CC BY
34
УДК 611.018.1, 635:64
ВЛИЯНИЕ КИСЛОЙ pH СРЕДЫ НА СТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ ЯДЕР И ЯДРЫШЕК КЛЕТОК ПОБЕГОВОЙ И КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПРОРАСТАНИИ
Е.Н. БАРАНОВА, А.А. ГУЛЕВИЧ, Н.В. ЛАВРОВА
(Кафедра хранения и переработки плодов и овощей)
Проведен анализ состояния ядерного компартмента побеговой и корневой меристем озимой пшеницы ТтШсит аеэЫ'иит Ь. при прорастании в условиях низких значений рН. Эффект кислой рН среды на структурную организацию ядер и я дрышек клеток побеговой и корневой меристем пшеницы при прорастании выражался в уменьшении числа митозов и их нарушении, а также ядрышек, имеющих протуберанцы, нарушении компактизации/декомпактизации хроматина и появлении в верхушечной меристеме ядерных телец, содержащих рибонуклеопротеиды.
Ключевые слова: кислотность, пшеница, меристема, ядерные тельца, ядрышки, прорастание, экспрессия генов, хроматин.
Верхушечная (побеговая) и корневая меристематические ткани представляют собой недифференцированную растительную ткань, клетки которой способны многократно де-литьс и предоставл ть материал дл образования различных специализированных тканей. В меристематиче-ской ткани происход т как обычные дл дел щихс клеток процессы, свя занные с клеточным циклом, так и специфические процессы, свя занные с реакцией на вызовы окружающей среды, которые могут, в конечном счете, приводить даже к наследуемым эпигенетическим изменени м адаптивного характера [1, 2], свя занным с метилированием, ацетилированием гистонов и другими, регулирующими экспрессию механизмами [3].
Одной из реакций клеток на действие абиотических факторов может быть замедление или полное блокирование делений путем задержки клеточного цикла на определенной
стадии, вероятнее всего профазе. Следствием этого является накопление клеток в С2 фазе, а также нарушение митоза — аномальный митоз, изменение митотического индекса и другие нарушения . Другим проявлением должно быть изменение экспрессии генов, вызванных сигнальным ответом, свя занным с генетически детерминированными ответами на воздействия . И, наконец, нарушения, про вл ющиес в эпигенетических
изменениях хроматина, структурных или регул торных компонентах дра. В верхушечной меристеме могут про-я вляться также нарушения, связанные с блокированием ЕЬС [2] и вызывающие изменения, индуцирующие переход к генеративному развитию.
В литературе описаны изменени ультраструктуры дерного компарт-мента и дрышек под действием
абиотических воздействий. Так, описано увеличение количества необычных ядрышек «амебоидной» формы в
апикальной меристеме побега пшеницы при яровизации. Также этот тип ядрышек был описан в побего-вом апексе ровой пшеницы на ранних этапах замачивания [4, 5] и при прорастании в условиях щелочного рН, [6]. Методом световой микроскопии подобные структуры были вы в-лены при изучении преобразований дрышка в процессе клеточного цикла [7]. Выя вление ультраструктурных параметров в дерных компартмен-тах апикальных меристем побега и корня на фоне действия факторов, имитирующих природные абиотические стрессоры, в частности кислой рН, ограничивающих рост и урожайность пшеницы, в частности в Нечерноземной зоне РФ, позволит ответить на многие вопросы, свя занные с отличи ми дер клеток этих двух активно пролиферирующих зон и происход щими в них преобразовани -ми. Воздействие кислого рН с учетом влия ния таких токсичных ионов, как А1 (при их низких значениях) на различные физиологические и биохимические параметры, изучены недостаточно и наиболее тщательно проанализированы в работе [6]. Неоптимальные значения рН предположительно могут индуцировать р д сигнальных путей, аналогичных проявляющимся при холодовом стрессе (токсическом и оксидативным), однако, вероятнее всего, они не явля ются характерными дл многих абиотических стрессоров, таких как холод, засуха, засоление [9].
Методика исследований
Зерновки озимой пшеницы ТтШсит аевітит Ь. проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри. Дл замачивани и про-ращивани использовали растворы следующего состава: 0,1 М натрий-калиевый фосфатный буфер рН 6,0 и 3,0, вода. Температура проращивания составляла 18-22°С. На 3-и сут. часть растений перемещали с рН 3,0 в чашки с буфером рН 6,0. Отпре-
парированные под световым микроскопом апексы побега и кончики корня фиксировали через 4 сут. после замачивания 2,5%-м глутаровым альдегидом на фосфатном буфере с добавлением сахарозы (рН 7,2) 4 ч с последующей дофиксацией 1% 0б04 в течение 2 ч, заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, фотографировали под электронным микроскопом Хитачи Н-500 (Япония).
Результаты и их обсуждение
Клетки апикальных меристем побега (рис. 1 а, в, д, ж, и) и корня (рис. 2 а, в, д, ж, и) проростков, прораставших в услови х оптимальной рН 6,0 среды, имеют типичное для меристематической ткани строение. Наблюдаетс много дел щихс клеток на различных стади х митотического цикла. Митотический индекс в клетках апикальной меристемы корня — 9,7, в клетках верхушечной меристемы — 8,8. Интерфазные и про-фазные клетки имеют крупное дро с хорошо развитым ядрышком, расположенное в центре клетки. В цитоплазме содержится множество рибосом как в свободном состоянии, так и прикрепленных к шероховатому эн-доплазматическому ретикулюму. Наблюдается также незначительное количество пропластид и митохондрий (см. рис. 1 и; рис. 2 ж, и). Крупные округлые дра занимают около половины объема клеток (см. рис. 1 д; рис. 2 д). Диспергированный хроматин, глыбки и тяжи конденсированного хроматина равномерно распределены по всему объему дра. В некоторых драх встречаютс участки локальной декондесации — микро-пуффы, вблизи которых отмечают-с скоплени интерхроматиновых
гранул в виде кластеров. Ядрышки имеют типичное строение и содержат фрагменты грануля рного, рыхлого и плотного фибрилл рного компонен-
та. В единичных клетках латеральной зоны побеговой меристемы и в ряде клеток корневого апекса можно отметить ядрышковый организатор и примыкающий к нему приядрышковый хроматин. Ядерные тельца и светлые участки ядрышек, так называемые ядрышковые вакуоли, встречаются только в единичных клетках периферической зоны меристемы и в ря де начавших дифференциацию клеток, примыкающих к меристематической зоне. «Амебоидные» ядрышки с вытянутыми, разветвляющимися отростками (протуберанцами) отмеча-ютс в периферической зоне меристем и в примыкающих молодых тка-ня х соответственно, 1~2% в корне и 3-5% в меристематической зоне побега (рис. 1 в; рис. 2 в).
В корневой меристеме растений пшеницы, проросших при рН 3,0 (рис. 2 б, г, е, з, к), отмечается замедление утилизации крахмала в пропластидах (см. рис. 2 к). Наблюдаетс множество клеток на различных стадиях митотического цикла, однако митотический индекс, указывающий на количество делений, снижается почти в 1,5 раза — до 5,0. На срезах отмечаютс лишь единичные случаи дел щихс клеток. Наблюдающиес клетки имеют сформированные конденсированные хромосомы, расположенные в упорядоченной форме в светлой неструктурированной ну-клеоплазме, с сохранением связывающих их микротрубочек веретена деления. Ядерный компартмент интерфазных и профазных клеток также имеет значительные отличия от нормы. Крупные ядрышки имеют типичную округлую форму, содержат выраженные фибриллярные центры и развитую центральную светлую область (рис. 2 г, е). У хроматина выражено резкое деление на светлую и темные зоны с высокой степенью конденсации неконститутивного гетерохроматина (рис. 2 е). Конденсированный хроматин представлен в виде от-
дельных округлых, реже продолговатых и разветвленных, глыбок с более плотным краем и несколько разрыхленным центром. Можно наблюдать четко выраженное отделение хроматина от дрышка в форме светлого ареола. Незначительная часть глыбок конденсированного хроматина ассоциирована с ядерной оболочкой, но их большее число равномерно размещено в нуклеоплазме. В р де клеток наблюдаетс наличие конденсированного хроматина, подобного собранным хромосомам, однако ядрышек с сохранением фрагментов амебоидного ядрышка не наблюдается . Можно отметить более темноокрашенные протуберанцы неизвестной природы у ряда ядрышек в ядрах, имеющих значительную зону, подобно ареолу, отделяющую ядрышко от глыбок конденсированного хроматина. Возможно, это связано с видоизменения ми описанных ранее [6] протуберанцев дрышкового компартмента при данном воздействии (см. рис. 2 к).
Апикальная меристема побега проростков пшеницы, проросших при рН 3,0, также содержит незначительное число дел щихс клеток (митотический индекс 5,6), и основна часть клеток находится предположительно на стадии ранней и средней телофа-зы. Структура дер и их форма значительно отличаютс от нормы (рис. 1 а, в, д, л). Хроматин имеет участки диспергированного хроматина, а также тяжи и разветвленную сеть конденсированных участков с чеистой структурой. В различных участках некоторых дер наблюдаетс большое число дерных телец неизвестной
этиологии, представляющих собой более темные, чем конденсированный хроматин, структурированные обра-зовани различного размера неправильной шаровидной формы, ассоциированных с одной или двух сторон с участками конденсированного хроматина, окруженные светлым ореолом (см. рис. 1 л). Ря дом с этими тель-
Рис. 1. Ультраструктура ядер клеток верхушечной меристемы пшеницы при прорастании в условиях оптимального (а, в, д) и кислого (б, г, е, ж, з, и, к, л) рН
Рис. 2. Ультраструктура ядер клеток корневой меристемы пшеницы при прорастании в условиях оптимального (а, в, д) и кислого (б, г, е, ж, з, и, к) рН
цами интерхроматиновые гранулы и микропуффы отсутствуют, ядрышки имеют тонкую, светлую окантовку, отделя ющую их от приядрышкового хроматина. Количество «амебоидных» ядрышек с протуберанцами незначительно увеличено по сравнению с контролем (рис. 1 г).
Причинами различного ответа
ядерного компартмента побеговой и корневой меристем могут быть как различи в доступности их дл действующего стрессового фактора — относительно пр мое воздействие на корневую меристему, и опосредованное, связанное с защитными свойствами проводящих и окружающих тканей, влия ющих на апекс побега, так и генетически запрограммированные различи в ответах на воздей-стви стрессовых факторов.
При детальном рассмотрении амебоидных ядрышек, обладающих протуберанцами, можно предположить, что это я вление может быть вызвано замедлением процесса сборки гранул рного компонента дрышка после прохождения делений в интерфазных и профазных клетках. В литературе встречаетс ограниченное количество примеров, подтверждающих наличие незначительных протуберанцев ядрышка. Методом конфокальной микроскопии удалось засн ть разветвленные дрышки фолликул рной клетки я ичника бабочки [11] и клеток млекопитающих [7].
Изменение количества таких ядрышек и разветвленности сети протуберанцев свидетельствует о чувствительности процесса их формировани в присутствии стресса и можно предположить повреждение какой-либо св занной с этим процессом структуры в момент нахождения ядерного материала без оболочки в процессе митотического деления. Это может быть вызвано изменением конформации задействованных при этих процессах белков либо нарушени ми процессов ацетилирования, метили-
рования или фосфорилирования, в т.ч. на этапе отсутствия ядерной мембраны.
Этиология обнаруженных в побего-вой меристеме дерных телец при прорастании в услови х кислой рН среды на данный момент не установлена. Однако на основании существующей в настоящее время классификации [12] и при визуальном сравнении ультраструктуры можно предположить, что наблюдаемые тела представл ют собой образования, связанные с процессингом, более вероятно, в свя зи с его нарушением. Эти образовани от-личаютс от телец Кахал (имеющих кольцевую структуру) или скоплений стрессовых белков (образующих гомогенные образовани ), так как ассоциированы с конденсированным хроматином и, вероятно, не могут быть отнесены к микроя дрышкам, поскольку структура их не содержит аналогичного ядрышковому выраженного гранул рного или фибрилл рного компонента. Возможно, этот вид телец вл етс необычной формой видоизмененных микропуффов.
Нарушения клеточного цикла характерны дл многих стрессовых воздействий и вл ютс типичной реакцией растительных клеток на действие солей [13, 14], обезвоживание [15], однако при данном воздействии они описаны впервые. Главные критические точки цикла делени эукариотической клетки наход тс в переходах G1^S и G2^M. Прохождение через эти границы катализируетс циклин-зависимыми киназами (CDKs), активность которых регулируетс событи -ми фосфорилировани и дефосфори-лирования, и благодаря связыванию с каталитической субъединицей — циклином. За последнее деся тилетие у растений было выя влено множество ключевых регул торов клеточного цикла, включая CDKs, циклины, ингибиторы CDKs и т.п. [15].
Нарушени процессов конденса-
ции / деконденсации хромосом, вы-
званное воздействием низкого значения рН, может быть частично свя за-но с по влением дерных телец и с изменением структуры ядрышка, если предположить, что при этом воздействии происходит не только нарушение процессинга рибосомальной РНК, но также процессов ацетилирования, метилировани или фосфорилирова-ни нуклеиновых кислот и белков.
Выводы (заключение)
С учетом обнаруженных изменений под действием кислой рН среды впервые возможно: 1) идентифицировать различия в реакции ядер клеток корневой и верхушечной апикальных меристем растени ; 2) идентифици-
ровать протуберанцы дрышек в корневой меристеме и прилегающих формирующихся тканях; 3) подтвердить
изменение количества и разветвлен-ности «амебоидных[ дрышек в ответ на действие абиотического стресса; 4) установить специфические изменени в ультраструктуре ядра, выражающиеся в изменении структуры конденсированного хроматина, образовании ядерных телец, ассоциированных с участками конденсированного хроматина в верхушечной меристеме; 5) отметить нарушения митотического цикла, вызывающие по вление аномальных митозов и блокировку клеток в одной из фаз клеточного цикла, предположительно телофазе; в верхушечной меристеме и на разных стади х профазы; в анафазе в корневой меристеме, вызванные, вероятно, повреждениями цитоскелета, в ряде случаев, необратимыми.
Работа частично профинансирована грантом РФФИ 07-08-00610-а и программой РАСХН 04.03.03.01.
Библиографический список
1. Аветисова Л.В., Кадыков В.А. Ультраструктура апикальной меристемы проростков пшеницы, развивающихся при низких положительных температурах // Цитология, 1985. Т. 27. С. 28-32.
2. Аветисова Л.В., Шапошников Я.Д., Кадыков В.А. Изменения ультраструктуры ядер в клетках апикальной меристемы пшеницы при прорастании // Онтогенез, 1988. Т. 19. № 2. С. 181-190.
3. Атлас по биологии клетки. М.: Мир, 1978.
4. Баранова Е.Н.,Гулевич А.А. Эффект щелочного рН на структурную организацию ядер и ядрышек клеток побеговой и корневой меристемы пшеницы // Доклады РАСХН, 2009. № 1 С. 16-18.
5. Баранова Е.Н.,Гулевич А.А. Проблемы и перспективы генно-инженерного подхода в решении вопросов устойчивости растений к засолению // С.-х. биологи . Сер. Биология растений, 2006. N 1. С. 39-56.
6. Климашевский Э.Л. Генетический аспект минерального питания растений. М.: Агропромиздат, 1991.
7. de Castro R.D., van Lammeren A.A.M., Groot S.P.C., Bino R.J., Hilhorst H.W.M. Cell division and subsequent radicle protrusion in tomato seeds are inhibited by osmotic stress but DNA synthesis and formation of microtubular cytoskeleton are not // Plant Physiol., 2000. Vol. 122. P. 327-335.
8. Gautier P., Robert-Nicoud M., Guilly M.-N., Hernandez-Verdun D. Relocation of nucleolar proteins around chromosomes at mitosis. A study by confocal laser scanning microscopy // J. Cell Sci., 1992. Vol. 102. P. 729-737.
9. Finnegan J.E., Kovac K.A., Jaligot E., Sheldon C.C., Peacock J.W., Dennis E.S. The downregulation of Flowering Locus C expression in plants with low levels of DNA methylation and by vernalization occurs by distinct mechanisms // Plant J., 2005. Vol. 44. P. 420-432.
10. He Y., Michaels S.D., Amasino R.M. Regulation of flowering time by histone acetylation in Arabidopsis // Science, 2003. Vol. 302. P. 1751-1754.
11. Sheldon C.C., Hills M.J., Lister C., Dean C., Dennis E.S., Peacock W.J. Resetting of Flowering Locus C expression after epigenetic repression by vernalization // PNAS, 2008. Vol. 105. Р. 2214-2219.
12. Show P.J., Broun J.W.S. Plant nuclear bodies // Curr. Opin. in Plant Biol., 2004. Vol. 7. P. 714-720.
13. Schuppler U., He P.-H., John P.C.L., Munns R.. Effect of water stress on cell division and Cdc2-like cell-cycle kinase activity in wheat leaf // Plant Physiol., 1998. Vol. 117. P. 667-678.
14. Veylder L., Van Montagu M., Inze D. Cyclin-dependent kinases and cell division in plants- the nexus // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 509-521.
15. West G., Inze D., Beemster G.T.S. Cell cycle modulation in the response of
the primary root of Arabidopsis to salt stress // Plant Physiol., 2004. Vol. 135.
P. 1050-1058.
Рецензент — д. с.-х. н. И.В. Кобозев
SUMMARY
Nuclear compartment condition analysis, in both spear and root meristem of winter wheat Triticum aestivum L., when germinating under low ph-range conditions, has been carried out. The effect of acidic ph medium on structural arrangement of both nuclei and nucleoli in cells of spear and root meristem, when germination occurs, is expressed by a decrease in the number of mitoses, their disturbance, nucleoli having protuberances (prominences), chromatin compactness, failure, and emergence of nuclear corpuscles having ribonucleoproteins in the apical meristem.
Key words: acidity, wheat, formative tissue (meristem), nuclear corpuscles, germination, genes’ expression, chromatin.
Баранова Екатерина Николаевна — к. б. н., Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН. Эл. почта: greenpro2007@rambler.ru
Гулевич Александр Анатольевич — Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Лаврова Наталия Владимировна — д. б. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-10-33. Эл. почта: Gaplo@rambler.ru
