CC BY
50
УДК 612.117.7+616.155.392
В. Б. Матпюшичев, В. Г. Шамратпова
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2003, вып. 1 (№3)
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БИЛИРУБИНА И ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА В КРОВИ
НА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКУЮ ПОДВИЖНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ
Электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ) как показатель, существенный для сохранения суспензионной устойчивости и оптимальных реологических свойств крови, относится к числу фундаментальных, жизненно важных характеристик клеток красной крови [6]. Значительный интерес представляет выяснение механизмов поддержания стабильности среднего уровня этого параметра. Полагают, что колебания ЭФПЭ отражают главным образом специфику изменений клеточной поверхности [2], морфофункциональный статус мембран эритроцитов [3]. Между тем очевидно, что их состояние определяется не только особенностями самих эритроцитов. Определенную роль здесь, по-видимому, играет и корректирующее действие факторов плазмы. Поэтому закономерности таких влияний важны для понимания специфики рёгудйции ЭФПЭ in situ. В настоящей работе мы изучали зависимость ЭФПЭ от концентрации в крови билирубина и перекиси водорода — метаболитов, активных в отношении мембранных структур.
Материал и методика
Для изучения электрокинетических эффектов билирубина исследовали пробы крови здоровых доноров (га = 48), доноров, прошедших 3-кратную иммунизацию стафилококковым анатоксином (тг = 16), и лиц с заболеваниями почек (га = 66). Действие Н2О2 in vitro анализировали на образцах крови 11 студентов —до и после экзамена. Контролем в опытах in vitro служили показатели крови 10 студентов, находившихся в состоянии эмоционального покоя. Содержание общего билирубина и его фракций в плазме крови определяли стандартными клиническими методами [1]. Для измерения ЭФПЗ 0,02 мл капиллярной крови разбавляли (1:200) 0,1 моль/л фосфатным буфером рН 7,4. Микроэлектрофорез проб проводили при 25°С на установке «Пармоквант-2» в автоматическом режиме. На основе учета для каждого образца крови 300 показаний индивидуальной подвижности клеток производили расчеты характеристик распределения ЭФПЭ в каждой анализируемой пробе и в целом по группам обследуемых. Помимо средних значений признака оценивались коэффициенты асимметрии (As) эритрограмм. Перекись водорода вносили в среду разведения до конечной концентрации 10~4 моль/л и экспонировали аликвоты крови в течение 10 мин. О достоверности различий средних судили по значениям критерия Стьюдента. Корреляционный и регрессионный анализ данных производили с использованием пакета программ Statistica.
Результаты и обсуждение
-Среди химических компонентов плазмы, способных оказывать корректирующее действие на циркулирующие в крови клетки, особо следует выделить пигмент билирубин, представляющий собой продукт деградации гемоглобина, миоглобина и цито-хромов, в неконъюгированной форме известный своей токсичностью. Поскольку при многих заболеваниях его содержание в плазме крови существенно возрастает, влияние билирубина на поверхностные свойства эритроцитарных мембран весьма вероятно. Действительно, имеются сведения об уменьшении ЭФПЭ при гипербилирубинемии [5]. С этими фактами, однако, диссонируют данные об отсутствии линейных корреляций
© В. Б. Матюшичев, В. Г. Шамратова, 2003
между уровнем билирубина и средней подвижностью эритроцитов у больных с патологией гепатобилиарной системы. Мы исследовали взаимосвязи между изменением уровня билирубина и ЭФПЭ в крови как у здоровых людей, так и у больных с различной формой нефропатологии, а также у лиц, иммунизированных стафилококковым анатоксином. *
В общей матрице показателей, отмеченных у здоровых людей и у больных с заболеваниями почек, как и раздельно в контрольной группе, достоверных изменений средних ЭФПЭ параллельно варьированию концентрации общего билирубина в крови нам обнаружить не удалось. В то же время как в суммарной выборке, так и у больных людей наблюдается положительная корреляция между содержанием билирубина в крови и Ав электрокинетических эритрограмм, аппроксимируемая полиномиальным уравнением регрессии (рисунок). В обоих случаях концентрациям билирубина менее 10 мкмоль/л соответствуют отрицательные Ав распределения, а значениям выше этой величины — положительные Ав гистограмм ЭФПЭ. Другими словами, при повышении в крови концентрации общего билирубина в ней увеличивается относительная доля клеток с пониженным электрокинетическим потенциалом. Обратная зависимость у больных людей также достоверна и принципиально не отличается от рассмотренной: с накоплением в кровотоке субпопуляций клеток, обладающих низкой ЭФПЭ, содержание билирубина в плазме возрастает.
§ -0,05 :
е -о,ю -п
^ -0,15 --0.20-
Билирубин, мкмоль/л
Зависимость величины коэффициента Ав распределения ЭФПЭ от концентрации общего билирубина в плазме крови здоровых людей и больных, страдающих нефропатологией.
Данные, отражающие уровни ЭФПЭ и концентрации билирубина в крови доноров, прошедших 3-кратную иммунизацию стафилококковым анатоксином, и обычных доноров, приведены в табл. 1. Из нее видно, что у иммунизированных доноров ЭФПЭ достоверно снижена, а содержание общего билирубина практически не отличается от контрольных значений, тогда как концентрация прямого билирубина существенно повышена. Проведенный по общей матрице данных обеих групп доноров корреляционный анализ выявил существование достоверной отрицательной связи ЭФПЭ с содержанием прямого билирубина (г = — 0,61).
Можно допустить, что фиксируемые нами электрогенные эффекты являются результатом непосредственного влияния билирубина на состояние эритроцитов, реализуемого через активацию свободнорадикальных процессов в эритроцитарной мембране и сопряженные с этим структурно-метаболические расстройства. При этом, согласно нашим данным, эритроциты различных субпопуляций отличаются по устойчивости
Таблица 1. Показатели крови в норме и при иммунизации стафилококковым анатоксином
Показатель » Группа доноров
обычные иммунизированные
ЭФПЭ, мкмсм/с-В Общий билирубин, мкмоль/л Прямой билирубин, мкмоль/л 1,29=1=0,04 7,9±0,1 1,6±0, 1 1,12=1=0,03* 9,8±0,7 2,4±0,3*
* Достоверно отличается от контроля, р < О, Ь5.
к повреждающему действию биопйгмента. Отсутствие линейных корреляций между средней ЭФПЭ и уровнем билирубина при заболеваниях печени, по всей видимости, объясняется не только более сложным характером зависимости между этими показателями, но и различной чувствительностью отдельных клеток к действию интоксикан-та, выявляемой только при анализе динамики ЭФПЭ на субпопуляционном уровне. Об участии эндотоксинов (в том числе и билирубина) в нарушении свойств мембран эритроцитов и их электрокинетического потенциала при патологии гепатобилиарной системы свидетельствует возможность коррекции ЭФПЭ с помощью веществ, связывающих накапливающиеся в крови токсические продукты [7]. Не исключено, однако, что причины снижения ЭФПЭ на фоне роста концентрации прямого билирубина не столь однозначны. Возможно, отмеченные сдвиги являются следствием общих нарушений структурно-функциональной организации биологических мембран клеток разных типов (в частности, эритроцитов и гепатоцитов). Снижению ЭФПЭ может способствовать и адсорбция поверхностью эритроцитов циркулирующих в крови антител.
С другой стороны, уровень билирубина в плазме крови, отражающий интенсивность деструктивных процессов в системе эритрона, позволяет судить о резистентности эритроцитов. Не случайно усиление экскреции билирубина наблюдается вслед за поступ-. лением в сосудистое русло молодых эритроцитов и ретикулоцитов при напряженном ' эритропоэзе. В этой связи правомерно допустить, что наблюдаемые нами взаимосвязи могут свидетельствовать не столько о непосредственном влиянии билирубина на циркулирующие в сосудистом русле эритроциты, сколько об ускоренном разрушении эритроцитов, обладающих низким зарядом поверхности [8]. Очевидно, в случае почечной патологии такой механизм более' вероятен. Во-первых, при нефропатологии возрастание концентрации билирубина в плазме не столь значительно, чтобы вызвать прямое повреждение клеток крови, как, например, при патологии гепатобилиарной системы. Во-вторых, об этом свидетельствуют некоторые косвенные данные: нарушение при нефропатологии энергетического обмена в эритроцитах и проницаемости эритроцитарных мембран [9], анемия. Ускорению элиминации эритроцитов может способствовать также увеличение при заболеваниях почек корпускулярного объема эритроцитов, коррелирующее с изменением ионного равновесия в плазме. Поэтому интенсификацию экскреции билирубина в сосудистое русло можно частично объяснить и ростом в циркуляции доли эритроцитов с пониженной подвижностью, в наибольшей степени подверженных разрушению в селезенке. .
Одним из агрессивных компонентов плазмы, представляющих (как и билирубин) опасность для функционирования эритроцитов, является перекись водорода, которая эндогенно постоянно образуется при неферментативном окислении сульфгидрильных соединений. В связи с этим определенный интерес представляет изучение ее влияния на
электроповерхностные свойства эритроцитов. В табл. 2 приведены данные о действии in vitro Н2О2 в концентрации Ю-4, моль/л на ЭФПЭ крови студентов, находящихся в различном эмоциональном состоянии. Оказалось, что в присутствии перекиси ни в одном из вариантов эксперимента средние значения ЭФПЭ не изменяются достоверно, но в пробах крови стрессированных студентов добавление Н2О2 модифицирует форму кривой распределения подвижности. Причем если воздействие Н2О2 in vitro на эритроциты крови студентов до экзамена приводит к росту в аликвоте доли эритроцитов с пониженным электрокинетическим потенциалом (As растет) без изменения степени гетерогенности популяции, то в образцах крови студентов после экзамена отмечаются увеличение представительства клеток с повышенной ЭФПЭ и возрастание однородности популяции (увеличивается Ех распределения).
Таблица 2. Параметрьх ЭФПЭ до и после внесения Н2О2 в пробы крови студентов
Группа обследуемых; Параметры ЭФПЭ
М ± m As ± ШАв Ex ± ГПЕх
Контроль, 71 ~ 10 До экзамена, п = 11 После экзамена, п= 11 до внесения Н2О2 после внесения Н2О2 до внесения Н2О2 после внесения Н2О2 до внесения Н2О2 после внесения Н2О2 1,24±0,02 1,21±0,01 1,27±0,04 1,22±0,04 1,13±0,06 1,18±0,03 —0,15±0,06 —0,23±0,06 -0,31±0,06 . 0,30±0,06* —0,09±0,06 —0,37±0,06* 0,19±0,12 0,37±0,12 0,35±0,12 0,23±0,12 —0,33±0,12 0,18±0,12*
* Достоверно отличается от исходного уровня, р < 0,05.
То есть при использованной концентрации перекись водорода в условиях in vitro влияет на стресс-эритроциты избирательно: практически не затрагивая их статус в норме, она разнонаправленно (в зависимости от состояния организма) изменяет характеристики модифицированной структуры популяции. .Действие Н2О2 на популяцию, обогащенную молодыми эритроцитами, поступившими в циркуляцию при активировании эритропоэза, приводит к прогрессирующему накоплению в крови клеток с . пониженной подвижностью при общей тенденции к снижению ЭФПЭ. Это согласуется как с фактами о качественной «неполноценности» стрес-ретикулоцитов [8], так и с данными, продемонстрировавшими, что перед экзаменами в кровеносном русле одновременно с высокоустойчивыми клетками сосуществуют эритроциты с резко сниженной резистентностью к кислотному гемолизу. В то же время влияние перекиси водорода на популяцию эритроцитов, характеризующуюся в целом низким уровнем биоэлектро-генеза, заключается в стандартизации структуры популяции в направлении уменьшения в ней доли эритроцитов с низкой подвижностью и сохранении при этом клеток, несущих более высокий, чем среднепопуляционный, заряд поверхности. Наблюдаемое здесь изменение структуры популяции правомерно приписать разрушению перекисью , водорода неустойчивых клеток — с пониженной подвижностью в электрическом поле. Правда, приемлема и другая точка зрения, согласно которой увеличение доли клеток с высокой ЭФПЭ при внесении перекиси водорода в аликвоты крови происходит в результате повышения уровня оксигенации НЬ и снижения содержания в эритроцитах MetHb. Однако в этом случае остается неясной причина как сдвига баланса субпопуляций в сторону преобладания клеток со сниженной подвижностью, так и полного отсутствия реакции клеток в контроле при аналогичной концентрации действующего на эритроциты повреждающего агента.
Таким образом, как билирубин, так и перекись водорода при всем различии "природы этих соединений продемонстрировали в целом однотипное влияние на ЭФПЭ. Поэтому допустимо сделать заключение о том, что характер и эффективность проявлений взаимодействия электр^кинетических свойств эритроцитов с компонентами плазмы, по-видимому, определяются многими обстоятельствами: Общим моментом здесь является то, что «электрокинетическая» роль ингредиентов плазмы, малозаметная в норме, возрастает при функциональном напряжении организма и при патологии,сопровождающейся резкими сдвигами состава внутренней среды. Причем активность этих факторов проявляется неравномерно — они неодинаково влияют на отдельные субпопуляции эритроцитов. Этим, по-видимому, и объясняется зависимость корректирующего действия компонентов плазмы от функционального состояния обследуемых, поскольку в физиологических границах именно оно, как показано нами [4], определяет исходную электрокинетическую структуру пула циркулирующих эритроцитов.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым. Summary
Matyushichev V.B., Shamratova V.G. Influence of bilirubin and hydrogen peroxide concentrations in blood on erythrocyte electrophoretic mobility.
The dependence of erythrocyte electrophoretic mobility from bilirubin concentration in human blood and 10~4-mol hydrogen peroxide, brought in samples in vitro was studied. It was shown that the factors did not normally influence electrokinetic properties of red blood cells in norm. Functional strain of organism and nephropathology result in conjugate changes of the erythrocyte populations' structure. In so doing the biological activity of the plasm ingredients becomes apparent unevenly — they arc unevenly effective in reference to the separate subpopulations, and their action depends on initial mobility of erythrocytes.
Литература
1. Делекторская JI.H. Пигменты // Лабораторные методы исследования в клинике. М., 1987. С. 224-228. 2. Еровиченков А.А.; Козинец Г.И., Попова О.В., Садовская Г.В. Изучение электрофоретической подвижности эритроцитов у больных с геморрагической рожей в динамике болезни // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. №10. С. 29. 3. Крылов В.Н., Густое А.В., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов и стресс // Физиология человека. 1998. Т. 24, №6. С. 108-111. 4. Матюшичев В.В., Шамратпова В.Г.^Аху-нова А.Р. Влияние строфантина на электрофоретическую подвижность эритроцитов крови взрослых и детей'// Рос. физиол. жури. им. И.М.Сеченова. 2001. Т. 87, №2. С. 248-253. 5. Савельев B.C.. Филимонов М.И., Александрова Н.П. Реологические свойства крови у больных с механической желтухой // Вестн. АМН СССР. 1987. №9. С. 69-72. 6. Чижевский A.JI. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. Новосибирск, 1980. 7. Шамрато-ва В.Г., Ваширова P.M., Гареев Е.М. Электрокинетические свойства эритроцитов человека при психоэмоциональном напряжении и патологии. Уфа, 1995. 8. Шаъикин А.В., Терское И.А. Продукция и деструкция эритроцитов в организме. Новосибирск, 1986. 9. Соггу В., Lee D., Tuck М. A kinetic study of cation transport in erythrocytes from uremic patients // Kidney Int. 1987. Vol. 32, N 2. P. 256-260.
Статья поступила в редакцию 7 октября 2002 г.
