямого секвенирования ДНК, позволяющий расшифровать первичную структуру гена. Из крови или костного мозга пациентов выделяют тотальную РНК, которую с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ) переводят в комплементарную ДНК (кДНК). Из полученной кДНК с помощью реакции ПЦР амплифицируют ген BCR-ABL и затем определяют его первичную последовательность [27, 37, 38].
Наиболее вероятно, что появление мутаций является результатом повышенной тирозинкиназной активности самого белка BCR-ABL [39], и вероятность появления мутаций, а следовательно, и ухудшение прогноза заболевания, увеличиваются по мере его прогрессирования. Так, частота обнаружения мутантных клонов в фазе бла-стного криза в несколько раз выше таковой в хронической фазе. Об этом же свидетельствует снижение риска появления мутаций на фоне терапии иматинибом, по-
скольку редуцируется клон клеток, содержащих гиперактивную форму тирозинкиназы — BCR-ABL. В связи с этим уже с молекулярно-биологических позиций становится очевидной клиническая значимость ранней диагностики и раннего начала терапии ХМЛ иматинибом.
Таким образом, помимо стандартных цитогенетических и FISH-исследований, уже прочно вошедших в практику врача-гематолога, наиболее перспективным нам представляется развитие и внедрение в диагностический процесс и мониторинг терапии ХМЛ молекулярногенетических технологий.
Целью нашего исследования являлось изучение возможностей комплексного молекулярно-генетического подхода с использованием методов ПЦР в режиме реального времени и мутационного анализа для диагностики и мониторирования ответа на терапию пациентов с ХМЛ. В задачи нашего исследования входило рассчитать базовый уровень экспрессии гена BCR-ABL в группе вновь диагностированных, не леченных иматинибом пациентов с ХМЛ, изучить эффективность метода ПЦР в реальном времени для оценки МОБ у пациентов, достигших полного цитогенетического ответа на терапию иматинибом, выяснить корреляционную связь уровня экспрессии гена BCR-ABL и степени цитогенетического ответа на терапию иматинибом, проанализировать уровень экспрессии гена BCR-ABL и изучить мутационный профиль у иматиниб-резистентных пациентов.
Материалы и метопы
Характеристика групп пациентов
В работе представлены результаты молекулярных исследований крови и костного мозга 100 больных с цитогенетически подтвержденным диагнозом P^-ХМЛ. Все пациенты находились в хронической фазе заболевания. 1-ю группу составили 35 больных с впервые выявленным ХМЛ, 2-ю — 35 пациентов, достигших полного цитогенетического ответа на терапию иматинибом в дозе 400 мг/сут в течение 12—18 мес лечения, 3-ю группу — 30 пациентов, резистентных к терапии иматинибом в дозе 400 или 600 мг/сут.
Больные рассматривались как резистентные к терапии иматинибом в соответствии с критериям European Leukemia Net [9]: отсутствие гематологического ответа после 3 мес терапии иматинибом в дозе 400 мг/сут, цитогенетического ответа - после 6 мес, частичного цитогенетического ответа — после 12 мес, полного цитогенетического ответа — после 18 мес терапии, потеря уже достигнутого гематологического, ци-
100-
16 □ >3 lg □ 2—2,99 lg □ 1—1,99 lg □ <1 lg
Число случаев, % 2 4 6 8 0 О О О 1 1 1 1 100 37 53
25
47
22
0
Группы пациентов
Рис. 1. Структура молекулярного ответа с использованием значений А% у пациентов с резистентностью к иматинибу (3-я группа) и при полном цитогенетическом ответе на терапию иматинибом (2-я группа)
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
тогенетического или молекулярного ответов, прогрессирование заболевания с переходом в фазу акселерации или бластного криза. Число выполненных исследований на этапе диагностики и в динамике терапии ХМЛ представлено в табл. 1.
Цитогенетические исследования костного мозга
Цитогенетическое исследование костного мозга на этапе постановки диагноза ХМЛ выполнено у всех 100 пациентов. Контрольные цитогенетические исследования проведены через 6, 12 и 18 мес терапии иматинибом у 35 больных, достигших полного цитогенетического ответа, через 6 и 12 мес — у 30 пациентов, резистентных к терапии иматинибом. Всего было выполнено 256 цитогенетических исследований. Образцы костного мозга в количестве 0,5—1 мл в пробирках с гепарином Li транспортировались в лабораторию в течение 0,5—24 ч при температуре 4—8°С. В работе использовались общепринятые прямой метод и метод культивирования образцов костного мозга в течение 24 ч. Для стандартного цитогенетического анализа препараты окрашивались методом GTG (дифференциальная окраска G). Для FISH-анализа в 11 случаях использовали двухцветный ДНК-зонд LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe («ABBOT»). Флюоресцентную гибридизацию хромосом на цитогенетических препаратах проводили в соответствии с протоколом производителя.
Молекулярные исследования
Молекулярно-генетические исследования экспрессии гена BCR-ABL методом ПЦР в режиме реального времени в клетках крови выполнены на этапе постановки диагноза — у 35 больных, вошедших в группу с впервые диагностированным ХМЛ, на 12-й или 18-й месяц — у 35 пациентов, достигших полного цитогенетического ответа, и на 12-й и 18-й месяцы — у 30 резистентных пациентов. Всего методом ПЦР в реальном времени выполнено 100 исследований.
Образцы крови и выделение РНК
Образцы венозной крови для молекулярных исследований в количестве не менее 10 мл в пробирках с эти-лендиаминтетраацетатом транспортировались в лабораторию в течение 0,5—24 ч при температуре 4—8°С. Выделение тотальной РНК проводили не позже чем через 24 ч после забора крови гуанидин-тиоционат-хлороформ-фе-нольным методом по P Chomczynski, N. Sacchi [40] с использованием реагентов для выделения РНК, входящих
в состав набора Онкоскрин-Ы-Q (ООО «ГеноТехноло-гия», Россия).
Реакция ОТ
Для реакции ОТ применяли от 1 до 3 мкг выделенной тотальной РНК, случайные гексамерные праймеры и M-MLV-обратную транскриптазу, входящие в состав набора Онкоскрин-1-LQ.
ПЦР в режиме реального времени
ПЦР с определением в режиме реального времени осуществлялась в термоциклере Rotor-Gene 6000 (версии 1.7, «Corbett Life Science», Австралия). Для проведения ПЦР в реальном времени использовались наборы реагентов Онкоскрин-Ы-Q. Определение интенсивности экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210 и контрольного (housekeeping) гена ABL проводилось согласно протоколу производителя. Для построения калибровочной кривой применялись десятикратные разведения положительных контрольных образцов (плазмиды, содержащие клонированные фрагменты генов BCR-ABL и ABL), концентрации которых составляли 102, 103, 104, 105, 106 копий в 5 мкл раствора.
Результат относительной экспрессии гена BCR-ABL выражали как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное
на 106.
Для удобства представления данных по изменению уровня экспрессии BCR-ABL в процессе лечения была использована логарифмическая шкала измерений [41]. Результаты выражали в виде десятичного логарифма (lg) снижения экспрессии по отношению к базовому уровню. Снижение экспрессии на 1 lg по отношению к базовому уровню означало уменьшение уровня экспрессии BCRABL-транскрипта по сравнению с базовым уровнем в 10 раз, на 2 lg Р в 100 раз, на 3 lg Р в 1000 раз, на 4 lg Р в 10 000 раз.
Также для оценки динамики изменений экспрессии гена BCR-ABL использовалась международная шкала (International Scale, IS), рекомендованная Экспертной группой European Leukemia Net (ELN) [8]. При этом экспрессия контрольного гена (в нашем случае гена ABL) принимается за 100%. Относительная экспрессия гена BCR-ABL по IS определялась как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 100%. Согласно рекомендациям ELN, обнаружение гена BCR-ABL более чем в 1% клеток
Таблица 1. Число выполненных цитогенетических и молекулярно-генетических исследований на этапе диагностики и в динамике наблюдения пациентов с ХМЛ
Длительность терапии иматинибом (мес)
Группа 0 6 12 18 Итого
Число СЦИ и FISH-исследований
1-я (n=35) 35 — — — 35
2-я (n=35) 35 33 35 35 138
3-я (n=30) 30 23 30 — 83
Число исследований экспрессии гена BCR-ABL
методом ПЦР в реальном времени
1-я (п=35) 35 — — — 35
2-я (п=35) — — 23 12 35
3-я (п=30) — — 25 5 30
Число исследований мутаций гена BCR-ABL 3-я (n=30)
16
7
23
свидетельствует о выраженной экспрессии BCR-ABL, оценить которую можно с помощью СЦИ. Экспрессия гена BCR-ABL в 0,1—1% клеток характерна для умеренного уровня экспрессии, который уже невозможно оценить с помощью СЦИ. Определение экспрессии гена BCR-ABL на уровне менее чем в 0,1% говорит о достижении пациентом большого молекулярного ответа.
Анализ мутаций гена BCR-ABL
Анализ мутаций гена BCR-ABL был выполнен методом прямого ДНК-секвенирования у 23 больных, входящих в группу резистентных к иматинибу пациентов. В исследовании определялась первичная последовательность кДНК, полученной в результате реакции ОТ тотальной РНК.
На первом этапе проводили амплификацию анализируемых фрагментов с помощью термоциклера Bio-Rad PTC200 («BioRad Lab», США). Амплификация интересующего фрагмента гена ABL осуществлялась в 2 этапа в соответствии с рекомендациями S. Branford, T Hughes [42]. На первом этапе амплифицировали участок гена BCR-ABL с помощью праймеров BCR F Р 5'- tga cca act cgt gtg tga aac tc -3' и ABL R — 5'- tcc act tcg tct gag ata ctg gat t -3'. При этом, в случае если у пациента был вариант гена BCR-ABL b2a2, при электрофорезе в 2% агарозном геле выявлялся фрагмент длиной 1504 пар оснований (п.о.), а если имелся вариант b3a2 — обнаруживали фрагмент длиной 1579 п.о. На втором этапе из полученного фрагмента BCR-ABL амплифицировали участок только гена ABL с помощью праймеров к гену ABL — ABL F - 5'- cgc aac aag ccc act gtc t -3' и ABL R - 5'- tcc act tcg tct gag ata ctg gat t -3'. В результате амплификации получали фрагмент гена ABL длиной 863 п.о., кодирующий Р-петлю, С-спи-раль, область SH2-контакт, А-петлю. Реакции были выполнены в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 7 мкл деионизированной воды («Sigma»), 5 мкл (1—3 мкг) полученной кДНК, 4 мкл 5-кратного ПЦР-буфера, 15мМ MgCl2, 0,3 мкл (5 ЕД/мкл) TaqF ДНК-полимеразы («Ин-терЛабСервис»), 2 мкл смеси dNTP и по 1 мкл каждого праймера. Реакцию амплификации проводили при следующих условиях: 95°С — 10 мин; 45 циклов: 95°С — 15 с, 60°С — 20 с, 72°С — 120 с; 72°С — 5 мин.
Реакция секвенирования полученного фрагмента гена ABL осуществлялась с помощью набора GenomeLab™Methods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing («Beckman Coulter», США) согласно протоколу производителя. Реакционная смесь для ДНК-секвенирования включала 5,5 мкл Pre-mix, 1 мкл ABL-F праймера и 3,5 мкл очищенного ПЦР-продукта. Секве-нирование проводили по следующей схеме: 94°С — 1 мин; 45 циклов; 94°С — 15 с, 64°С — 20 с, 60°С — 60 с.
Определение нуклеотидной последовательности выполняли посредством применения автоматического секвенатора CEQ8000 («Beckman Coulter», США). Параметры проводимого электрофореза: вольтаж — 6 кВ, время — 60 мин, температура — 56°C, время подъема температуры — 5 мин. Анализ полученных результатов определялся с помощью программного обеспечения для Beckman Coulter CEQ8000.
Статистическая обработка данных Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения Ехсе1 и включала в себя определение медианы, максимальных и минимальных значений, коэффициента корреляции. Результаты и обсуждение Расчет базового уровня экспрессии BCR-ABL Для оценки изменения уровня экспрессии BCR-ABL на фоне терапии иматинибом наиболее информативно исследование динамики экспрессии BCR-ABL-транскрипта у каждого пациента начиная от момента установления диагноза ХМЛ. Однако на практике не у всех больных удается определить диагностический уровень экспрессии BCR-ABL. В связи с этим в нашем исследовании мы использовали методический подход с определением диагностического (или базового) уровня экспрессии гена BCR-ABL, впервые примененный в многоцентровом исследовании IRIS. Полученное значение медианы экспрессии BCR-ABL применялось для оценки динамики экспрессии BCR-ABL в качестве базового (диагностического) значения. Экспрессия гена BCR-ABL была определена у 35 больных с впервые диагностированным нелеченым ХМЛ в хронической фазе. Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL у этих пациентов составил от 7150 до 624 487 копий BCR-ABLx 106/копий ABL (табл. 2). Медиана экспрессии BCR-ABL у больных с впервые выявленным ХМЛ составила 161 104 копий BCR-ABLx106/копий ABL и была принята за величину базового уровня.
На сегодняшний день данные мировой литературы сводятся к тому, что представление экспрессии гена BCR-ABL в абсолютных числах малоинформативно. Клиническое значение имеет динамика изменений относительно начального базового уровня. Для удобства представления данных по изменению уровня экспрессии BCR-ABL в динамике были использованы логарифмическая [41] и международная шкалы измерений [8].
ПЦР в реальном времени в оценке МОБ При изучении МОБ в рамках нашего исследования в группе пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана значений экспрессии гена BCR-ABL по данным количественной ПЦР в реальном времени составила 1047
Таблица 2. Экспрессия гена BCR-ABL на этапе диагностики и в динамике наблюдения
пациентов с ХМЛ, выраженная в абсолютных значениях (BCR-ABLx106/ABL), по логарифмической (А^) и международной (% 1Б) шкалам
Экспрессия БСЯ-АБЬ в группах Показатель 1-я (п=35) 2-я (п=35) 3-я (п=30)
БСЯ-АБЬ х106/ АБЬ БСЯ-АБЬ х106/ АБЬ % 18 БСЯ-АБЬ х106/АБЬ % 18
Медиана 161 104
Максимальное значение 624 487
Минимальное значение 7150
1047 3,64 0,1 46 029 0,95 4,6
5753 4,97 0,57 536 205 2,29 53,6
0 1,21 0 428 0,76 0,04
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
копий BCR-ABLx 106/копий ABL (диапазон значений от 0 до 5753 копий BCR-ABLx106/копий ABL). По логарифмической шкале измерений медиана снижения уровня экспрессии BCR-ABL относительно начального базального уровня экспрессии в случае полного цитогенетического ответа была равна 3,64 lg. При анализе структуры молекулярного ответа (см. рис. 1) установлено, что при полном цитогенетическом ответе в 53% случаев происходило снижение экспрессии BCR-ABL более чем на 3 lg по сравнению с начальным базовым уровнем, в 25% случаев - на 2—2,99 lg, в 22% случаев — на 1—1,99, в 0% случаев — менее чем на 1 lg. Таким образом, у большинства больных с полным цитогенетическим ответом (78%) отмечено снижение экспрессии BCR-ABL более чем на 2 lg по сравнению с начальным базовым уровнем. По международной шкале измерений в группе пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 0,1%, максимальное значение экспрессии гена — 0,57%, а минимальное значение — 0%.
Из 35 больных с полным цитогенетическим ответом у 26 (74,2%) методом количественной ПЦР в реальном времени был обнаружен остаточный опухолевый клон клеток. В этой подгруппе пациентов с обнаруженной МОБ медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 1326 копий BCR-ABLx 106/копий ABL, или 0,13%. Минимальное значение экспрессии гена BCR-ABL у больных с полным цитогенетическим ответом — 112 копий BCR-ABLx106/копий ABL, а максимальное — 5753 копий (см. табл. 2).
На основании полученных нами результатов в рамках проведенного исследования стало очевидно, что данных СЦИ (чувствительность 1:10-2 клеток) недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию има-тинибом. Это наиболее актуально для пациентов, достигших не только полной клинико-гематологической ремиссии, но и полного цитогенетического ответа [14, 16].
Real-time ПЦР в оценке экспрессии гена BCR-ABL у пациентов, резистентных к иматинибу
В группе пациентов, соответствующих критериям резистентности к иматинибу [8], медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 46 029 копий BCR-АBLx106/копий ABL, максимальное значение — 536 205 копий BCR-ABLx106/копий ABL, минимальное — 428 копий. Медиана снижения уровня экспрессии BCR-ABL относительно начального базального уровня экспрессии по логарифмической шкале — 0,95 lg. При анализе структуры молекулярного ответа (см. рис. 1) в 16% случаев наблюдалось снижение экспрессии BCR-ABL на 2—2,99 lg по сравнению с начальным базовым уровнем, в 37% случаев — на 1—1,99 lg, в 47% — менее чем на 1 lg. По международной шкале (IS) в этой группе пациентов медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 4,6%, максимальное значение экспрессии соответствовало 53,6%, а минимальное — 0,04%.
СЦИ является общепринятым подходом для оценки ответа на терапию иматинибом. В соответствии с этим важное значение имеет вопрос о возможности сопоставления результатов СЦИ и данных количественной ПЦР в реальном времени. Мы установили степень корреляции между результатами этих исследований в изученных группах пациентов. В первом случае результаты молекулярно-генетического исследования были выражены в абсолютных числах копий BCR-ABLx106/копий ABL и ко-
эффициент корреляции составил 0,54. Во втором случае результат, полученный при количественном исследовании образцов периферической крови методом ПЦР в режиме реального времени, отображали в виде десятичного логарифма снижения экспрессии по отношению к базовому уровню; коэффициент корреляции при этом составил 0,83.
Полученные данные свидетельствуют о высокой корреляции между результатами цитогенетического и молекулярно-генетического анализов и целесообразности применения количественной ПЦР в реальном времени для диагностики и мониторинга терапии ХМЛ как на стадии обнаружения Ph-хромосомы стандартным цитогенетическим методом, так и, безусловно, на стадии полного цитогенетического ответа. Более высокий коэффициент корреляции при выражении результатов realtime ПЦР в виде десятичного логарифма снижения (Alg) экспрессии по отношению к базовому уровню свидетельствует о более высокой клинической значимости интерпретации полученных результатов этим способом, подтверждая тем самым данные мировой литературы.
Мутационный анализ
Мутационный анализ проводился в группе резистентных к иматинибу пациентов (n=23) методом прямого секвенирования кДНК, полученной в результате реакции ОТ РНК. В результате проведенного исследования у 5 (21,7%) пациентов обнаружены следующие мутации: L248V (n=2), M244V +M351T (n=1), T315I (n=1), L248V + F359C (n=1) (рис. 2). Выявленные мутации, несомненно, имеют клиническое значение, поскольку связь их с резистентностью к иматинибу уже доказана в тестах in vitro и в ряде клинических исследований. Так, в исследованиях in vitro данные мутации приводят к повышению показателя IC50 — концентрации иматиниба, снижающей на 50% тирозинкиназную активность фермента Abl в биохимическом тесте и пролиферативную активность Ph-позитивных клеточных линий.
Мутация L248V способствует замене лейцина на валин в Р-петле тирозинкиназы Bcr-Abl, что приводит к изменению пространственной конформации белка и, как следствие, снижению эффективности иматиниба. Мутация в положении L248 обусловливает развитие высокого уровня резистентности, о чем свидетельствует повышение IC50 в тесте на пролиферативную активность более чем в 30 раз [43].
Мутация M244V вызывает замену метионина в 244-м положении на валин в Р-петле тирозинкиназы Bcr-Abl. В исследованиях A. Corbin и соавт. [44] T O’Hare и соавт. [45] была доказана роль мутации M244V в снижении чувствительности и развитии резистентности.
Мутация M351T (замена метионина на треонин в 351-м положении), по данным N. Shah и соавт. [28], T O’Hare и соавт. [46], приводит к умеренному снижению чувствительности к иматинибу. Однако у одного из наших больных мутация M351T была обнаружена в комбинации с мутацией M244V, что, возможно, потенцирует еще большую степень резистентности.
У 1 пациента выявлена мутация T315I, вызвавшая замену треонина в 315-м положении на изолейцин. По современным данным эта мутация обусловливает практически полное отсутствие чувствительности к има-тинибу и высочайшую степень резистентности у пациентов с ХМЛ [28, 34, 44—47].
Рис. 2. Результаты секвенирования кДНК пациентов, резистентных к иматинибу, демонстрирующие мутации L248V(a), V244V(6), M351T (в), T315I (г), F359C (д)
Мутация Б359У (замена фенилаланина в 359-м положении на цистеин) нарушает водородные связи между пиперазиновым кольцом иматиниба и Вег-АЫ-киназой и чаще наблюдается у пациентов с ХМЛ в рецидиве [28]. Б359У-мутация вызывает слабое снижение чувствительности к иматинибу - в 1,8 и 2,8 раза в биохимическом и пролиферативном тестах соответственно.
Таким образом, полученные нами данные позволили выявить ряд мутаций гена BCR-ABL, обусловливающих резистентность к иматинибу. Их обнаружение рассматривается экспертной группой ELN как признак неблагоприятного прогноза и основание для модификации терапии, проводимой пациентам с мутациями киназного
домена BCR-ABL: повышение дозы иматиниба, переключение на терапию ИТК II поколения или, в случае панрезистентной мутации T315I, перевод с консервативной терапии на программу трансплантации стволовых кроветворных клеток.
Так, в одном из изученных нами случаев пациент с резистентностью к иматинибу (отсутствие какого-либо цитогенетического ответа после 6 мес терапии иматини-бом в дозе 400 мг/сут) и мутацией L248V в киназном домене BCR-ABL был включен в клиническое исследование эффективности препарата II поколения ИТК - нилоти-ниба (Тасигна, «Novartis Pharma»; исследование CAMN107A2109, руководитель Центра — профессор
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
Ю.В. Шатохин). В результате терапии нилотинибом в дозе 800 мг/сут больной достиг полного цитогенетического ответа через 1 мес и большого молекулярного ответа — через 3 мес терапии.
В другом случае пациенту с резистентностью к иматинибу (отсутствие цитогенетического ответа после 12 мес терапии иматинибом в дозе 400 мг/сут) и мутацией Т3151 было рекомендовано проведение аллоген-ной трансплантации костного мозга, поскольку выявление данной мутации предполагает резистентность ко всем известным ИТК, прошедшим клинические испытания.
В остальных 3 случаях больных не удалось включить в клинические исследования ИТК II поколения, поэтому им была повышена доза иматиниба до 600 мг/сут, хотя наиболее оптимальным был бы переход с терапии иматинибом на терапию, например, нилотинибом. Заключение
Корректный мониторинг лечения ХМЛ в настоящее время должен включать как цитогенетические, так и молекулярные исследования МОБ (определение уровня экспрессии BCR-ABL, поиск мутаций гена BCR-ABL-киназы) и проводиться на регулярной основе. СЦИ необходимо проводить 1 раз в 6 мес до достижения полного цитогенетического ответа, а затем 1 раз в год. Молекулярно-генетические исследования методом количественной ПЦР в реальном времени должны выполняться 1 раз в 3 мес. Определение мутаций киназного домена гена BCR-ABL следует выполнять у всех пациентов, являющихся резистентными к терапии иматинибом, в соответствии с критериям ELN.
Особую важность молекулярные исследования приобретают после достижения полного цитогенетического ответа, поскольку их результаты являются единственным способом мониторинга МОБ. Так, в нашем исследовании было показано, что в достаточно высоком проценте случаев пациенты с ХМЛ, достигшие полного цитогенетического ответа, сохраняют BCR-ABL-позитивный клон лейкозных клеток. Даже понятие «полный молекулярный ответ», когда BCRABL-транскрипт не определяется, должно использоваться осторожно. Применение этого термина предполагает абсолютное отсутствие лейкозных клеток, между тем даже данные молекулярных исследований могут быть обманчивы. Отчасти это связано с вариабельностью чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени [21] и в большей степени обусловлено тем, что значительное число опухолевых клеток может присутствовать в организме больного, когда BCR-ABL
транскрипт не определяется стандартными методами молекулярного анализа [14].
Также большую роль играет то, что в условиях полного цитогенетического ответа увеличение экспрессии гена BCR-ABL является неблагоприятным фактором, указывающим на возможность развития рецидива, и вполне служит показанием для проведения стандартного цитогенетического и мутационного анализа.
Наиболее высокая степень корреляции наблюдается между результатами СЦИ и количественной ПЦР в реальном времени, выраженных в виде десятичного логарифма снижения (Alg) экспрессии по отношению к начальному базовому уровню. Кроме того, клинически информативно выражение результатов количественной ПЦР в процентном соотношении гена BCR-ABL к гену-нормализатору ABL. Несмотря на значительный разброс значений экспрессии гена BCR-ABL, отмечены достоверные различия в значениях экспрессии гена BCR-ABL в соответствии с цитогенетическим ответом.
Молекулярно-генетический мониторинг позволяет проводить первичный скрининг пациентов, нуждающихся в анализе мутаций гена BCR-ABL. Резистентные к има-тинибу пациенты с ХМЛ в большинстве случаев характеризуются высоким уровнем экспрессии гена BCR-ABL, что часто ассоциируется с наличием мутаций в киназном домене гена BCR-ABL. Мутации обусловливают снижение активности иматиниба и даже, в случае T315I, полностью блокируют его действие.
Результаты секвенирования гена BCR-ABL у пациентов, резистентных к иматинибу, должны стать общедоступными для врачебной практики. Обнаружение различных мутаций киназного домена гена BCR-ABL позволяет рационализировать тактику терапии ХМЛ: повысить дозу иматиниба, перейти на терапию ИТК II поколения, рекомендовать экспериментальную терапию или воспользоваться программой трансплантации костного мозга. Для молекулярно-генетических лабораторий, занимающихся мониторированием лечения ХМЛ методом real-time ПЦР, мутационный анализ возможен, поскольку в обоих случаях используются одни и те же образцы кДНК.
Таким образом, комплекс молекулярно-генетических технологий для мониторинга терапии ХМЛ ИТК должен включать как минимум количественный метод ПЦР в режиме реального времени для отслеживания в динамике уровня экспрессии BCR-ABL-транскрипта и секвенирование кДНК гена BCR-ABL с целью исследования мутационного статуса у пациентов, резистентных к иматинибу
Литература
1. O’Brien S.G., Guilhot F., Larson R.A. et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003; 348:994— 1004.
2. Hehlmann R., Hochhaus A.,
Baccarani M. Chronic myeloid leukaemia. Lancet 2007;370:342—50.
3. Jabbour E., Cortes J.E., Giles FJ. et al. Current and emerging treatment options in chronic myeloid leukemia. Cancer
2007;109:2171-81.
4. Goldman J.M. How I treat chronic myeloid leukemia in the imatinib era. Blood 2007;110:2828-37.
5. Gratwohl A., Brand R., Apperley J. et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia in Europe 2006: transplant activity, longterm data and current results. An analysis by the Chronic Leukemia Working Party of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT).
Haematologica 2006;91:513—21.
6. Baccarani M., Russo D., Rosti G. et al. Interferon-a for chronic myeloid leukemia. Semin Hematol 2003;40:22—33.
7. Baccarani M., Martinelli G., Rosti G. et al. Imatinib and pegylated human recombinant interferon-a2b in early chronic-phase chronic myeloid leukemia. Blood 2004;104:4245—51.
8. Зарицкий А.Ю., Ломаиа Э.Г. Перспективы фармакотерапии ХМЛ. Эффект фармакотер 2006;1:38—42.
9. Baccarani M., Saglio G., Goldman J. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European Leukemia Net. Blood 2006;108:1809—20.
10. Туркина А.Г., Челышева Е.Ю. Цитогенетический и молекулярный ответ — ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+^ро-ническим миелолейкозом. Фарматека 2004;18(95).
11. Мисюрин А.В., Аксенова Е.В., Крутов А.А. и др. Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза. Гематол трансфузиол 2007;2:35—40.
12. Челышева Е.Ю., Туркина А.Г., Мисюрин А.В., Захарова А.В. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня BCR-ABL-транскрипта у больного хроническим миелолейкозом. Гематол трансфузиол 2007;2:50—1.
13. Kaeda S.A., Chase A., Goldman J.M. Cytogenetic and molecular monitoring of residual desease in chronic myeloid leukemia. Acta Hematol 2002;107:64—75.
14. Goldman J.M. Chronic myeloid leukemia-still a few questions. Exp Hematol 2004;32:2—10.
15. Marin D., Marktel S., Szydlo R. et al. Survival of patients with chronic phase chronic myeloid leukemia after failed response to interferon-alfa. Lancet 2003;362:617—9.
16. Hughes T., Branford S. Molecular monitoring of BCR—ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia. Blood Reviews 2006;20:29—41.
17. Hughes T., Deininger M., Hochhaus A. et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108(1):28—37.
18. Kawasaki E.S., Clark S.S., Coyne N.Y. et al. Diagnosis of chronic myelogenous and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc Nat Acad Sci USA 1988;85:5698—702.
19. Morgan G.J., Hughes T., Janssen J.WG. et al. Polymerase chain reaction for detection of residual leukaemia. Lancet 1989;1:928—9.
20. Hughes T.P, Morgan G.J., Martiat P et al. Detection of residual leukemia after bone marrow transplantation: role of PCR in predicting relapse. Blood 1991;77:874—8.
21. Hughes T., Kaeda J., Branford S. et al. Frequency of major molecular response to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003;349:1423—32.
22. Branford S., Hughes T.P, Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in
blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics. Br J Haematol 1999;107:587-99.
23. Merx K., Muller M.C., Kreil S. et al. Early reduction of BCR-ABL mRNA transcript levels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of interferon alfa. Leukemia 2002;16:1579-83.
24. Branford S., Rudzki Z., Harper A. et al. Imatinib produces significantly superior molecular responses compared to interferon alfa plus cytarabine in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase. Leukemia 2003;17:2401-9.
25. Wang L., Pearson K., Ferguson J.E. et al. The early molecular response to imatinib predicts cytogenetic and clinical outcome in chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol 2003;120: 990-9.
26. O'Brien S., Guilhot F., Larson R. et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003;348:994-1004.
27. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102:276-83.
28. Shah N., Nicoll J., Nagar B. et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002;2:117-25.
29. Gambacorti-Passerini C., Gunby R., Piazza R. et al. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia chromosome-positive leukaemias. Lancet Oncol 2003;4:75-85.
30. Kreill S., Mueller M., Hanfstein B. et al. Management and clinical outcome of CML patients after imatinib resistance associated with ABL kinase domain mutations. Blood 2003;102:71.
31. Shah N., Sawyers C. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias. Oncogene 2003;22:7389-95.
32. Al-Ali H., Heinrich M., Lange T. et al. High incidence of BCR-ABL kinase domain mutations and absence of mutations of the PDGFR and KIT activation loops in CML patients with secondary resistance to imatinib. Hematol J 2004;5:55-60.
33. Hochhaus A., La Rosee P. Imatinib therapy in chronic myelogenous leukemia: strategies to avoid and overcome resistance. Leukemia 2004;18:1321-31.
34. Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party
on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res 2006;12(24):7374—9.
35. Branford S. Chronic myeloid leukemia: molecular monitoring in clinical practice. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007:376—83.
36. Hughes T., Deininger M., Hochhaus A. et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006;108(1):28—37.
37. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002;16:2190—6.
38. Roche-Lestienne C., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. et al. Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment. Blood 2002;100:1014—8.
39. Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al. The BCR/ABL tyrosine kinase induces production of reactive oxygen species in hematopoietic cells. J Biol Chem 2000;275(32):24273—8.
40. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162(1):156—9.
41. Branford S., Rudzki Z., Parkinson I. et al. Real-time quantitative PCR analysis can be used as a primary screen to identify patients with CML treated with imatinib who have BCR-ABL kinase domain mutations. Blood 2004;104:2926—32.
42. Branford S., Hughes T. Diagnosis and monitoring of chronic myeloid leukemia by qualitative and quantitative RT-PCR. Methods Mol Med 2006;125:69—92.
43. Burgess M., Skaggs B., Shah N. et al. Comparative analysis of two clinically active BCR-ABL kinase inhibitors reveals the role of conformation-specific binding in resistance. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:3395—400.
44. Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. Several BCR-ABL kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 2003;101(11):4611 —4.
45. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110(7):2242—9.
46. O'Hare T., Walters D., Stoffregen E. et al. In vitro activity of Bcr-Abl inhibitors AMN107 and BMS-354825 against clinically relevant imatinib-resistant Abl kinase domain mutants. Cancer Res 2005;65:4500—5.
47. Gorre M., Mohammed M., Ellwood K. et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science 2001;293:876—80.
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 4 ’2 0 0 8
