CC BY
75
УДК 612.117.7+616.155.392
Вестник СПбУ Сер. 3. 2004, вып. 2
В.Б. Матюшичев, В.Г. Шамратова
РОЛЬ АДРЕНАЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ
Вопросы регуляции электрокинетических свойств эритроцитов привлекают внимание в силу их исключительной важности для агрегатного состояния циркулирующей крови и соответственно жизнедеятельности организма в целом [15]. Экспериментально измеряемым показателем, по которому обычно судят об этих свойствах, является электрофоретическая подвижность эритроцитов (ЭФПЭ). Хотя механизмы контроля ЭФПЭ выяснены еще не полностью, с достоверностью установлено, что помимо разнообразных системных влияний они реализуются также на клеточном и плазменном уровнях [ 16]. В подобном аспекте представляют интерес эффекты такого неотъемлемого компонента плазмы, как адреналин. Этот гормон, оказывающий через специфические рецепторы [6] многообразное влияние на эритроцитарную мембрану [12], играет заметную роль в обеспечении адекватных метаболических перестроек в популяциях клеток красной крови. Поскольку их согласованное функционирование осуществляется именно через соответствующие рецепторные структуры эритроцитарной мембраны [4], в настоящей работе нами исследовано «электрогенное» действие адреналина in vitro.
Материал и методика. Использовали образцы крови интактных крыс («=10), студенток 18-20 лет - перед (л=31) и после («= 28) сдачи экзаменов, спортсменов 17-20-летнего возраста («=26) -после физической нагрузки. В контрольные группы воЪли соответственно 10 и 16 клинически здоровых лиц тех же возрастных и половых кондиций. Для измерения ЭФПЭ отбирали 0,02 мл крови. Использовали аутоплазму, разбавленную 1:200 фосфатным буфером, рН 7,4. Определения проводили при 25 °С на установке «Пармоквант-2» - в автоматическом режиме. На базе 300 показаний индивидуальной подвижности клеток, относящихся к каждой из проб крови, производили расчеты характеристик частных распределений ЭФПЭ отдельных проб и в целом по группам. О достоверности различия средних судили по значениям i-критерия. Действие адреналина анализировали через 5 и 25 мин после его внесения в пробы крови, подготовленные для учета ЭФПЭ, до конечной концентрации 10"4, Ю-5 и Ю-6 моль/л; экспозиция проводилась при 37 °С. Использовали 0,1%-ный ампульный раствор адреналина-гидрохлорида.
Результаты и обсуждение. Опыты показали (таблица), что адреналин, вносимый in vitro в пробы крови крыс до конечной концентрации 10"4 или 10"5 моль/л, вызывает повышение средней ЭФПЭ и деформацию профиля гистограммы, выражающуюся, как правило, в увеличении асимметричности и уплощении кривых распределения. При снижении концентрации гормона до Ю-6 моль/л средняя ЭФПЭ достоверно не изменяется, но (как и при более высоких дозах) преобразуется форма электрокинетических эритрограмм. То есть адреналин увеличивает подвижность эритроцитов крови крыс в электрическом поле и/или изменяет исходное соотношение субпопуляций эритроцитов с различными электрокинетическими свойствами. Характерной особенностью действия адреналина in vitro является также рост гетерогенности популяций клеток по их ЭФП.
Результаты модельных опытов с использованием концентрации 10"4 моль/л на пробах крови спортсменов, пребывающих в состоянии относительного физического покоя, также свидетельствуют о повышении среднего уровня ЭФПЭ в присутствии гормона (1,009±006 мкм • см/с • В без- и 1,110±0,004 мкм • см/с • В с адреналином). После выполнения физической нагрузки на фоне сопряженного с ней возрастания ЭФПЭ стимулирующее действие адреналина не обнаруживается. То есть местное действие гормона зависит от исходного
О В.Б. Магпошичев, В.Г. Шамратова, 2004
ЭФПЭ крови крыс при воздействии адреналина in vitro, M±m
Условия опыта Параметры распределения ЭФПЭ
Время, мин Доза гормона, моль/л Мх As Ех
0 1,133±0,004 0,1210,04" -0,0910,09
ю-4 1,16210,004* 0,1110,04 -0,3210,09*
5 ю-5 1,16310,004* 0,2010,04 -0,5110,09*
ю-6 1,141+0,003 -0,4110,04* -0,0110,09
0 1,10210,004 0,0510,04 0,0610,09
ю-» 1,12510,004*. -0,5510,04* 0,1110,09
25 10~5 1,134+0,004* И),3310,04* -0,4210,09*
ю-6 1,11910.004* 0,0710,04 -0,1410,09*
* Достоверное отличие от исходного уровня, р<0,05.
состояния электроповерхностных процессов в эритроцитах, меняющегося при переходе организма в новые условия функционирования.
Поскольку электрический заряд эритроцита в целом соответствует его энергетическому потенциалу [11] и опосредован уровнем метаболизма клеток [3], есть основания связать наблюдаемые реакции с регуляцией ЭФПЭ адреналином через аденилатциклазную систему. Как известно, в эритроцитах ц-АМФ, -выступая в качестве посредника действия гормона, осуществляет координацию и интеграцию важнейших биохимических процессов. В частности, ц-АМФ-зависимая протеинкиназа эритроцитов человека, активируемая в присутствии 10~5 моль/л адреналина [14], вызывает фосфорилирование мембранных белков, регулирующих проницаемость мембран для ионов и содержание в эритроцитах Са2+. Кроме того адреналин оказывает стимулирующее влияние на активность ключевых ферментов гликолиза, являющегося в эритроцитах основным донором АТФ. Учитывая это, а также известный факт о повышении в эритроцитах содержания АТФ при введении в организм адреналина, можно полагать, что наблюдаемые нами in vitro эффекты гормона отчасти реализуются через мобилизацию собственных энергетических ресурсов эритроцитов.
Как уже отмечалось, адреналину принадлежит важная роль в формировании механизмов регуляции, адаптирующих региональные обменные процессы в соответствии с целостными реакциями организма. Он оказывает многообразное влияние на состояние и свойства мембраны эритроцитов [6,14], их осмотическую резистентность, деформируемость и агрегацию [7]. Координированную регуляцию функционирования циркулирующих или вновь поступивших в сосудистое русло клеток красной крови адреналин осуществляет благодаря наличию на эрит-роцитарной плазматической мембране гормональных рецепторов [6]. В этой связи можно ожидать, что при психоэмоциональном напряжении организма адреналин подключается к контролю баланса в кровеносном русле субпопуляций клеток с разным'электрокинетическим потенциалом.
Продемонстрировать особенности реакции эритроцитов на адреналин в этих ситуациях позволили модельные опыты на пробах крови студентов, у которых подвижность эритроцитов регистрировалась в периоды эмоционального покоя и сдачи экзаменов. Как оказалось, при внесении адреналина распределения ЭФПЭ, имеющие в пробах перед экзаменом и в контроле островершинный вид, трансформируются в плосковершинные или двувершинные (рисунок). После экзаменов профиль гистограммы ЭФПЭ обследуемых изменяется в присутствии гормона противоположным образом. Если до внесения в пробы крови адреналина кривые распределения отличались высокой гетерогенностью, то под влиянием гормона они приобретают
sP 0х
t H
o
CO •J
дентов перед экзаменом - до- (/) и после воздействия адреналина (2) in vitro.
В обоих случаях R2=0,97.
относительно островершинный вид. Средний уровень ЭФПЭ при этом, как правило, не изменяется, однако в контрольнойтруппе наблюдается возрастание медианы распределения.
Таким образом, характер индуцируемых гормоном изменений и в этом случае зависит от исходного статуса эритроцитарной популяции; У лиц, пребывающих в состоянии относительного эмоционального и физического покоя, экзогенный адреналин несколько увеличивает подвижность эритроцитов и повышает неоднородность популяции клеток по ЭФП. При росте и снижении уровня ЭФПЭ или/и при перераспределении баланса различных субпопуляций эритроцитов, обусловленного переходом организма в новый функциональный статус, реакция ЭФП клеток красной крови на действие гормона модифицируется, возможно, в силу того, что в процессе адаптации организма к стрессу изменяется чувствительность к агонистам р-адрено-рецепторов эритроцитов [7].
Влияние адреналина in vitro на биоэлектрические процессы в эритроцитах и соответственно поверхностный заряд зависят также от состояния ионного гомеостаза в клетках красной крови. Имеются данные [9,17] о том, что в кровеносном русле циркулируют клетки, отличающиеся по активности Ыа+,К+-АТФазы и скорости пассивного транспорта катионов через мембрану. Видимо, при повышенной активности натриевых насосов в эритроцитах всей популяции или только основной субпопуляции, сочетающейся с относительно высокой подвижностью эритроцитов, как, например, это имеет место у студентов перед экзаменами, действие адреналина не сказывается на средних показателях, но оно преобразует форму распределения эритроцитов по ЭФП. Наблюдаемое в присутствии экзогенного адреналина возрастание гетерогенности эритроцитов по ЭФП является в определенной степени универсальной реакцией, имеющей место при различном исходном уровне электрокинетического потенциала, что связано, очевидно, с неодинаковой интенсивностью метаболизма в отдельных клетках общей популяции.
При нарушении ионного гомеостаза клеток видоизменяется и реакция эритроцитов на экзогенный адреналин. В частности, в наших экспериментах подобное явление может быть вызвано нарастанием в эритроцитах при стрессе метаболических расстройств, сопряженных с истощением энергетических ресурсов клеток. На этом фоне дополнительно внесенный в пробы крови экзогенный адреналин не только не повышает подвижность клеток и/или гетероген-
ЭФПЭ,мкм-см/с - В
Линии тренда распределения эритроцитов по их ЭФП в пробах крови сту-
ность популяции, но и, судя по коэффициенту Ех, увеличивает ее однородность. При достаточно низком уровне средней ЭФПЭ уменьшение функциональной разнокачественности клеток может служить показателем снижения адаптационных резервов эритроцитарной популяции.
Проверить справедливость вывода о существенности роли исходного уровня ЭФПЭ для реакции клеток на экзогенный адреналин позволил корреляционнй анализ. В контроле тесно взаимосвязанными оказались средняя величина ЭФПЭ и дисперсия этого параметра в пробах до- и после внесения адреналина (соответственно г=0,68 и г=0,82). У студентов 1-й группы (получивших высокие оценки на экзаменах) перед экзаменом коррелируют исходный и конечный уровни средней ЭФПЭ (г=0,76), а также дисперсия ЭФПЭ исходных проб со средней подвижностью после внесения адреналина (г= -0,58). У студентов 2-й группы (сдавших экзамен с большим трудом) связь между средними несколько слабее (г=0,61), в то же время отчетливо проявляется зависимость дисперсии ЭФПЭ после внесения адреналина от исходного уровня этого параметра (г= -0,90). Как видно, величина ЭФПЭ, а также дисперсия показателя детерминированы подвижностью клеток и мерой их варьирования в исходных пробах. После экзаменов у испытуемых 1-й группы обнаруживаются взаимосвязи между начальной средней ЭФПЭ и Ех распределения конечной проб (г=0,55), а во 2-й группе, так же, как и до экзаменов, - отрицательная корреляция, правда, более низкого порядка (г= -0,68), между дисперсиями ЭФПЭ.
Корреляционный анализ показал, что в состоянии эмоционального покоя и умеренного психического напряжения клетки с высоким средним уровнем ЭФПЭ реагируют на внесение в пробы адреналина усилением биоэлектрических процессов и ростом дисперсии параметра, а с низким уровнем, напротив, их снижением. После экзаменов у испытуемых зависимость поведения средних ЭФПЭ от их исходного значения утрачиватся, т. е. в новой эмоциональной обстановке изменяется не только реакция эритроцитарных мембран на экзогенный гормон,но и преобразуется система корреляций между начальным и конечным уровнем ЭФПЭ.
Обнаруженное in vitro действие адреналина позволяет отчасти объяснить изменения, возникающие в крови у студентов в состоянии эмоционального стресса и у спортсменов при выполнении ими интенсивной физической нагрузки. Разумеется, экстраполяция полученных в наших наблюдениях данных на условия in vivo, как и интерпретация самих фактов, требуют осторожности. Проведенные эксперименты позволяют лишь предполагать, что поскольку адреналин способен влиять на ЭФПЭ in vitro, он определенным образом влияет на это свойство эритроцитов и в кровотоке. Возрастание ЭФПЭ и/или увеличение доли клеток с повышенным электрокинетическим потенциалом при психоэмоциональном и физическом напряжении организма, вполне возможно, связано с местным действием адреналина на эритроциты. С этих позиций вполне объяснимо неоднозначное поведение ЭФПЭ у студентов после сдачи экзаменов, поскольку последствием чрезмерной экскреции адреналина при усилении эмоционального напряжения организма является истощение метаболических резервов эритроцитов. Анализ параметров ЭФПЭ и проведенные модельные опыты свидетельствуют о нарушении у этой категории обследуемых функционального состояния эритроцитарных мембран и ионного го-меостаза клеток. Подобные изменения наблюдались у абитуриентов, у них также отмечалось достоверное и резкое снижение средней ЭФПЭ на фоне роста дисперсии признака.
Можно допустить существование различных механизмов, обусловливающих изменения электрокинетических свойств и ионного гомеостаза эритроцитов при чрезмерных эмоциональных нагрузках. Помимо истощения энергетических ресурсов эритроцитов, сопровождающегося нарушением работы мембранных насосов в клетках, это может быть связано и с более «прямыми» влияниями. Нельзя, например, исключить, что наблюдаемые после экзамена эффекты вызваны не только исходным состоянием эритроцитов, но и резким возрастанием в крови студентов концентрации адреналина и его массированным воздействием на эритроци-
тарные мембраны. При этом возможно перенасыщение им гормональных рецепторов эритроцитов с последующей модификацией свойств мембран и функционального состояния клеток [2]. Так, при длительных и интенсивных воздействиях адреналина на рецепторы клеток в них чрезмерно возрастает концентрация кальция [1]. Эту точку зрения подтверждает независомое испытание влияния in vitro адреналина в различных концентрациях [8]: если адреналин использовался в концентрации, соответствующей физиологической норме, то ЭФПЭ существенно не изменялась; повышение же концентрации гормона в 10 раз, что якобы соответствует уровню адреналина в кровеносном русле при стрессе [8], сопровождалось существенным снижением подвижности эритроцитов в электрическом поле. Аналогичное влияние in vitro высоких, заведомо нефизиологичных доз адреналина отмечалось и в других работах.
Вполне вероятно и то, что обнаруженные у студентов и спортсменов нарушения эритро-цитарныХ мембран частично опосредуются через активацию процессов свободнорадикально-го окисления, являющегося первичным медиатором стресса [5]. Известно, например, что адреналин в высоких, нефизиологических дозах увеличивает концентрацию свободных радикалов в эритроцитах и повышает скорость окислительных процессов в их мембранах. К тому же пик наибольшей активности реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) совпадает с наиболее высоким уровнем катехоламинов в крови. Смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в направлении интенсификации процессов ПОЛ влечет за собой нарушение структуры и свойств эритроцитарных мембран. Возрастает их пассивная катионная проницаемость, тогда как активный транспорт вследствие инактивации мембранных липидзависимых ферментов, в наибольшей степени Na+, К+-АТФазы [13], ослабляется [10]. В конечном счете указанные процессы способствуют изменению биоэлектрических характеристик эритроцитов и соответственно их электрокинетических свойств.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым. Summary
Matyushichev V.B., Shamratova V.G. Role of adrenalin in regulation of electrokinetic properties of erythrocytes.
The influence of exogenous adrenalin at final concentrations equal to 10ц-1 O^-mol/l on electrophoretic mobility of human and rat erythrocytes was studied. It was shown that in the presence of the hormone the mobility of rat erythrocytes in electrical field increased and/or the side-view of the curve of cell distribution on their electrokinetic properties changed in form. When used the concentration 1 O^-mol/l.the character of changes induced by the hormone in samples of human blood depended on the initial status of the erythrocyte populations.
Литература
1. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки // Соросовский образоват. журн. 2000. Т.6, №9. С.2-9.2. Голенда ИЛ., Казин Э.М., Галеев А.Р. и др. Поиск взаимосвязей между параметрами кинетики кислотного гемолиза эритроцитов и функциональным состоянием организма // Физиол. человека. 1996. №4. С. 130-136. 3. Голованов М.В. Анализ строения двойного электрического слоя живой клетки // Биофизика. 1995. №2. С.372-376. 4. Зарянова Т.Н., Лаврова В.М. Влияние низкоэнергетического лазерного излучения на интенсивность ПОЛ // Вопросы мед. химии. 1994. №2. С.31-33. 5. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Усп. совр. биол. 1993. №3. С.286-296.6. Казенное A.M., Маслова М.Н. Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова 1987. №12. С.1587-1599. 7. Колобова Е.В., Дворянский С.А., Циркин В.И. Оценка бета-реактивности эритроцитов у рожающих женщин // Физиол. человека.-1998. №3. С. 134-142. 8. Крылов В.Н., Густое А.В., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов и стресс // Физиол. человека. 1998. №6. С. 108—111. 9. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. Новосибирск, 1987.10. Медведева И.А., Маслова М.Н., Панов А. А. Влияние гипотермического
стресса на активность Na+, К+-АТФазы эритроцитов крыс // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1992. №11. С.119-124.11. Овчаренко Ф.Д., Ульберг З.Р., Духин А.С. и др. Особенности электроповерхностных явлений в клеточных суспензиях//Усп. совр. биол. 1991. №2. С. 276-281.12. Орлов С.Н., Новиков КН. Регуляция объема: механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1996. №8-9. С.1—15. 13. Рожковский Я.В., Кресюн В.И. Активность маркерных ферментов и состояние липидного матрикса мембран эритроцитов при стрессе и его медикаментозной коррекции // Укр. биохим. журн. 1991. №4. С.74-80.14. Черницкий Ё.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск, 1981. 15. Чижевский А.Л. Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. Новосибирск, 1980. 16. Шамратова В.Г. Регуляция электрокинетических свойств эритроцитарных популяций при различном функциональном состоянии организма: Автореф. канд. дис. Казань, 2002\ 32 с. 17. Maede J., Inaba М. Na+,K+-ATPase an ouabain binding in reticulocytes from dogs with high К and low К erythrocytes and their changes during maturation // J. Biol. Chem. 1985. Vol.260. P.3337-3343.
Статья поступила в редакцию 14 декабря 2003 г.
