CC BY
43
/УДК 616-005.1-036.882-08:616.155.3-008.13-092.9
ВЛИЯНИЕ КЛИНИЧЕСКОЙ СМЕРТИ ОТ ОСТРОЙ КРОВОПОТЕРИ НА СОСТОЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ЦИТОКИНОВОЙ ПРОДУКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Д.А. ЕНИКЕЕВ, Е.А. НУРГАЛЕЕВА, Л.В.НАГАЕВА, Н.В. НУРГАЛЕЕВ, М.А. АЛЕКСАНДРОВ*
Целью экспериментального исследования являлось изучение состояния фагоцитоза и уровня провоспалительных цитокинов на протяжении 35 суток после смертельной кровопотери. Эксперимент выполнен на 210 беспородных белых крысах массой 190-220 г под кетаминовым наркозом (2 мг/кг). На протяжении всего периода наблюдения выявлялись нарушения в системе фагоцитоза, что проявлялось снижаем фагоцитарного числа, изменением фагоцитарного индекса. Клеточные реакции в ранние сроки после оживления проявлялись нейтрофильным лейкоцитозом, а в поздние сроки - моно-цитозом. Стойкое повышение содержания провоспалительных ци-токинов (а-ФНО) на протяжении всего периода после оживления сопровождалось изменениями фагоцитарной активности крови. Ключевые слова: реанимация, животные, цитокины, фагоцитоз
Общеизвестно, что устойчивость организма к экстремальным повреждениям, токсическим агентам в значительной мере определяется его неспецифической резистентностью и, в частности, состоянием системы фагоцитоза. Развитие экстремальных состояний сопровождается сложной структурно-функциональной перестройкой клеточных элементов системы фагоцитов, играющей ключевую роль в исходе постагрессивных состояний [1,6]. Спад функциональной активности фагоцитов у больных отделений интенсивной терапии в раннем постреанимационном периоде (3 сутки) относится к фактору риска летального исхода [9].
Принципиально важную роль в развитии системных расстройств метаболизма играют медиаторные системы и, в первую очередь, цитокины. Секретируемые цитокины способствуют непрерывной активации всех типов иммуннокомпетентных клеток, отвечающих за противоинфекционную защиту. Любая антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов «первого поколения» -интерлейкина 1 (1Ь-1), интерлейкина 6 (1Ь-6), фактора некроза опухоли - а (а-ФНО), которые индуцируют биосинтез цитокинов «второго поколения»- 1Ь-2, 1Ь-3 и др. Цитокины «второго поколения» вновь оказывают влияние на биосинтез ранних цитокинов, что не только регулирует иммунный ответ, но и усиливает его, вовлекая в реакцию все возрастающее количество клеток. Бесконтрольно выделяемые цитокины превращаются из факторов иммунной защиты организма в факторы агрессии. Именно «цитокиновая буря» ведет к микротромбозам сосудов и нарушению микроциркуляции, способствует системной вазоди-лятации, патологическому депонированию крови, прогрессирующей гиповолемии, что усугубляет тяжесть состояния [4,9].
Цель исследования - изучение состояния фагоцитоза и цитокинов для выяснения патогенетических механизмов нарушения неспецифической резистентности организма в постреанима-ционном периоде от острой кровопотери.
Материал и методы исследования. Эксперимент проведен на 210 половозрелых неинбредных крысах-самцах массой 190220 г под кетаминовым наркозом (2 мг/кг). Клиническую смерть продолжительностью 6 мин вызывали острым одномоментным кровопусканием из сонной артерии до момента наступления клинической смерти. Реанимация проводились инфузией аутогенной крови с гепарином, проведением наружного массажа сердца и искусственной вентиляции легких до появления самостоятельного дыхания. В период оживления фиксировалось появление сердечной деятельности, первого вдоха и самостоятельного дыхания. Контрольная группа крыс подвергалась аналогичному наркозу без моделирования клинической смерти. Наблюдение за динамикой общего состояния животных проводилось в течение 5 недель после эксперимента.
Используемые методики: абсолютное количество лейкоцитов в 1 мкл капиллярно-венозной крови, полученной из сосудов хвоста, определяли путем подсчета в камере Гаряева; лейкоцитарную формулу вычисляли расчетным способом; лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) рассчитывался по формуле Кальф-Калифа; для характеристики фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов использовался фагоцитоз латекса с вычислением фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса [5]; цитокины определялись с помощью стандартных диагностических наборов иммуноферментного анализа фирмы «Вектор бест». В сыворотке крови исследовано содержание а-ФНО, ИЛ-
* ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет
Росздрава», г. Уфа, ул. Ленина 3
1ß, ИЛ-6. Статобработка результатов велась по непараметрическим критериям Манна - Уитни для независимых выборок.
Результаты исследования. Процент успешной реанимации составил 73,3% (154 крысы). Восстановление сердечной деятельности происходило в сроки 1,3±0,26 мин, а самостоятельного дыхания на 18,15±3,4 мин после начала реанимации. Общая летальность составила 30,4% (64 крысы). В первые 6 часов наблюдения погибло 18 животных (28,1%), к концу первых суток еще 35 крыс (54,7%). Летальность в поздние сроки постреанима-ционного периода составила 15,6 % (10 крыс). В первые часы после оживления животные находились в угнетенном состоянии, отсутствовали произвольные движения. В течение первых 6 часов определялись атония всех мышечных групп, отсутствие болевого рефлекса, нарушение терморегуляции. К 12 часам постреанима-ционного периода брадикардия сменялась тахикардией, животные начинали принимать еду. Отчетливая положительная динамика появлялась с конца первых суток эксперимента. Динамика общего содержания лейкоцитов (таб.1) в постреанимационном периоде носила волнообразный характер. В первые сутки наблюдалось достоверное повышение данного показателя (p=0,0002) на 160%. В последующие сутки произошло уменьшение числа лейкоцитов в периферической крови, но показатели были в основном выше контрольных величин. Достоверно высокие значения наблюдались на 5-е (p=0,0185), 14-е (p=0,0004), 21-е (p=0,0004) и 28-е сутки (p=0,0263). Лейкоцитоз у больных с экстремальными состояниями, имеет перераспределительную природу и обусловлен нейрогуморальными сдвигами [6], вызывающими сильное раздражение костного мозга и выход из него в кровь большого количества резервных клеток.
Таблица 1
Динамика абсолютного содержания лейкоцитов, нейтрофилов и моноцитов в периферической крови крыс после оживления М±т, (х109/л)
Сроки n Общее количество лейкоцитов Абсолютное число нейтрофи- лов Абсолют- ное число моноцитов
К ё ё я 10 14,25±0,35 8,85±0,50 0,70±0,03
1-е сутки 12 23,18±0,80 p=0,0002*** 19,43±1,18 p=0,0005*** 0,65±0,05 p=0,1752
3-е сутки 14 15,50±0,69 p=0,1651 11,1б±0,78 p=0,0343* 0,94±0,14 p=0,0,046*
5-е сутки 10 1б,375±0,70 p=0,0185* 12,2б±0,80 p=0,0052 1,01±0,07 p=0,0015**
7-е сутки 13 14,74±0,б5 p=0,6568 11,68±0,84 p=0,0210* 0,77±0,05 p=0,1490
10-е сутки 15 16,15±0,83 p=0,0685 14,50±0,79 p=0,0005*** 0,68±0,04 p=0,3547
14-е сутки 8 20,25±1,05 p=0,0004*** 16,80±0,62 p=0,0006*** 0,66±0,05 p=0,1659
21-е сутки 7 20,45±0,90 p=0,0004*** 16,01±0,63 p=0,0005*** 0,91±0,05 p=0,0471*
28-е сутки 10 16,29±0,73 p=0,0263* 13,31±0,77 p=0,0011*** 1,03±0,07 p=0,0137*
35-е сутки 12 16,2±1,02 p=0,0620 14,46±0,79 p=0,0008*** О 50 -Н о о о
Достоверность р<0,05-*. достоверность р<0,01-**. достоверность р<0,001-***
Абсолютное содержание нейтрофилов в группе экспериментальных животных во все сроки наблюдения было выше контрольных величин, причем отклонения от показателей нормы достоверны. Абсолютное содержание моноцитов периферической крови в ранние сроки наблюдения (до 3-х суток) снижалось, зато в последующие сутки и, особенно в поздние сроки постреа-нимационного периода (после 21 суток), данный показатель был достоверно выше контрольных величин. Количественные колебания лейкоцитов в периферической крови сопровождались изменением фагоцитарной активности клеток белой крови. Так, фагоцитарное число было достоверно выше на 1-е и 3-и сутки после реанимации (р=0,007 и р=0,003 соответственно), а в последующие сроки шло его угнетение вплоть до 21-х суток. После незначительного роста на 28-е сутки, фагоцитарное число к концу периода наблюдения вновь было ниже контрольных величин. Фагоцитарный индекс во все сроки был достоверно ниже контрольных величин. На 3-и, 14-е и 21-е сутки отмечалось приближение фагоцитарного индекса к контрольным цифрам.
Несмотря на положительную динамику неврологического статуса, в крови реанимированных крыс наблюдались достоверно высокие значения лейкоцитарного индекса интоксикации на 1-е, 3-и, 7-е сутки (таб.2). Тенденция к его повышению отмечалась на 5-е, 28-е и 35-е сутки после оживления. Лишь на 21-е сутки ЛИИ был ниже исходных значений. Интоксикация организма в раннем
являются тканевые макрофаги. Выделение Г-КСФ стимулируется главным образом цитокинами, причем основная роль отводится а-ФНО, ИЛф, а так же эндотоксинам. В нашем исследовании на всем протяжении наблюдались повышенные концентрации а-ФНО, а так же был повышен ЛИИ. В ходе эксперимента обнаружено, что несмотря на рост числа клеток лейкоцитарного ряда, снижалось количество фагоцитарно активных клеток крови, что проявилось спадом фагоцитарного числа. Это может быть связано с продукцией цитокинов. По [8], цитокины, присутствующие в первые 24 часа после геморрагического шока, могут вызывать толерантность к липополисахаридам бактерий и подавлять функцию клеток иммунной системы с помощью супрессоров цитокин сигнальных белков-3. Это говорит о дефектах реактивности фагоцитирующих клеток. В поздние сроки постреанимационного периода лейкоцитарный профиль претерпевал изменения.
Количество моноцитов было достоверно выше контрольных значений в более поздние сроки после оживления. Это может быть связано со снижением активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, с подключением специфических механизмов защиты в ответ на поступление в кровоток тканевых антигенов из тканей, подвергшихся ишемии и реперфузии с образованием иммунных комплексов.
Выводы. Клеточные реакции периферической крови в по-стреанимационном периоде характеризуются системностью. Для ранних сроков после оживления характерен нейтрофильный лейкоцитоз, а для поздних стадий - моноцитоз, что говорит о подключении иммунных механизмов. Фагоцитарные реакции клеток белой крови в постреанимационном периоде претерпевают изменения, достоверно повышаясь в ранние сроки (до 3-х суток) с тенденцией к депрессии в дальнейшем. Изменения фагоцитарной активности крови идут со стойким ростом уровня провоспалительных цитокинов (а-ФНО) на протяжении периода после оживления.
Литература
\.Ананьева С.К. // Анестезиология и реаниматология. 1984. №1. С.44-46.
2.Зильбер А.П. Медицина критических состояний. Петрозаводск: изд-во. 1995.
3.Еникеев Д.А., Нургалеева Е.А., Идрисова Л.Т., Самигуллина А.Ф., Лаптев О.В. // общая реаниматология, 2008.Т.4, №1. С. 21-25.
4.Пермяков Н.К, Яковлев М.Ю., Галанкин В.Н. //Архив патологии. 1989. №5. С. 3-11.
5.Редькин Ю.В., Соколова Т.Ф // Лабораторное Дело.1985.№5. С. 285-289.
6.Шишкин В.Л., Сперанский В.В., Загидуллин Ш.З., Филиппов В.В., Ганцева Х.Х. Алехин Е.К. Принципы и методы выявления иммунопатологических состояний при инфекционных аутоиммунных и аллергических заболеваниях (информационно-методическое письмо). МЗ БАССР. БГМИ. Уфа. 1987.
7.Berghem L., Lahnborg G., Jarstrand
C. // Acta Chir. Scand. Suppl. 1979. Vol. 489. Р. 231.
8.Grutkoski P.S., Chen Y., Chung C.S. [et al.] // J. Trauma. 2004. Vol. 56, N 4. P. 742-747.
9McCallion K., McAuley D.F., Harkin
D.W. [et al.] // J. Trauma. 2003. Vol. 55, N 6. Р. 1089-1094.
10.Giovamballista A., Chisari A.N., Corro L. [et al.] // Neuroimmunomodula-tion.2000. Vol.7, №2. P. 92-98.
CLINICAL DEATH ACTION AFTER ACUTE BLOOD LOSS ON UNSPECIFIC
оживления значительно не возрастали, и ИЛ1р в ряд сроков был несколько ниже контрольных величин.
Таким образом, на протяжении всего периода исследования в периферической крови отмечался лейкоцитоз. В раннем по-стреанимационном периоде он носил нейтрофильный характер. В основе данного явления могут лежать несколько механизмов. С одной стороны, постреанимационное состояние многие исследователи рассматривают с позиции стресс-реакции. Действием стресс-гормонов объясняется повышение содержания лейкоцитов в ранние сроки после оживления. С другой стороны, лейкоцитоз в постреанимационном периоде может быть результатом стимуляции костномозговой пролиферации. Главным индуктором роста миелоидного ростка является колониестимулирующий фактор гранулоцитопоэза (Г-КСФ), основным источником которого
RESISTANCE AND CYTOKINES PRODUCTION IN EXPERIMENT
D.A. ENIKEYEV, E.A. NURGALEYEVA,
N.V. NURGALEYEV, L.V. NAGAYEVA,
M.A. ALEKSANDROV
Bashkir State Medical University, Ufa,
Russia Republic Bashkortostan, Ufa, Lenin's street 3
The purpose of the experimental investigation is to study of phagocyte condition and the level of proinflammation cytokines during 35 days after death blood loss. The experiment was carried out on 210 non-inbreeding white rats weight 190-220 g using anesthesia of ketamin (2 mg/kg). The disorders in system phagocyte ware observed in all period of experiment. It was expressed by increase phagocyte number and by changes phagocyte index. Cell reaction ware developed by neutrophilic leukocytosis in early period and ware developed by monocytosis in late one. Stabile increased content of proinflammation cytokine (TNF-a) was observed during all period experiment and was attendant by changes phagocyte activity in blood.
Key words: death, resuscitation, animal, rats, neurophysiology
Таблица 3
Динамика содержания провоспалительных цитокинов в плазме крови крыс в постреанимационном
периоде (M±m), пг/мл
Кон- троль Сутки постреанимационного периода
1-е 3-и 5-е 7-е 10-е 14-е 21-е 28-е 35-е
RH1ß n 4 5 6 9 4 4 3 5 3 7
Mim 7,27± 0,438 6,23± 0,67 5,98± 0,19 5,97± 0,25 6,175± 0,904 6,075± 0,66 4,88± 0,169 5,42± 0,537 4,26± 0,033 5,09± 0,109
p 0,026* 0,015* 0,02* 0,31* 0,18 0,007** 0,036* 0,002** 0,002**
ИЛ6 n 4 5 5 11 4 4 3 3 4 7
Mim 3,62± 0,025 3,96± 0,19 3,64± 0,14 3,64± 0,11 3,57± 0,05 4,86± 0,23 3,46± 0,08 3,75± 0,37 3,45± 0,02 5,67± 0,21
p 0,176 0,92 0,93 0,47 0,351 0,1 0,7 0,002** 0,87
ФНО- a n 4 4 7 8 4 4 3 6 3 5
Mim 4,12± 0,025 14,25± 1,06,25 6,18± 0,11 6,18± 0,008 8,1± 0,1 12,12± 2,95 5,36± 0,006 6,33± 0,16 8,28± 0,101 9,62± 0,15
p 0,0002 0,07 0,042* 0,0081 0,0001 0,012 * 0,033 * 0,001 ** 0,0001
Достоверность р<0,05-*. достоверность р<0,01-**. достоверность р<0,001-***.
постреанимационном периоде обусловлена образованием и накоплением в органах и тканях во время клинической смерти недоокисленных продуктов, биологически активных веществ, гормонов, а с началом рециркуляции и реоксигенации происходит вымывание их в кровь. В дальнейшем выраженные микро-циркуляторные нарушения, выявляемые даже на 35 сутки после оживления [3], приводят к деструктивным процессам в тканях, всасыванию из кишечника бактериальных токсинов и, тем самым, к поддержанию эндотоксинемии. Хорошо известна способность эндотоксина интенсифицировать функцию костного мозга, и, в частности, активировать миелоцитарный росток, что наряду с лейкоцитозом обусловливает сдвиг лейкоцитарной формулы влево [4].
Таблица 2
Динамика показателей фагоцитоза и лейкоцитарного индекса интоксикации в постреанимационном периоде, М±т
Сроки Лейкоцитарный индекс интоксикации Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс
n Mim n Mim n Mim
Контроль 4 0,064±0,025 6 43,83±1,25 6 7,3i0,31
1-е сутки 8 0,552±0,139 p=0,017* 7 53,43±2,02 p=0,007** 7 3,34±0,09 р=0.009**
3-е сутки 9 0,166±0,039 p=0,045* 7 59,00i1,57 p=0,003** 7 6,58i0,18 р=0.093
5-е сутки 9 0,066±0,025 p=0,640 6 37,67±3,80 p=0,298 6 5,44i0,15 р=0.009**
7-е сутки 8 0,229±0,049 p=0,027* 6 40,33±4,9 p=0,522 6 3,68i0,11 р=0.009
10-е сутки 6 0,336±0,135 p=0,340 6 37,83i4,33 p=0,262 6 3,0i0,26 р=0.009
14-е сутки 6 0,089±0,016 p=0,200 6 41,67i5,74 p=0,5756 6 6,5i0,17 р=0.05*
21-е сутки 6 0,058±0,012 p=0,670 6 47,67i2,72 p=0,128 6 5,26i0,29 р=0.009**
28-е сутки 6 0,192±0,061 p=0,055 6 50,33i6,10 p=0,262 6 3,46i0,25 р=0.009**
35-е сутки 8 0,181±0,041 p=0,062 6 40,17i1,83 p=0,173 6 5^0,34 р=0.009**
Достоверность р<0,05-*. достоверность р<0,01-**
При анализе содержания а-ФНО обнаружено его увеличение во все сроки наблюдения, причем в большинстве случаев повышение носило достоверный характер (таб.3). Другие же провоспалительные цитокины (ИЛ1р, ИЛ6) в динамике после
