CC BY
35
УДК 577.21+602.6
УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТОК ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТОМАТА С ГЕНОМ Ее-БОБ ПРИ ЗАСОЛЕНИИ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
Е.Н. БАРАНОВА1, А.А. ГУЛЕВИЧ2, А.Н. МАЙСУРЯН2, Н.В. ЛАВРОВА1
(х Кафедра хранения и переработки продукции растениеводства РГАУ - МСХА имени КА. Тимиря зева; 2 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозя йственной биотехнологии)
Проведено сравнительное ультраструктурнеє исследование независимых трансформантов томата, трансгенных по гену Fe-SOD. Отмечены существенные различия в развитости и сохранности ультраструктуры клеток мезофилла: хло-ропластов, ядер, я дрышек между трансгенными и нетрансгенными растения -ми томата при действии солевого стресса, свидетельствующие об увеличении устойчивости в результате трансгеноза.
Ключевые слова: засоление питательной среды, трансгенные растения, in vitro.
Засоление я вля ется главным сдерживающим фактором предельной производительности сельского хозяйства на 20% посевной площади и половины орошаемых земель во всем мире [14]. Избыточная соленость является причиной торможения роста и развития, угнетения процессов фотосинтеза, дыхания и синтеза белков у культурных растений, которые чувствительны к почвенному засолению [8, 11]. Одним из важных последствий солевого стресса у растений вл етс чрезмерна генерация активных форм кислорода, таких как супероксид анион (О2-), перекиси водорода (Н2О2) и гидроксильных радикалов (ОН-), в частности в хлоропластах и митохондрия х [10]. Все эти активные виды кислорода повреждают различные внутренние структуры клетки и вступают в биохимические реакции [6, 7]. В растительной клетке
нейтрализация ROS осуществляется рядом ферментов: пероксидазой, супероксиддисмутазой, аскорбатпе-роксидазой, глутатионредуктазой и др. Антиокислительную активность внутри клетки можно значительно повысить, внедрив в геном реципи-ентного растения ген фермента су-пероксиддисмутазы [1, 13], под контролем промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии во всех органах и тканя х.
Для внедрения этого гена в рас-тени томата мы использовали метод генетической трансформации посредством Agrobacterium tumefaciens, которая содержала экспрессионный вектор, придающий устойчивость к повреждающему действию окисления (ген Fe-содержащей супероксиддис-мутазы из Arabidopsis thaliana) [4]. Ранее было показано, что и фотосинтезирующие (хлоропласты) и нефото-
синтезирующие (амило- и этиопла-сты) пластиды чувствительны к солевому и осмотическому воздействию, что сказывается на их ультраструк-турной организации у люцерны [2], томата [3] и табака [12]. Для защиты процессов фотосинтеза, осуществля -ющихс в хлоропластах, данный ген обладал сигнальной последовательностью, направля ющей белок в хлоропласт. В экспрессионной конструкции ген Fe-SOD находился под контролем конститутивного промотора CaMV 35S и терминатора NOS. В задачу нашей работы входило изучение защитных эффектов внедрени гена
F e-зависимой супероксиддисмутазы в растения томата, подвергнутые солевому стрессу. Мы изучали ультраструктурную организацию пластид и общую сохранность цитоплазматических структур и дер.
Методика
Дл оценки эффективности защиты, индуцированной Fe-SOD, рас-тени подвергали солевому стрессу посредством воздействия Na2SO4 в концентрации, которая сильно ингибировала развитие проростков у не-трансгенных растений.
Использовали трансгенные растения томата Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) сорта Белый налив, полученные нами ранее [1]. Дл испытани отобранных трансгенных растений клоны помещали в пробирки с жидкой средой MS и полоской фильтровальной бумаги (для фиксации эксплантов) и выращивали в течение 2 нед., после чего растения помещали в пробирки со средой MS, содержащей 77,5 мМ Na2SO4. При этой концентрации в предварительном эксперименте происходило сильное ингибирование прорастани сем н. Дл цитологических исследований трансформантов с Fe-SOD трансгенные и нетрансгенные растения томата, предварительно помещенные в условия жидкой среды МС, перенесли в
условия жидкой среды МБ с 77,5 мМ Ма2БО4 (концентрация, ингибирую-ща развитие проростков).
На 5-е сутки дл электронной микроскопии фрагменты корней и листьев (1-2 мм) фиксировали в течение 4 ч при 22°С в 2%-м растворе глута-ральдегида на 0,1 М фосфатном буфере с добавлением сахарозы (15 мг/мл, pH 7,2), постфиксацию в 1%-м 0б04 на
0,1 М фосфатном буфере проводили в течение 2 ч, дегидратацию и заключение материала в смолу — по стандартной методике. Ультратонкие срезы контрастировали и просматривали на ТЕМ Н-300 (Хитачи, Япония).
Результаты и их обсуждение
Получено 15 зеленых растений томата, устойчивых к канамицину. По данным ПЦР-анализа, в результате трансформации у 9 растений, прошедших селекцию на канамицине, произошла интеграци гена в геном растений [1]. При стрессе ультраструктура клеток корневого чехлика, меристемы и зоны растяжения значительно различалась у трансгенных и нетрансгенных растений. Если в нормальных услови х существенных различий между контрольным растением (рис. 1 А, Б) и растением с Ёе-БОБ не наблюдали, то в присутствии Ма2БО4 у трансгенного растени сохран лась неповрежденная ультраструктура
клеток меристемы (рис. 1 Д, Е). Так, при воздействии они сохран ли ненарушенную ультраструктурную организацию цитоплазмы, митохондрий, пластид, аппарата Гольджи и я дер-ного компартмента во всех типах ткани (чехлике, меристеме, паренхиме зоны растяжения). Некоторые наблюдаемые изменени не обладали повреждающим характером и относились к формированию центральной вакуоли, ультраструктуры ядер и ядрышек, появлению сопоставимого по размеру с крахмальным зерном пластидного включени осмиофиль-ного характера, предположительно
липидной природы (см. рис 1 Д, Е). В клетках зоны чехлика и зоны растяжения можно выделить некоторые отличи от контрол и клеток мери-стематической зоны, свидетельствующие о большей их чувствительно-
сти к повреждающему воздействию, однако сохран лась типична целостность мембран и ультраструктура. Не-трансгенные растения, подвергшиеся стрессу, имели сильные повреждения необратимого характера (рис. 1 В, Г).
Рис. 1. Ультраструктура клеток меристемы корня томата. Нетрансгенные растения (А, Б, В, Г), трансгенные растения с РеЭСЮ (Д, Г), контроль МЭ (А, Б), после действия Ыа2ЗС4 (В, Г, Д, Е)
У нетрансгенных растений в этих ткан х происходили необратимые нарушения целостности мембран, деградация митохондрий, пластид и ядер.
Ультраструктура дер в листь х контрольных и трансгенных растений при воздействии Ма2БО4 также значительно различалась. В отличие от повреждений, отмеченных в корне, нуклеоплазма дер нетрансгенных
растений приобретала по сравнению с контролем (рис. 2 А) более плотную структуру, также значительно (в 2 раза и более) увеличивалс размер ядрышек и количество расположенного по периферии гранул рного материала (рис. 2 В). Ядра трансгенных растений имели более светлую нукле-оплазму, близкие к норме размеры ядрышка, однако структура периферического примембранного хроматина соответствовала структуре глыбок в контрольном растении при действии стресса. Подобные изменени могут свидетельствовать о том, что синтез рРНК, который в норме индуцируется стрессом и, возможно, связан с ролью активных форм кислорода в передаче сигнала у трансгенных растений в листь х, при данном воздействии не индуцируетс . Веро тно, это св зано с недостаточной интенсивностью сигнала либо с уменьшением повреждения, так как листья подвергаютс негативному действию лишь опосредованно. Присутствие глыбок периферического хроматина, аналогичных тем, которые можно наблюдать в контрольном растении при стрессе, свидетельствует о наличии ответа, однако не позволяет судить о его специфичности или не-специфичности, а лишь дает возможность предполагать изменени в синтезе или процессинге некоторой части мРНК. Этот результат особенно интересен тем, что может объяснить отсутствие усилени солетолерантности у трансгенных растений, отмеченное в ряде работ. Следует отметить, что структура дер у двух трансгенных
растений, как и при исследовании их корней, имела некоторые отличия от нетрансгенных, в частности, в плотности нуклеоплазмы. Другим важным результатом вл етс изменение структурной организации пластид у трансгенных и нетрансгенных растений (рис 2 Б, Г, Е, З). Интересно отметить несколько важных эффектов. У нетрансгенных растений в ответ на воздействие Ма2БО4 наблюдалось увеличение количества крахмальных зерен, разрушение целостности мембран, образование пузырьков на поверхности с последующим образованием внутренних двойных мембран и отпочковыванием округлых пузырьков (темные стрелки), уменьшение количества пластоглобул (см. рис. 2 В). Также интересно увеличение количества характерных дл многих растений семейства Solanaceae образований, идентифицируемых как перок-сисомы, с внутренними кристаллическими структурами (светлые стрелки, рис. 2 В). Следует отметить, что различи в ультраструктуре пластид между двумя трансгенными растени-ми очень значительны. Кроме того, наблюдаютс различи в количестве крахмальных зерен и уровне развитости тилакоидной системы, однако общим вл етс сохранение пласто-глобул (см. рис 2 Е, З), которые имеют меньшие размеры, чем в контроле (см. рис. 2 Б). Интересно показанное на рисунке 2 З соединение хлоропласта с содержащей кристалл структурой через специализированный, состоящий из нескольких изогнутых ламел-ля рных структур, мостик. Хотя данная картина является уникальной, в пластидах этого образца на одном из концов часто можно было наблюдать подобные ламелл рные образовани .
Анализ нескольких трансгенных растений показал, что структура их ядер, ядрышек и пластид несколько различалась под действием стресса. Мы предполагаем, что это может быть св зано с особенност ми экс-
Б
ГиТУп Т гШУТТт
В
V
г ч, ,л ь—н
Рис. 2. Ультраструктура клеток листа томата. Нетрансгенные растения (А, Б, В, Г), трансгенные растения с РеЭСЮ 1 (Д, Г), 2(Ж, З), контроль МЭ (А, Б), после действия №28С4 (В, Г, Д, Е, Ж, З)
прессии или интеграции гена. Вли - рировано в работах Строгонова и др.
ние засоления на структуру листа [5], однако сложности в методиче-
томатов, выражавшееся в изменении ском исполнении и ранее и сейчас ча-
структуры листа, было продемонст- сто приводят к публикации разного
рода артефактов, свидетельствующих о необратимых изменени х пластид и митохондрий, но в некоторых работах все же приводя тся данные о влиянии засоления на размер, форму, количество крахмальных зерен, пластоглобул в пластидах [12]. В ря -де исследований повтор ютс данные Строгонова, демонстрируются процессы деградации в ткан х мезофилла, вызванные непосредственным влиянием соли (МаС1) на ткани листа, сформированные в ее отсутствие, т.е. неспособность адаптироватьс к новым услови м посредством перестройки тканей сосудистого пучка [9]. В нашей работе растения подвергались 7-дневному стрессу, вызывавшему у нетрансгенных растений такие же необратимые изменения, трансгенные
же растения выдержали испытания и сохранили ультраструктуру клеток неповрежденной.
Заключение
Впервые удалось идентифицировать и охарактеризовать на уровне изменения ультраструктуры клеток защитную функцию растения, появившуюся в результате переноса гена. Выявлена перспективность данного гена для защиты растений, по крайней мере, от воздей-стви солевого стресса определенной интенсивности. Дальнейшие испытани позволят получить информацию об эффективности ее использовани против других абиотических стрессов.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (07-08-00610-а).
Библиографический список
1. Бараненко В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений // Цитологи я, 2006. Т.48., №6. С. 465-474.
2. Баранова Е.Н., Гулевич А.А., Поляков В.Ю. Эффекты NaCl, Na2S04 и ман-нита на утилизацию запасного крахмала и формирование пластид в семядолях и корн ях проростков люцерны // Физиология растений, 2007. Т. 54. № 1. С. 59-67.
3. Баранова Е.Н., Гулевич А.А., Лаврова Н.В. Цитоплазматическая характеристика устойчивости мобилизации запасных веществ при прорастании семян томата в условиях засоления среды // Известия ТСХА, 2009. Вып. 3. C. 61-64.
4. Серенко Е.К., Овчинникова В.Н., Гулевич А.А., Куренина Л.В., Майсурян А.Н., Баранова Е.Н., Харченко П.Н. Получение трансгенных растений томата Solanum lycopersicum с геном Fe-зависимой супероксиддисмутазы // Доклады РАСХН, 2009, № 4. С. 12-14.
5. Строгонов Б.П., Кабанов В.В., Шевякова Л.П., и др. Структура и функции клеток растений при засолении, 1970. М.: Наука.
6. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.K., Bohnert H.J. Plant cellular and molecular responses to high salinity // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 2000. Vol. 51. P. 463-499.
7. Inze D.,Van Montagu M. Oxidative stress in plants // Curr. Opin. Biotech. 1995. Vol. 6. P. 153-158.
8. Meloni D.A., Oliva V.F., Martines C.A., Cambraia J. Photosynthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase and glutatione reductase in cotton under salt stress // Environ. Exp. Bot., 2003. Vol. 49. P. 69-76.
9. Miyake H., Mitsuya S., Rahman M.S. Ultrastructural effects of salinity stress in higher plants // Abiotic stress tolerance in plants, 2006. P. 215-226.
10. MittlerR., Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci., 2002. Vol. 7. P. 405-410.
11. Pal M., Singh D.K., Rao L.S., Singh K.P. Photosynthetic characteristics and activity of antioxidant enzymes in salinity tolerant and sensitive rise cultivars //
Physiol. Plant., 2004., Vol. 87. P. 227-231.
12. Sam O., Ramirez C., Coronado M.J., Testillano P.S., Risueno M.C. Changes in tomato leaves induced by NaCl stress: leaf organization and cell ultrastructure // Biol. Plant.,2003. Vol. 47. P. 361-366.
13. Van Camp W., Bowler C., Villaroel R., Tsang E.W., Van Montagu M., Inze D. Characterization of iron superoxide dismutase cDNAs from plants obtained by genetic complementation in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1990. Vol. 88. P. 9903-9907.
14. Zhu J.K. Plant salt tolerance // Trends Plant Sci., 2001. Vol. 6. P. 66-77.
Рецензент — д. б. н. Л.Н. Хрусталева
SUMMARY
Comparative ultra-structural research into independent tomato transformants, transgenic by Fe-SOD gene, has been done. Considerable differences, indicative of a rise in stability, resulted from transgenesis, expressed by both maturity and integrity of mesophyll cells’ ultra-structure: chloroplasts, nuclei, nucleoluses between both transgenic and non-transgenic tomato plants under the influence of saline stress, have been registered in the article.
Key words: salinization of nutrient medium, transgenic plants, in vitro.
Баранова Екатерина Николаевна — к. б. н. Эл. почта: [email protected] Гулевич Александр Анатольевич — асп. каф. хранения и переработки продукции растениеводства РГАУ — МСХА имени К.А. Тимирязева.
Майсурян Александр Николаевич — д. б. н.
Лаврова Наталия Владимировна — д. б. н. Тел. (499) 977-10-33.
